Bài giảng: Phương pháp khối phổ pdf

• Là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trường hoặc t

Bùi Văn Hiệu - NguyễnThi Ngọc

Lớp: 10B CNSH - KH

NỘI DUNG CHÍNH

I Tổng quan về khối phổ

1 Khối phổ là gì?

2 Nguyên tắc hoạt động và nguyên lý chung

II Sự kết hợp giữa khối phổ các phương pháp

khác

1 Sắc ký khí kết hợp với khối phổ

2 Sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ

3 Kết hợp điện di hai chiều-khối phổ

III Các phương pháp ion hóa hiện đại

IV Xác định protein sử dụng khối phổ

TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ

KHỐI PHỔ LÀ GÌ?

• Là phương pháp nghiên cứu các chất bằng

cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân

tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trường hoặc từ trường nhất định

• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được

kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:

– Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.

– Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.

– Khối phổ kết hợp điện di

Máy khối phổ

• Là một thiết bị dùng cho phương pháp

phổ khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để tìm ra thành phần của

nó

• Có thể ion hóa mẫu và tách các ion

của nó với các khối lượng khác nhau

và lưu lại thông tin dựa vào việc đo

đạc cường độ dòng ion

Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:

• Phần nguồn ion

• Phần phân tích khối lượng

• Phần đo đạc

Cấu tạo:

• Bộ phận đưa mẫu;

• Nguồn ion hoá;

• Hệ thống bơm chân không;

• Bộ phân tích khối đo tỷ lệ khối

lượng/điện tích của phân tử ở dạng ion hoá (m/z);

• Bộ phận đo tín hiệu xác định số lượng

các ion ở mỗi giá trị m/z;

• Hệ thống phân tích số liệu, bao gồm

máy tính cấu hình cao với các phần

mềm chuyên dụng

Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt

khác nhau

Theo tính năng bộ ghi, người ta chia các máy khối phổ thành hai loại:

• Máy khối phổ ký ghi bằng kính ảnh Tín hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở dạng vạch có độ đen khác nhau

• Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm ion được ghi dưới dạng xung điện bằng các dao động ký điện tử nhiều kênh, hoặc đưa vào máy tính điện tử,tín hiệu sẽ được đưa ra dưới dạng bảng số hoặc đồ thị thích hợp

Ngày nay trong phân tích khối phổ người ta dùng các máy khối phổ kế

Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển

thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ

• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ

thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion,kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài

• Quá trình được thực hiện trong môi

trường chân không

• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng

760 mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển)

• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài

• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính

II Sự kết hợp khối phổ và các phương pháp khác

1 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí

(Gas Chromatography Mass Spectometry)

• Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ(viết

tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí

• Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas

Chromatography) và Khối phổ (Mass Spectometry) Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram.

Cấu tạo của GC-MS

- Sắc ký khí (GC): Phân tách hỗn hợp hóa chất thành một

mạch theo từng chất tinh khiết

- Khối phổ (MS): ) Xác định định tính và định lượng

• A Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter

dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000C để mẫu trở thành dạng khí.

• B Vỏ ngoài (oven): Phần vỏ của hệ thống

GC chính là một lò nung đặc biệt Nhiệt độ của lò này dao động từ 40 0 C cho tới 320 0 C.

• C Cột (column): Bên trong hệ thống GC là

một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30 mét với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này

• Sau khi đi qua cột sắc kí khí, các hóa

chất tiếp tục đi vào pha khối phổ.Ở đây chúng bị ion hóa.Sau khi khối phổ,chúng sẽ tới bộ phận lọc

• Dựa trên khối lượng ,bộ lọc lựa chọn

chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua.

• Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số

lượng các hạt có cùng khối lượng Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tínhvà xuất ra kết quả gọi là khối phổ

Công dụng

– Phân tách: GC-MS có thể phân tách các hỗn hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay trong nước Ở đây, tốc độ được quyết định bởi tính bay hơi Chất nào có tính bay hơi cao sẽ di chuyển nhanh hơn chất có tính bay hơi thấp

– Định lượng: GC-MS có thể định lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn, là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng GC-MS

• Nhận dạng:

Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết Nếu không tìm được chất tương ứng trong thư viện ,ta thu được một dữ liệu mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này.

2 Kết hợp sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ liên tiếp (MDLC-MS/MS)

• Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là

phương pháp được hiểu là mẫu được phân tách và tinh sạch qua sắc ký, sau đó mẫu được đưa qua máy khối phổ để tiếp tục xác định khối lượng nguyên tử của nó.

• Kết thúc quá trình ta thu được lượng mẫu

nhất định và cấu trúc phân tử đó

Ứng dụng

• Xác định protein

• Kiểm tra chất lượng nông sản, thực phẩn

chế biến, thức ăn gia súc và thủy hải sản: độc tố nấm mốc, vitamin, thành phần aa, phụ gia thực phẩm, chất hoạt động bề

mặt, dư lượng kháng sinh

(chloramphenicol, nitrofuran,

fluoroquinolone, họ tetracycline,

sulfamide…), dư lượng hormone kích

thích tăng trưởng đã bị cấm, vi sinh vật có hại, mầu bị cấm trong thực phẩm (các

loại Soudan), dư lượng thuốc trừ sâu.

• Khối phổ là phương pháp mang lại năng suất và độ chính xác cao trong quá trình nhận biết những protein đã phân tách bằng điện di 2 chiều.

• Protein được phân tách trên gel polyacrylamide sau đó được đưa vào máy khối phổ để phân tích.Các máy móc ngày nay có thể tự thực hiện các bước phân tích và cho phép chúng ta quan sát được những protein có mực độ lớn.

Sequence database

Tandem mass spectrum

Mass map

Tandem mass spectrometry

MALDI TOF

or

Gel-separated protein

Hình: Xác định protein thu được trong các mẩu sinh học.Protein từ mẩu có thể được

phân tách bằng điện di một hoặc hai chiều và protein được nhận dạng bằng cách sử dụng MALDI-TOF và đánh dấu khối peptide.Peptide thu được tại những vị trí đặc biệt của protein đã được phân tách trên gel polyacrylamide có thể được phân tách bằng cách sử dụng khối phổ tandem.Dữ liệu từ khối phổ tandem có thể được dùng

để tạo nên 1 cơ sở dữ liệu

• Xác định Protein

Có 2 cách chính trong khối phổ để xác định protein.

làm đầu vào để tìm kiếm trong CSDL của các khối đã biết trước

từ danh sách các protein đã biết Nếu một chuỗi protein trong danh sách tham khảo trùng khớp với giá trị thử nghiệm thì có lí

do để tin rằng protein đó có tồn tại trong mẫu gốc Tandem MS đang trở thành một phương pháp thử nghiệm phổ biến để xác định protein

để khởi tạo một tập các phân mảnh từ một ion peptit cụ thể Quá trình phân tách chủ yếu dựa vào các chế phẩm phân tách để bẻ gãy liên kết peptit Vì sự đơn giản của việc phân tách này, nó có thể dùng khối của các phân mảnh quan sát được để so trùng CSDL của các khối đã biết với một hay nhiều chuỗi peptit.