công nghệ adn tái tổ hợp

Từ những thao tác rất nhỏ trong cuộc sống như muối dưa, muối cà đến việc sản xuất ở qui mô công nghiệp các sản phẩm của công nghệ lên men, công nghệ vi sinh như các đồ uống có cồn rượu,

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, không như cách đây hàng trăm năm người ta chỉ biết đến những gì mắt thấy tai nghe, thì giờ đây con người với những bộ óc tuyệt vời của các nhà khoa học nghiên cứu họ đã tìm ra được những thứ mà không thể nhìn thấy bằng mắt thường như là vi khuẩn, những thành phần cấu tạo vi mô của các chất, các nguyên tử, phân tử … đó là những thành công lớn mà nhân loại có được Đặc biệt là công nghệ sinh học - một lĩnh vực khoa học công nghệ vĩ đại

Công nghệ sinh học (CNSH) là một lĩnh vực công nghệ cao, công nghệ của thế kỷ XXI Ít năm trước đây, trước thềm của thế kỷ XXI, đã có nhiều ý kiến nhận định, phán đoán của các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu chiến lược, các nhà hoạch định chính sách,… về một ngành khoa học mũi nhọn có thế sẽ được phát triển trong tương lai

Thực vậy, công nghệ sinh học là một bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người CNSH đã được phát triển và ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực của cuộc sống Người ta đã sử dụng CNSH trong lĩnh vực nông-lâm - ngư nghiệp, lĩnh vực y-

dược, bảo vệ môi trường,…thậm chí là cả trong lĩnh vực thể thao Trong mỗi

lĩnh vực, CNSH đều đã mở ra được các cách thức, phương thức làm cho cuộc sống an toàn hơn, mạnh khoẻ hơn và năng suất cao hơn.

Từ xa xưa, công nghệ sinh học (CNSH cổ truyền và CNSH cận đại) đã được loài người ứng dụng phục vụ nhiều nhu cầu cuộc sống Từ những thao tác rất nhỏ trong cuộc sống như muối dưa, muối cà đến việc sản xuất ở qui

mô công nghiệp các sản phẩm của công nghệ lên men, công nghệ vi sinh như các đồ uống có cồn (rượu, bia ), các dung môi hữu cơ, các vitamin, các loại vaccine, thuốc trừ sâu sinh học, phân bón sinh học, … Vài thập kỷ gần đây, với sự ra đời của CNSH hiện đại ( gồm: Công nghệ di truyền, công nghệ tế bào, công nghệ vi sinh vật/ công nghệ lên men , công nghệ enzym/ protein và CNSH môi trường), loài người đã và đang có thể sửa chữa, trao đổi, cải tạo, tạo mới vật chất di chuyền ở cấp độ phân tử Thực tế phát triển và ứng dụng CNSH hiện đại trên cơ sở kế thừa và phát huy CNSH cổ truyền và cận

đại, những năm gần đây, loài người đã có thể tuyển chọn và dần tạo thêm được nhiều giống cây trồng, vật nuôi mới có năng suất, chất lượng cao, sức chống chịu tốt; Đã và đang có thể chuẩn đoán, phòng ngừa hay cứu chữa các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền như bệnh tiểu đường, khối u, ung thư, lùn bẩm sinh, thiếu máu; các bệnh nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính; viêm gan B, viêm não Nhật Bản, bại liệt, sốt rét, …; Đã có thể tạo

ra ngày một nhiều các chủng, loài vi sinh vật mới hoặc chỉ định các vi sinh vật này tạo ra các protein, enzim có hoạt tính cao hơn hay các sản phẩm khác mà vốn dĩ trước đây chúng ta không làm được…

Trong đó ADN tái tổ hợp là kỹ thuật đầu tiên của hàng loại kỹ thuật Công

nghệ sinh học hiện đại khác, tập hợp lại gọi là Công nghệ di truyền.

PHẦN II: NỘI DUNG

1 Khái niệm về ADN tái tổ hợp:

ADN tái tổ hợp: Là một phân tử AND nhỏ được ráp láp từ các đoạn ADN lấy từ các tế bào khác nhau (thể truyền và gen cần chuyển) mà thể truyền là một phân tử ADN nhỏ có khả năng nhân đôi một cách độc lập đối với hệ gen của tế bào cũng như có thể gắn vào hệ gen của tế bào

Công nghệ di truyền cũng gọi là công nghệ gen hay kỹ thuật tái tổ hợp ADN thực hiện việc chuyển gen để tạo ra các tế bào hoặc có thể mang các gen mới nhằm tạo ra những vật chất cần thiết

2 Các bước tiến hành kỹ thuật ADN tái tổ hợp:

2.1 Phân lập đoạn ADN/gen bằng PCR

Có nhiều phương pháp để phân lập một đoạn ADN/gen như: sàng lọc gen

từ thư viện genome hoặc thư viện cADN, bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR là phương pháp phổ biến hiện nay được dùng để phân lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome của sinh vật dựa trên các primer đặc hiệu cho trình tự đó Phương pháp PCR đơn giản và ít tốn thời gian hơn hai phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích ADN)

PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các đoạn ADN đặc trưng PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn ADN có chiều dài từ 200-3.000 bp Đoạn ADN được khuếch đại (ADN đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide

+ Nguyên tắc của PCR

Taq polymerase là một loại enzyme ADN polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn ADN mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn ADN nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn ADN nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng Primer ở bên trái tác động trên sợi ADN 3’→5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F) Primer ở bên phải tác động trên sợi ADN 5’→3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 1 Theo đó, từ chu kỳ thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn ADN có chiều dài xác định Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di PCR thường tiến hành

giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

Hình 1 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC Trong giai đoạn biến tính, phân

tử ADN khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands) Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp ADN từ chu kỳ trước đó)

Gen đích

DNA khuôn mẫu

Khuếch đại theo hàm mũ

- Gắn mồi (annealing) ở 35-55oC Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở ADN khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và ADN khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các

đoạn nhỏ ADN sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có

thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu

độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp ADN bắt đầu từ các vị

mẫu có mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá vỡ các liên kết này sẽ không bị đứt gãy Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được ADN Enzyme Taq

vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bới các enzyme hạn chế

Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự ADN đặc trưng chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA

(Hình 2) Có hơn 500 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 loài vi sinh vật Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử ADN sợi đôi theo hai cách khác nhau như:

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng.

- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối

xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu kết dính).

Hình 2 Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế (a) tạo ra đầu bằng,

và (b) tạo ra đầu so le.

Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử ADN đặc biệt thường là nhỏ Các đoạn ADN được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel

để nghiên cứu Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên ADN vi khuẩn, ADN thực vật và ADN động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc Vì thế, một đoạn ADN từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với ADN của một dạng sống khác Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau Chúng là những phân tử ADN mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn ADN ngoại lai (foreign ADN) dùng trong kỹ thuật

A C C G G T

Các đoạn ADN thu được từ phản ứng cắt hạn chế được gắn đồng hóa trị in vitro vào vector tạo dòng bằng cách dùng enzyme gắn ADN ligase Trước khi gắn, vector được cắt ra ở một vị trí đơn, thông thường là cùng với enzyme được dùng để cắt ADN nguồn, nhằm tạo các đầu kết dính bổ trợ cho các đầu của đoạn ADN chèn vào (ADN ngoại lai) Một đôi khi, vector và ADN nguồn được cắt với tổ hợp hai enzyme khác nhau để ngăn cản mỗi loại phân tử tự gắn lại Sự tự tái tạo lại vòng của vector cũng có thể giảm thiểu bằng cách xử lý với enzyme alkaline phosphatase để loại nhóm 5’-PO4 khỏi các đầu của vector.

Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân, được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau Chúng là những phân tử ADN mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1- ≥ 200 kb, có khả năng tự sao chép để tồn tại độc lập trong tế bào

Các plasmid dùng làm vector tạo dòng có các đặc điểm sau: Kích thước tương đối nhỏ, mang một hoặc nhiều gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) cho phép xác định các nhân tố biến nạp và duy trì plasmid trong quần thể vi khuẩn, chứa các vị trí nhận biết đơn cho một hoặc nhiều enzyme hạn chế

Các plasmid được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là các plasmid đa năng (polycloning plasmid) và chuyên dụng thuộc thế hệ thứ ba Để tiện cho việc sử dụng nhiều loại enzyme hạn chế khác nhau, nhiều trình tự nhận biết của chúng được xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker (vùng đa nối) hay multiple cloning sites (các vị trí tạo dòng) Các plasmid vi khuẩn có thể chứa đoạn ADN ngoại lai khoảng 3-10 kb Ví dụ: plasmid pGEM-T dùng để tạo dòng

các đoạn ADN là sản phẩm PCR (Hình 3).

Hình 3 Plasmid vector pGEM-T Loại vector này đã được mở sẵn ở vùng tạo dòng trên gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho gắn các sản phẩm PCR do chúng có mang hai đầu A.

Về nguyên tắc, ADN plasmid bị cắt bởi enzyme hạn chế và gắn in vitro với đoạn ADN ngoi lai tạo ra các plasmid tái tổ hợp, sau đó chúng được dùng để biến nạp vào vi khuẩn Khó khăn lớn nhất là phân biệt giữa các plasmid chứa các đoạn ADN ngoại lai-thể tái tổ hợp (recombinant) và các phân tử ADN vector đã tái tạo lại vòng (recircularization) Sự tái tạo lại vòng của plasmid có thể được hạn chế bằng cách điều chỉnh nồng độ ADN ngoại lai và ADN vector trong phản ứng gắn (ligation)

2.2.3 Gắn đoạn ADN (sản phẩm PCR) vào vector

Trong một số trường hợp nhất định có thể thay thế phương pháp tạo dòng truyền thống bằng kỹ thuật PCR, vì PCR cho phép sản xuất ra một lượng lớn đoạn ADN mong muốn và sau đó có thể tạo dòng đoạn ADN này trong các plasmid vector hoặc phage thích hợp Phương thức tạo dòng cho các sản phẩm PCR hoàn toàn giống tạo dòng các đoạn ADN thu được từ những thao tác ADN truyền thống, và có thể được tạo dòng với đầu bằng hoặc đầu kết dính (so le) ADN polymerase ổn nhiệt như Taq polymerase đã khuếch đại các sản phẩm PCR

có gốc A lồi ra ở đầu 3’ Như vậy, có thể tạo dòng sản phẩm PCR vào trong các

dT vector (được gọi là tạo dòng dA:dT) Điều này cho thấy việc bổ sung các gốc

A vào đầu cuối có thể giúp gắn thành công sản phẩm PCR với vector đã được

chuẩn bị với gốc T lồi ra (Hình 4) Phản ứng được xúc tác bởi ADN ligase, như

trong một phản ứng gắn truyền thống.

Người ta cũng có thể tạo dòng đầu kết dính với các sản phẩm PCR Trong trường hợp này các oligonucleotide primer được thiết kế với một vị trí cắt hạn chế được kết hợp chặt chẽ trong chúng Do sự bổ trợ của các primer cần thiết là tuyệt đối ở đầu 3’, nên thông thường đầu 5’ của primer

là vùng định vị của vị trí cắt hạn chế Điều này cần phải được thiết kế với sự chú ý thận trọng do hiệu suất cắt ADN bằng một enzyme hạn chế nhất định

sẽ giảm nếu các nucleotide bổ sung thêm cho sự nhận biết của enzyme lại thiếu ở đầu 5’ Trong trường hợp này các phản ứng cắt và gắn giống như các phản ứng truyền thống.

Hình 4 Tạo dòng các sản phẩm PCR bằng phương thức tạo dòng dA:dT.2.2.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ

Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo là biến nạp nó vào tế bào vật chủ Trong trường hợp này tế bào vật chủ thường

được sử dụng là vi khuẩn E coli để khuếch đại một lượng lớn ADN plasmid tái

tổ hợp dùng cho các phân tích về sau

Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng Taq polymerase

Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli

là điện biến nạp (electroporation transformantion) và hóa biến nạp (chemical transformation).

2.2.4.1 Điện biến nạp

Đây là kỹ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn Hai thông số quan trọng của phương thức này là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết Thể tích của dung dịch tế bào thường được dùng là 30 µL (tương ứng với nồng

độ 1010 tế bào E coli/mL) có bổ sung 5 ng plasmid trong một cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm Hiệu suất biến nạp của phương thức này lớn hơn 1× 109 thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn và khoảng 1× 108 thể biến nạp/µg plasmid được dùng trong phản ứng gắn Tần số biến nạp khoảng 0,02 cho

cả hai loại plasmid Tần số biến nạp thấp đã ngăn cản được sự đồng biến nạp (co-transformation) vào vi khuẩn của hai hoặc nhiều phân tử plasmid

Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau:

- Hiệu suất biến nạp cao

- Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ Thể tích dịch tế bào khoảng 20

µL có thể cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp

- Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp rất đơn giản, không sử dụng các

kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian Hơn nữa, các tế bào dùng để biến nạp có thể được chuẩn bị trước và bảo quản vô hạn định mà không mất tính khả biến

- Tần số điện biến nạp với ADN siêu xoắn và ADN mạch vòng là giống nhau Do đó, không cần thiết phải dùng vector được tinh sạch cao trong các phản ứng gắn

- Hiệu suất biến nạp phân tử cho ADN mạch vòng rất cao đối với các plasmid có kích thước lên đến 50 kb

Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền

2.2.4.2 Hóa biến nạp

Đây là phương thức kinh điển để biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli Các tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận ADN plasmid ADN plasmid đưa vào bằng cách shock nhiệt nhanh (40-50 giây), các tế bào biến nạp sau đó được chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương tính trên đĩa agar chứa môi trường LB với kháng sinh thích hợp Mỗi khuẩn lạc trên đĩa kháng sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn Các

tế bào chứa plasmid mang ADN ngoại lai có thể xác định bằng mắt trên đĩa môi trường có bổ sung thêm cơ chất nhiễm sắc thể cho β-galactosidase (X-gal) vì chúng là các khuẩn lạc không màu do sự khử hoạt tính của enzyme bằng cách

chèn đoạn ADN ngoại lai

Phương pháp chuẩn bị và bảo quản tế bào khả biến trong hóa biến nạp cũng rất đơn giản Hiệu suất biến nạp của phương pháp này trong khoảng 104-106 thể biến nạp/µg plasmid, tùy thuộc vào kích thước của đoạn ADN chèn và chủng vi khuẩn được sử dụng Hiệu suất này thích hợp cho các phương thức tạo dòng truyền thống Đối với các phương thức cần hiệu suất biến nạp cao hơn (ví dụ: xây dựng thư viện cADN, xây dựng thư viện phân tích trình tự ADN ) thì tốt hơn hết là dùng phương pháp điện biến nạp Tuy nhiên, nếu không có sẵn thiết bị biến nạp bằng điện thì vẫn có thể thu được hiệu suất biến nạp cao bằng cách dùng các chủng vi khuẩn thích hợp hơn cho mục đích này và có thể thu được hiệu suất 109 thể biến nạp/µg plasmid.

2.3 Chọn dòng mang ADN tái tổ hợp

Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector và một lượng lớn phân tử ADN cắt cùng một enzyme hạn chế được gắn lại với nhau bằng enzyme

ADN ligase Kết quả, hỗn hợp này có plasmid tái tổ hợp lẫn các plasmid

không có gen ngoại lai chèn vào và chúng được trộn lẫn với các tế bào vi khuẩn để thực hiện biến nạp Sau đó, người ta chuyển tất cả lên môi trường dinh dưỡng chọn lọc để chúng phát triển thành các dòng tức các khuẩn lạc

vi khuẩn Do cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất như vậy nên các dòng vi khuẩn mọc lên có ba loại như sau:

- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid.

- Tế bào nhận được plasmid không có gen ngoại lai chèn vào.

- Tế bào vi khuẩn nhận đúng plasmid tái tổ hợp.

Hình 5 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn AmpR: gen kháng ampicillin, lacZ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase

Vì vậy, việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp phải mất nhiều công sức Có ba hướng chính trong thí nghiệm tạo dòng thừ thư viện

ADN là lai khuẩn lạc và vết tan, khử hoạt tính bằng chèn đoạn và tạo dòng

định hướng Dưới đây chỉ trình bày phương pháp thông dụng đó là khử hoạt tính bằng chèn đoạn.

Amp r

lacZ

Plasmid vector ADN ngoại lai

BamHI BamHI BamHI

BamHI Amp r

Amp r

Gen lacZ mất hoạt tính

lacZ

Đoạn ADN ngoại lai chèn giữa gen lacZ làm gen lacZ mất hoạt tính Amp r

ADN ligase

Biến nạp vào E.coli và sinh trưởng ở 37 o C trên môi trường

có Amp và IPTG + X-gal

Vi khuẩn E.coli chứa vector tái tạo vòng phát triển thành khuẩn lạc có màu xanh

Vi khuẩn E.coli chứa vector tái tổ hợp phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng

BamHI

Phương pháp khử hoạt tính bằng chèn đoạn dùng cho các plasmid mang hai hoặc nhiều marker (ví dụ Ampr, lacZ) ADN ngoại lai và ADN plasmid được thủy phân cùng một loại enzyme hạn chế và tinh sạch, sau đó gắn hai ADN với nhau, hỗn hợp gắn được biến nạp vào E coli mẫn cảm Amp để chọn lọc thể biến nạp nhờ tính kháng Amp của plasmid và hoạt

hợp sinh trưởng trên môi trường có mặt Amp và isopropyl-thiogalactoside (IPTG) cùng với cơ chất nhiễm sắc thể X-gal sẽ có màu trắng do đoạn ADN ngoại lai xen vào giữa gen lacZ làm gen này mất hoạt tính Trong khi đó, các khuẩn lạc chứa ADN plasmid tái tạo lại vòng sẽ có màu xanh do gen lacZ không bị mất hoạt tính (Hình 5.5).

2.4 Biểu hiện của gen được tạo dòng

Về mặt lý thuyết, kỹ thuật ADN tái tổ hợp cho phép đưa bất kỳ một đoạn gen nào từ sinh vật này vào sinh vật khác Vấn đề quan trọng tiếp theo là làm sao các gen lạ có sự biểu hiện

Muốn gen tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã Các vector này được gọi là vector biểu hiện Nếu gen không nằm giữa promoter và terminator, nó sẽ không được phiên mã Các gen được tổng hợp hóa học hay từ cADN không có promoter nên phải gắn chúng cạnh promoter thì mới có thể biểu hiện phiên mã Để sự dịch mã được thực hiện, mARN cần phải mang ở đầu 5’ trình tự rbs (ribosome binding site-vị trí liên kết ribosome) Đoạn gen ngoại lai thiếu điểm bám của ribosome (rbs), do

đó muốn được dịch mã thì nó phải gắn vào vị trí nằm sau promoter và rbs

Ở một số gen của sinh vật eukaryote, sự dịch mã đòi hỏi quá trình splicing tức là cắt bỏ các đoạn intron khỏi tiền mARN thông tin (premature mARN) và

nối các exon lại với nhau để tạo thành mARN hoàn chỉnh (mature mARN).

Mục đích việc tạo dòng các gen của động vật có vú, nhất là của người,

là nhằm tạo ra các sản phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại Sự biểu hiện của các gen eukaryote trong tế bào vi