Đang tải... (xem toàn văn)
Tách mRNA từ mô động vật RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng hợp trong nhân của tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau. Vì vậy mRNA được dùng làm nguyên liệu xây dựng ngân hàng cDNA, ngân hàng gen không chứa các đoạn gen không mang mã (intron).
L/O/G/O L/O/G/O www.trungtamtinhoc.edu.vn Tách mRNA từ mô động vật GVHD: Đặng Đức Long SVTH: 1.Nguyễn Văn Lạc 2. Phạm Minh Lân 3. Bùi Đình Linh 4. Nguyễn Bá Lộc 5. Phạm Thị Nhi 6. Hoàng Thị Nhung 7. Phan Thị Nhung 8. Đỗ Nguyễn Khánh Phương www.trungtamtinhoc.edu.vn Tách mRNA từ mô động vật Nguyên lý Quy trình chung Các bước tiến hành 4 1 2 3 www.trungtamtinhoc.edu.vn Nguyên lý • RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng hợp trong nhân của tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau. Vì vậy mRNA được dùng làm nguyên liệu xây dựng ngân hàng cDNA. • Khoảng 90-99% tổng số RNA tế bào là rRNA (80 - 85%), tRNA(15 - 20%). Chúng có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng bằng điện di, ly tâm • Tuy nhiên mRNA chiếm khoảng 1 - 5% tổng số RNA tế bào. Kích thước và trình tự của loại này vô cùng đa dạng nên không thể tách bằng phương pháp trên. www.trungtamtinhoc.edu.vn Nguyên lý mRNA có một đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi polyA (có thể lên đến 100A).Người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng cách dựa vào cấu trúc trên và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, sử dụng sắc ký ái lực trên cột oligodT – cellulose hay các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt, mRNA sẽ được thu nhận qua ly tâm hoặc sử dụng nam châm. Các loại RNA đều là các phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). Hoạt tính của các enzyme này rất cao và bền vững. Nó lại có mặt khắp nơi vì vậy cần tuyệt đối vô trùng và cẩn thận, tránh tiếp xúc với dụng cụ và hóa chất bằng tay trần. www.trungtamtinhoc.edu.vn Quy trình chung Mẫu (mô động vật) Loại bỏ tạp chất Phá vỡ màng tế bào Thu RNA tổng số Tách mRNA www.trungtamtinhoc.edu.vn Lấy mẫu và bảo quản • Muốn thu được toàn bộ các mNRA thì cần tiến hành lấy mẫu ở tất cả các mô trên cơ thể động vật, chủ yếu là mô cơ, phổi, não, khí quản, ruột. • Ngay sau khi lấy cần chuyển mẫu vào nitơ lỏng và tiến hành thí nghiệm ngay. Nếu không thì phải bảo quản và lưu trữ mẫu trong nito lỏng hay RNAlater. • RNAlater bảo vệ các mô từ hoạt động RNase cho đến khi nó có thể được đồng nhất trong Trizol, vì vậy không phải nhất thiết để giữ tất cả mọi thứ đông lạnh trong nitơ lỏng. www.trungtamtinhoc.edu.vn Xử lý mẫu với Trizol • Thuốc thử Trizol đã có sẵn là hỗn hợp của phenol, guanidin isothiocyanate, thuốc nhuộm đỏ và các thành phần khác của nó có thể được sử dụng để cô lập RNA trong 1 giờ với một bước duy nhất. DNA và protein có thể được phục hồi với kết tủa tuần tự từ pha hữu cơ. Khử trùng dụng cụ nghiền Chuyển mẫu qua dụng cụ nghiền với tỷ lệ 100mg mẫu: 1ml Trizol Đặt dụng cụ nghiền lên hộp xốp đựng nước đá Nghiền cho đến khi mẫu nhuyễn mịn Chuyển mẫu qua eppendorf, ủ 10 phút www.trungtamtinhoc.edu.vn Xử lý mẫu với Trizol Khử trùng dụng cụ nghiền Chuyển mẫu qua dụng cụ nghiền Đặt dụng cụ nghiền lên hộp xốp đựng nước đá Nghiền cho đến khi mẫu nhuyễn mịn Chuyển mẫu qua eppendorf, ủ 10 phút • Ngâm rửa trong dung dịch chứa nước DEPC 0,1%. • DEPC (Diethylpyrocarbonat) có tác dụng loại bỏ RNase. • Sau đó dụng cụ được khử trùng 20 phút ở nhiệt độ 120 0 C và áp suất cao. www.trungtamtinhoc.edu.vn Thu RNA tổng số • Bổ sung 0,2 ml chloroform/1ml Trizol ban đầu vào mỗi ống chloroform có tác dụng làm biền tính protein và loại phenol ra khỏi phần dung dịch chứa RNA. • Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15-20 giây, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 đến 3 phút. • Sau đó ly tâm 12000 g/phút trong 15 phút ở 4 0 C. • Hút dịch ở pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Chú ý cẩn thận không làm khuấy động pha khác. • Chú ý: có thể dùng BCP (1-bromo-2 chloropropane) thay cho chloroform. www.trungtamtinhoc.edu.vn Tinh sạch RNA tổng số • Kết tủa RNA - Bổ sung 0,5 ml isopropyl alcohol (2-propanol) /1ml Trizol. - Ly tâm 12000 g/p trong 10 phút ở 4 0 C. Bỏ dịch và thu lấy tủa RNA. • Rửa RNA - Bổ sung 1ml ethanol 70% vào mỗi ống để rửa tủa RNA. - Ly tâm 7500 g/p trong 10 phút ở 4 0 C và loại bỏ dịch. Lặp lại bước rửa thêm một lần nữa. - Làm khô tủa RNA ở nhiệt độ phòng không khí khoảng 15 phút hay thiết bị làm khô chân không. Tuy nhiên không để tủa khô hoàn toàn sẽ giảm khả năng hòa tan sau này. - Hòa tan RNA tổng số trong 200 µl nước hoặc dung dịch TLE (0.2M Tris, 0,1M LiCl, 5mM EDTA, chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl) đã được xử lý DEPC. [...]... viên bi từ có khả năng mang oligodT trên bề mặt Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này được thu nhận lại qua ly tâm hay nam châm và mRNA sẽ được tách ra khỏi các viên bi này và giữ lại Kĩ thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ www.trungtamtinhoc.edu.vn PP dùng hạt bi từ •Sử dụng bộ kit “PolyAtract mRNA Isolation.. .Tách mRNA Phương pháp sắc ký ái lực oligodT-cellulose + Để tách mRNA (có đuôi Poly A ở đầu 3’) người ta cho hỗn hợp RNA tổng số qua cột cellulose có đính oligodT Khi đi qua nhờ ái lực của T và A đã giữ mRNA lại sau đó các mRNA được rửa rời ra bằng cách loại bỏ các muối khỏi dung dịch thì sẽ làm mất tính bền vững giữa T=A Phương pháp dùng hạt bi từ kết hợp oligodT + mRNA (có đuôi Poly... www.trungtamtinhoc.edu.vn PP dùng hạt bi từ •Thu mRNA -Bổ sung 100 µl nước cất đã khử Rnase, trộn đều nhẹ nhàng -Đưa ống mẫu có chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm -Hút toàn bộ dung dịch chứa mRNA chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới, giữ mẫu tạm thời trên đá -Bổ sung 150 µl nước cất đã khử Rnase vào ống chứa các hạt sắt từ và lặp lại bước trên để thu lấy dung dịch chứa mRNA còn lại rồi chuyển tàn bộ dịch... hạt bi từ •Tiến hành lai -Bổ sung 500 µl RNA tổng số vào trong 100 µl dung dịch chứa hạt sắt từ đã qua xử lý -Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút búng nhẹ mỗi 1-2 phút/lần để quá trình bắt cặp xảy ra -Chuyển dung dịch lai lên cột nam châm -Rửa hạt sắt từ đã gắn mRNA bằng dung dịch 0.1X SSC: bổ sung 300 µl dung dịch 0,1X SSC, trộn đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên... trisodium citrate (điều chỉnh độ pH 7.0 với HCl ) + Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút www.trungtamtinhoc.edu.vn PP dùng hạt bi từ •Rửa hạt sắt từ + Búng nhẹ ống hạt sắt từ để hạt phân tán đều trong 300 µl dung dịch 0.5X SSC, trộn đều nhẹ nhàng để rửa hạt + Chuyển ống hạt sắc từ lên trên cột nam châm Sau khoảng 5 phút dùng pipet để hút lại toàn bộ dung dịch trong ống + Lặp lại bước rửa này thêm 2 lần . L/O/G/O L/O/G/O www.trungtamtinhoc.edu.vn Tách mRNA từ mô động vật GVHD: Đặng Đức Long SVTH: 1.Nguyễn Văn Lạc 2. Phạm Minh Lân 3. Bùi Đình Linh 4 Hoàng Thị Nhung 7. Phan Thị Nhung 8. Đỗ Nguyễn Khánh Phương www.trungtamtinhoc.edu.vn Tách mRNA từ mô động vật Nguyên lý Quy trình chung Các bước tiến hành 4 1 2 3 www.trungtamtinhoc.edu.vn Nguyên. bằng tay trần. www.trungtamtinhoc.edu.vn Quy trình chung Mẫu (mô động vật) Loại bỏ tạp chất Phá vỡ màng tế bào Thu RNA tổng số Tách mRNA www.trungtamtinhoc.edu.vn Lấy mẫu và bảo quản • Muốn thu