Tách mRNA từ mô động vật RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng hợp trong nhân của tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau. Vì vậy mRNA được dùng làm nguyên liệu xây dựng ngân hàng cDNA, ngân hàng gen không chứa các đoạn gen không mang mã (intron).
Trang 1Tách mRNA từ mô động vật
GVHD: Đặng Đức Long
SVTH:
1.Nguyễn Văn Lạc
2 Phạm Minh Lân
3 Bùi Đình Linh
4 Nguyễn Bá Lộc
5 Phạm Thị Nhi
6 Hoàng Thị Nhung
7 Phan Thị Nhung
8 Đỗ Nguyễn Khánh Phương
Trang 2Tách mRNA từ mô động vật
Nguyên lý
Quy trình chung
Các bước tiến hành
4
1
2
3
Trang 3Nguyên lý
• RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng hợp trong nhân của tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau Vì vậy mRNA được dùng làm nguyên liệu xây dựng ngân hàng cDNA.
• Khoảng 90-99% tổng số RNA tế bào là rRNA (80 - 85%), tRNA(15 - 20%) Chúng có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng bằng điện di, ly tâm
• Tuy nhiên mRNA chiếm khoảng 1 - 5% tổng số RNA tế bào Kích thước và trình tự của loại này vô cùng đa dạng nên không thể tách bằng phương pháp trên.
Trang 4Nguyên lý
mRNA có một đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi polyA (có thể lên đến 100A).Người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng cách dựa vào cấu trúc trên và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, sử dụng sắc ký ái lực trên cột oligodT – cellulose hay các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt, mRNA sẽ được thu nhận qua ly tâm hoặc sử dụng nam châm.
Các loại RNA đều là các phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase) Hoạt tính của các enzyme này rất cao và bền vững Nó lại có mặt khắp nơi vì vậy cần tuyệt đối vô trùng
và cẩn thận, tránh tiếp xúc với dụng cụ và hóa chất bằng tay trần.
Trang 5Quy trình chung
Mẫu (mô động vật)
Loại bỏ tạp chất Phá vỡ màng tế bào
Thu RNA tổng số
Tách mRNA
Trang 6Lấy mẫu và bảo quản
• Muốn thu được toàn bộ các mNRA thì cần tiến hành lấy mẫu ở tất cả các mô trên cơ thể động vật, chủ yếu là mô cơ, phổi, não, khí quản, ruột
• Ngay sau khi lấy cần chuyển mẫu vào nitơ lỏng và tiến hành thí nghiệm ngay Nếu không thì phải bảo quản và lưu trữ mẫu trong nito lỏng hay RNAlater
• RNAlater bảo vệ các mô từ hoạt động RNase cho đến khi nó có thể được đồng nhất trong Trizol, vì vậy không phải nhất thiết để giữ tất cả mọi thứ đông lạnh trong nitơ lỏng
Trang 7Xử lý mẫu với Trizol
• Thuốc thử Trizol đã có sẵn là hỗn hợp của
phenol, guanidin isothiocyanate, thuốc
nhuộm đỏ và các thành phần khác của nó có
thể được sử dụng để cô lập RNA trong 1 giờ
với một bước duy nhất DNA và protein có
thể được phục hồi với kết tủa tuần tự từ pha
hữu cơ
Khử trùng dụng cụ nghiền
Chuyển mẫu qua dụng cụ nghiền với tỷ lệ
100mg mẫu: 1ml Trizol
Đặt dụng cụ nghiền lên hộp xốp đựng nước đá
Nghiền cho đến khi mẫu nhuyễn mịn
Chuyển mẫu qua eppendorf, ủ 10 phút
Trang 8Xử lý mẫu với Trizol
Khử trùng dụng cụ nghiền
Chuyển mẫu qua dụng cụ nghiền
Đặt dụng cụ nghiền lên hộp xốp đựng nước đá
Nghiền cho đến khi mẫu nhuyễn mịn
Chuyển mẫu qua eppendorf, ủ 10 phút
• Ngâm rửa trong dung dịch chứa nước DEPC 0,1%
• DEPC (Diethylpyrocarbonat) có tác dụng loại
bỏ RNase
• Sau đó dụng cụ được khử trùng 20 phút ở nhiệt độ 1200C và áp suất cao.
Trang 9Thu RNA tổng số
•Bổ sung 0,2 ml chloroform/1ml Trizol ban đầu vào mỗi ống chloroform có tác dụng làm biền tính protein và loại phenol ra khỏi phần dung dịch chứa RNA.
•Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15-20 giây, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 đến 3 phút.
•Sau đó ly tâm 12000 g/phút trong 15 phút ở 40C.
•Hút dịch ở pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới Chú ý cẩn thận không làm khuấy động pha khác.
•Chú ý: có thể dùng BCP (1-bromo-2 chloropropane) thay cho chloroform
Trang 10Tinh sạch RNA tổng số
• Kết tủa RNA
- Bổ sung 0,5 ml isopropyl alcohol (2-propanol) /1ml Trizol.
- Ly tâm 12000 g/p trong 10 phút ở 40C Bỏ dịch và thu lấy tủa RNA.
• Rửa RNA
- Bổ sung 1ml ethanol 70% vào mỗi ống để rửa tủa RNA.
- Ly tâm 7500 g/p trong 10 phút ở 40C và loại bỏ dịch Lặp lại bước rửa thêm một lần nữa.
- Làm khô tủa RNA ở nhiệt độ phòng không khí khoảng 15 phút hay thiết bị làm khô chân không Tuy nhiên không để tủa khô hoàn toàn sẽ giảm khả năng hòa tan sau này.
- Hòa tan RNA tổng số trong 200 µl nước hoặc dung dịch TLE (0.2M Tris, 0,1M LiCl, 5mM EDTA, chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl) đã được xử lý DEPC.
Trang 11Tách mRNA
Phương pháp sắc ký ái lực oligodT-cellulose
Để tách mRNA (có đuôi Poly A+ ở đầu 3’) người ta cho hỗn hợp RNA tổng số qua cột cellulose có đính oligodT
Khi đi qua nhờ ái lực của T và A đã giữ mRNA lại sau đó các mRNA được rửa rời ra bằng cách loại bỏ các muối khỏi dung dịch thì sẽ làm mất tính bền vững giữa T=A.
Phương pháp dùng hạt bi từ kết hợp oligodT
mRNA (có đuôi Poly A+ ở đầu 3’) được tinh sạch bằng cách sử dụng bằng cách sử dụng những bộ kit là các viên bi từ có khả năng mang oligodT trên bề mặt Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này được thu nhận lại qua ly tâm hay nam châm và mRNA sẽ được tách ra khỏi các viên bi này và giữ lại Kĩ thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ
Trang 12PP dùng hạt bi từ
+ Bổ sung thêm nước cất đã khử Rnase tới thể tích 500 µl
+ Ủ mẫu ở 650C trong 10 phút
+ Bổ sung 3 µl mẫu dò OligodT và 13 µl dung dịch 20X SSC vào mẫu, trộn nhẹ
+ 20X SSC là một đệm gồm 3 M natri clorua và 300 mM trisodium citrate (điều chỉnh độ pH 7.0 với HCl )
+ Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút
Trang 13PP dùng hạt bi từ
+ Búng nhẹ ống hạt sắt từ để hạt phân tán đều trong 300 µl dung dịch 0.5X SSC, trộn đều nhẹ nhàng để rửa hạt
+ Chuyển ống hạt sắc từ lên trên cột nam châm Sau khoảng 5 phút dùng pipet để hút lại toàn
bộ dung dịch trong ống
+ Lặp lại bước rửa này thêm 2 lần nữa
+ Bổ sung 100 µl dung dịch 0,5X SSC và trộn đều nhẹ để các hạt khuếch tán đều trong dung dịch
Trang 14PP dùng hạt bi từ
-Bổ sung 500 µl RNA tổng số vào trong 100 µl dung dịch chứa hạt sắt từ đã qua xử lý
-Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút búng nhẹ mỗi 1-2 phút/lần để quá trình bắt cặp xảy ra
-Chuyển dung dịch lai lên cột nam châm
-Rửa hạt sắt từ đã gắn mRNA bằng dung dịch 0.1X SSC: bổ sung 300 µl dung dịch 0,1X SSC, trộn đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa Lặp lại bước rửa này 2 lần với thao tác tương tự
Trang 15PP dùng hạt bi từ
-Bổ sung 100 µl nước cất đã khử Rnase, trộn đều nhẹ nhàng
-Đưa ống mẫu có chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm
-Hút toàn bộ dung dịch chứa mRNA chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới, giữ mẫu tạm thời trên đá
-Bổ sung 150 µl nước cất đã khử Rnase vào ống chứa các hạt sắt từ và lặp lại bước trên để thu lấy dung dịch chứa mRNA còn lại rồi chuyển tàn bộ dịch thu được vào 100 µl dịch trước đó (tổng thể tích là 250 µl)
Trang 16Thank You For Listen!