RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng hợp trong nhân của tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau. Vì vậy mRNA được dùng làm nguyên liệu xây dựng ngân hàng cDNA, ngân hàng gen không chứa các đoạn gen không mang mã (intron).
Kỹ thuật sinh học phân tử Chiết tách mRNA từ mô tế bào động vật I. Nguyên lý RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng hợp trong nhân của tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau. Vì vậy mRNA được dùng làm nguyên liệu xây dựng ngân hàng cDNA, ngân hàng gen không chứa các đoạn gen không mang mã (intron). Khoảng 90-99% tổng số RNA tế bào là rRNA (80 - 85%), tRNA(15 - 20%), snRNA (<1%). Chúng có kích thước và trình tự xác định và có thể được tách riêng bằng điện di, ly tâm Tuy nhiên mRNA chiếm khoảng 1 - 5% tổng số RNA tế bào. Kích thước và trình tự của loại này vô cùng đa dạng nên không thể tách bằng phương pháp trên, đặc biệt hơn khi ta cần thu mRNA nguyên vẹn thì không thể thực hiện bằng phương pháp trên được. Tuy vậy, chúng có một đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi polyA (có thể lên đến 100A). Người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng cách dựa vào cấu trúc trên và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, sử dụng sắc ký ái lực trên cột oligodT - cellulose. Các bộ mẫu thử (các kit) được xuất hiện trên thương trường hiện nay sử dụng các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt là dựa vào nguyên tắc đã nêu trên. Rằng liên kết bổ sung với oligodT, sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ, chúng sẽ được thu nhận lại qua ly tâm hoặc sử dụng nam châm và mRNA sẽ được tách khỏi các viên bi và giữ lại. Bằng cách này có thể thu nhận mRNA từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ. Sau khi tách chiết các nucleic acid có thể được tinh sạch bằng các phương pháp siêu ly tâm, sắc ký hay điện di. Các loại RNA đềulà các phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). Hoạt tính của các enzyme này rất cao và bền vững với các tác nhân thường dùng để bất hoạt enzyme (như xử lý 90 0 C trong 1h không làm mất hoạt tính nó). RNase lại có mặt khắp nơi (ví dụ trên đầu ngón tay của người thao tác ). Chính vì vậy, cần phải có nhiều biện pháp thận trọng để tránh các tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay được xử lý với DEPC (Diethylpyrocarbonat), và tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần. II. Tiến hành 1. Sơ đồ quy trình Trang 1 Mẫu (mô động vật) Loại bỏ tạp chất Phá vỡ màng tế bào Thu RNA tổng số Tách mRNA Kỹ thuật sinh học phân tử 2. Các bước tiến hành a. Lấy mẫu Muốn thu được toàn bộ các mNRA thì cần tiến hành lấy mẫu ở tất cả các mô trên cơ thể động vật và chủ yếu là mô cơ, phổi, não, khí quản, ruột. Ngay sau khi lấy cần chuyển mẫu vào nito lỏng và tiến hành thí nghiệm ngay. Nếu không thì phải bảo quản và lưu trữ mẫu trong nito lỏng hay RNAlater (một dung dịch bảo quản RNA khỏi bị Rnase tấn công mà không làm đông mô mẫu). RNAlater bảo vệ các mô từ hoạt động RNase cho đến khi nó có thể được đồng nhất trong Trizol, vì vậy không phải nhất thiết để giữ tất cả mọi thứ đông lạnh trong nitơ lỏng. b. Xử lý mẫu với Trizol Có nhiều phương pháp phá màng và loại bỏ protein như nghiền trong nito lỏng, các chất tẩy mạnh như SDS, sarcocyl nồng độ cao và sau đó xử lý bằng hỗn hợp phenol:cloroform (1:1) nhưng ở đây sẽ giới thiệu về phương pháp dùng thuốc thử Trizol Trizol Reagent: Thuốc thử TRIzol đã có sẵn cho việc sử dụng hỗn hợp của phenol, guanidin isothiocyanate, thuốc nhuộm đỏ và các thành phần khác của nó có thể được sử dụng để cô lập RNA trong 1 giờ với một bước duy nhất. DNA và protein có thể được phục hồi với kết tủa tuần tự từ pha hữu cơ. TRIzol được phát triển bởi Piotr Chomczynski. Thuốc Trang 2 Kỹ thuật sinh học phân tử nhuộm màu đỏ cho phép phát hiện dễ dàng pha hữu cơ và không tương tác với các axit nucleic. - Chuẩn bị dụng cụ nghiền được ngâm rửa trong dung dịch chứa nước DEPC 0,1% . DEPC (Diethylpyrocarbonat) có tác dụng loại bỏ RNase. Sau đó dụng cụ được khử trùng 20 phút ở nhiệt độ 120 0 C và áp suất cao. - Mẫu sau khi lấy được bảo quản trong nito lỏng hay RNAlater được chuyển nhanh qua dụng cụ nghiền mẫu. Bổ sung dung dịch Trizol (phenol pH=4 (biến tính protein), guanidin thiocyanat (biến tính protein), glycerol (có thể được dung như chất chống đông hay hợp chất dung giải màng tế bào), natri acetat) vào dụng cụ nghiền mẫu với tỷ lệ 100mg mẫu: 1ml Trizol. - Đặt dụng cụ nghiền lên hộp xốp đựng nước đá và nghiền mẫu cho đến khi mẫu nhuyễn mịn. - Chuyển hỗn hợp từ dụng cụ nghiền mẫu sang các ống eppendorf 1,5 ml với thể tích khoảng 1ml/ống (mỗi ống eppendorf tương đương với 1 ml Trizol bổ sung ban đầu). - Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, cho phép phân ly hoàn toàn của phức hợp nucleoprotein. c. Thu RNA tổng số - Bổ sung 0,2 ml chloroform/1ml Trizol bổ sung ban đầu vào mỗi ống (chloroform có tác dụng làm biền tính protein và loại phenol ra khỏi phần dung dịch chứa RNA). Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15-20 giây, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 đến 3 phút. - Sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C. - Sau khi ly tâm sẽ thu được eppendorf có phân lớp như hình Ta thấy, hỗn hợp chia tách thành màu đỏ thấp hơn, pha phenol-chloroform, một pha trung gian, và một pha nước trên không màu ở trên thể tích khoảng 60%. RNA vẫn ở riêng trong pha nước. - Hút dịch ở pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Chú ý cẩn thận không làm khuấy động pha khác. Trang 3 Kỹ thuật sinh học phân tử Chú ý: có thể dùng BCP (1-bromo-2 chloropropane) thay cho chloroform.Vì có mật độ cao do đó tương tác nhiều hơn và vì thế lớp nước thì dễ được thu hồi hơn. Hoặc dùng isopropanol. d. Tinh sạch RNA tổng số - Bổ sung 0,5 ml isopropyl alcohol (2-propanol) /1ml Trizol bổ sung ban đầu (giúp RNA tủa mà không cần nồng độ muối cao). Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Chú ý: Có thể dùng ethanol thay cho propanol. Sử dụng 0.75ml/1ml TRIzol. Tuy nhiên nếu dùng ethanol thì cần bổ sung muối với nồng độ cao. - Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4 0 C. Loại bỏ dịch và thu lấy tủa RNA. - Bổ sung 1ml ethanol 70% vào mỗi ống để rửa tủa RNA. Ly tâm 7500 v/p trong 10 phút ở 4 0 C và loại bỏ dịch. Lặp lại bước rửa thêm một lần nữa. Làm khô tủa RNA ở nhiệt độ phòng không khí khoảng 15 phút hay thiết bị làm khô chân không. Tuy nhiên, không để cho tủa RNA khô hoàn toàn vì như thế sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nó về sau. Nếu mẫu quá khô thì có thể huyền phù lại trong nước loại bỏ RNase. - Hòa tan RNA tổng số trong 200 µl nước hoặc dung dịch TLE (0.2M Tris, 0,1M LiCl, 5mM EDTA, chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl) đã được xử lý DEPC. - Bảo quản dài hạn RNA: Cho việc lưu trữ lâu dài, khuyến cáo nên huyền phù lại RNA trong Formamide ổn định và lưu trữ ở -70 ° C. Để loại bỏ các Formamide, thêm 4 thể tích ethanol, và nếu ít hơn 20 mg RNA cũng có thêm NaCl 0,2 M. Tủa RNA. e. Tách mRNA Nguyên lý chung của quá trình tách mRNA ra khỏi RNA tổng số là dựa vào MRNA có đuôi poly A ở đầu 3’. Ta sẽ tách được mRNA nhờ ái lực của đuôi Poly A này với đoạng oligodT mà ta đưa vào. Phương pháp sắc ký ái lực oligodT-cellulose Để tách mRNA (có đuôi Poly A + ở đầu 3’) người ta cho hỗn hợp RNA tổng số qua cột cellulose có đính oligodT. Khi đi qua nhờ ái lực của T và A đã giữ mRNA lại sau đó các mRNA được rửa rời ra bằng cách loại bỏ các muối khỏi dung dịch thì sẽ làm mất tính bền vững giữa T=A. Quy trình : gồm 2 công đoạn a) Công đoạn đổ cột oligo (dT) : Gồm 3 bước Bưc 1 : Rửa cột Silanized bằng 10ml dung dịch NaOH 5M sau đó tráng bằng nước cất Bưc 2 : Thêm 0,5 g bột cellulose oligo (dT) khô vào 1ml dung dịch NaOH 0.1 M rồi đổ hỗn hợp sền sệt này vào cột rồi tráng cột bằng khoảng 10 ml Trang 4 Kỹ thuật sinh học phân tử Bưc 3 : Cân bằng cột với 10-20ml dung dịch đệm tải . Kết quả pH lúc này tại thời điểm kết thúc rửa cân bằng cột sẽ vào khoảng 7.5. b) Công đoạn tách mRNA từ RNA tổng số : Gồm 9 bước Bưc 1 : Đun nóng 2mg RNA tổng số trong nước ở 70 0 C trong khoản 10 phút để phá v‚ cấu trúc thứ cấp sau đó thêm đủ lượng dung dịch LiCl 10 M để nồng độ LiCl cuối cùng trong dung dịch là 0.5M. Chú ý : Việc đun nóng RNA nhằm mục đích phá bỏ cấu trúc bậc 2 có thể hình thành . Không nên dùng cột quá lớn , nên dùng cột nhỏ để thu được 0.5 mg mRNA poly (A) – với lượng như vậy sẽ cho hiệu quả tốt nhất , thường cứ 1 ml oligo ( dT ) cellulose đủ để tách chiết lượng RNA tổng số ban đầu khoảng từ 5-10mg RNA. Bưc 2 : Đổ dung dịch RNA qua cột oligo ( dT ) sau đó rửa cột bằng 1ml dung dịch đệm tải poly A . Nhớ giữ lại phần dung dịch nước tách rửa. Bưc 3 : Đổ nước tách rửa qua cột 2 lân nữa nhằm đảm bảo cho tất cả các poly A đều bám vào cột oligo( dT). Bưc 4 : Tráng cột bằng 2 ml dung dịch đệm rửa Bưc 5 : Tách rửa mRNA trong ống nghiệm sạch với 2ml EDTA / 0.1 % SDS. Bưc 6 : Cân bằng lại cột oligo( dT ) thu lấy mRNA lặp lại từ bước 1 đến bước 5. Cột oligo ( dT ) lần 2 này tiến hành có tác dụng loại bỏ 1 lượng nhỏ poly A RNA lẫn tạp. Bưc 7 : Kết tủa mRNA vừa được rửa bằng cách dùng đủ lượng dung dịch Sodium acetate 3M để có nồng độ cuối cùng là 0.3M Sodium acetate. Bưc 8 : Sau đó thêm vào 2.5 lần thể tích ethanol rồi chuyển dung dịch vào 2 ống nghiệm Silanized SW- 55 , ủ dung dịch mRNA qua đêm ở nhiệt độ -20 0 C hoặc là ủ trong ethanol nằm trong đá khô trong 30 phút. Thu nhận kết tủa bằng cách li tâm trong 30 phút với tốc độ 50000 vòng / phút ở 4 0 C trên máy beckman SW -55 rotor nhằm kết tủa và cô đặc mRNA. Bưc 9 : Đổ ethanol đi rồi để pellet khô tự nhiên hoặc trong máy hút chân không. Hòa tan mRNA trong 150µl dung dịch TE sạch Rnase . Chất lượng RNA có thể được kiểm tra bằng cách đun nóng 5 µl dung dịch ở 70 0 C trong 5 phút rồi phân tích trên gel agarose 1%. Cách pha các dung dịch đệm: Trang 5 Kỹ thuật sinh học phân tử + Đệm rửa trung gian chứa : 0,15M LiCl , 10mM Tris-Cl pH 7.5 , 1mM EDTA , 0,1% SDS + Đệm tải poly A chứa : 0,5 M LiCl , 10mM Tris-Cl pH 7.5 , 1mM EDTA và 0,1% SDS. Phương pháp dùng hạt bi từ kết hợp oligodT - mRNA (có đuôi Poly A + ở đầu 3’) được tinh sạch bằng cách sử dụng bằng cách sử dụng những bộ kit là các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt. Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này được thu nhận lại qua ly tâm hay nam châm và mRNA sẽ được tách ra khỏi các viên bi này và giữ lại. Kĩ thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ. - Chuẩn bị lượng RNA tổng số (khoảng 0,1-1 mg) chứa trong ống eppendorf 1,5 ml. + Bổ sung thêm nước cất đã khử Rnase tới thể tích 500 µl. + Ủ mẫu ở 65 0 C trong 10 phút. Trang 6 Kỹ thuật sinh học phân tử + Bổ sung 3 µl mẫu dò OligodT và 13 µl dung dịch 20X SSC vào mẫu (20X SSC là một đệm gồm 3 M natri clorua và 300 mM trisodium citrate (điều chỉnh độ pH 7.0 với HCl )), trộn nhẹ rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng đến khi nhiệt độ hỗn hợp hạ xuống (khoảng 10 phút). - Rửa hạt sắt từ + Búng nhẹ ống hạt sắt từ để hạt phân tán đều trong 300 µl dung dịch 0.5X SSC, trộn đều nhẹ nhàng để rửa hạt. + Chuyển ống hạt sắc từ lên trên cột nam châm. Sau khoảng 5 phút dùng pipet để hút lại toàn bộ dung dịch trong ống. + Lặp lại bước rửa này thêm 2 lần nữa. + Bổ sung 100 µl dung dịch 0,5X SSC và trộn đều nhẹ để các hạt khuếch tán đều trong dung dịch. - Bổ sung 500 µl RNA tổng số vào trong 100 µl dung dịch chứa hạt sắt từ đã qua xử lý. - Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút búng nhẹ mỗi 1-2 phút/lần. - Chuyển dung dịch lai lên cột nam châm. - Rửa hạt sắt từ đã gắn mRNA bằng dung dịch 0.1X SSC: bổ sung 300 µl dung dịch 0,1X SSC, trộn đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa. lặp lại bước rửa này 2 lần với thao tác tương tự. - Bổ sung 100 µl nước cất đã khử Rnase, trộn đều nhẹ nhàng. - Đưa ống mẫu có chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm. - Hút toàn bộ dung dịch chứa mRNA chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới, giữ mẫu tạm thời trên đá. - Bổ sung 150 µl nước cất đã khử Rnase vào ống chứa các hạt sát từ và lặp lại bước trên để thu lấy dung dịch chứa mRNA còn lại rồi chuyển tàn bộ dịch thu được vào 100 µl dịch trước đó (tổng thể tích là 250 µl). Trang 7 . có thêm NaCl 0,2 M. Tủa RNA. e. Tách mRNA Nguyên lý chung của quá trình tách mRNA ra khỏi RNA tổng số là dựa vào MRNA có đuôi poly A ở đầu 3’. Ta sẽ tách được mRNA nhờ ái lực của đuôi Poly A. Kỹ thuật sinh học phân tử Chiết tách mRNA từ mô tế bào động vật I. Nguyên lý RNA thông tin (messenger RNA) là một loại axit nucleic được tổng. bằng tay trần. II. Tiến hành 1. Sơ đồ quy trình Trang 1 Mẫu (mô động vật) Loại bỏ tạp chất Phá vỡ màng tế bào Thu RNA tổng số Tách mRNA Kỹ thuật sinh học phân tử 2. Các bước tiến hành a. Lấy mẫu Muốn