Giới thiệu chung về phương pháp khối phổ
2/13/12 1 KHỐI PHỔ MASS SPECTROMETRY KHÁI NIỆM Thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định MW của các hợp chất bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Từ đó có thể cho thông tin về cấu trúc phân tử Độ chính xác 99.99% (hợp chất sinh học) VAI TRÒ Xác định chính xác MW - Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu, xác định những biến đổi sau dịch mã, số lượng cầu nối S-S Kiểm soát phản ứng - Phản ứng enzyme, phản ứng thủy phân protein Giải trình tự amino acid, oligonucleotide … ỨNG DỤNG CNSH: phân tích protein, peptide, oligonucleotide Y dược: nghiên cứu thuốc: dược tính, cơ chế; Môi trường: chất lượng nước, an toàn thực phẩm … 2/13/12 2 NGUYÊN TẮC Các phân tử đã được ion hóa sẽ phân mảnh thành các mảnh có cấu trúc khác nhau có thể tách bằng tỷ số giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của chúng trên cơ sở từ trường và điện trường CẤU TẠO KHỐI PHỔ Nguồn ion hóa ! Thiết bị phân tích ! Detector (ionisaton source) (analyser) Nguồn ion hóa Một số kỹ thuật ion hóa thông dụng: • Ion hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI) • Ion hóa hóa học (CI) • Bắn phá ion/nguyên tử nhanh (FAB) • Ion hóa theo cơ chế giải hấp sử dụng nguồn laser với sự trợ giúp nền (MALDI) • Ion hóa phun điện tích (ESI) ION HÓA TRÊN CƠ SỞ VA ĐẬP ĐIỆN TỬ (Electron Impact – EI) M + e - ! M + + 2 e – - Tạo e: sợi dây nhiệt gia tăng bằng 1 trường điện từ (70V) - Các e (70 eV) chuyển 1 phần năng lượng động học của chúng cho M ! ion hóa (tách e từ M) TÁCH e TỪ PHÂN TỬ TRUNG HÒA 2/13/12 3 Quá trình phân mảnh: M + -> ion phân tử + các mảnh ion + các mảnh không tích điện Ưu nhược điểm của EI ƯU ĐIỂM NHƯỢC ĐIỂM - Độ nhạy cỡ pico mol - Các dữ liệu phổ đã có sẵn (> 100.000 hợp chất) - Thông tin về cấu trúc nhận được từ kiểu phân mảnh - Khoảng khối lượng phân tích hạn chế (< 400 Da) - Chỉ áp dụng với mẫu bay hơi - Phân mảnh quá nhiều, không quan sát được ion phân tử Ion hóa hóa học (Chemical Ionization) • Sử dụng chùm electron làm nguồn ion hóa • Nguyên tắc: tương tác ion – phân tử giữa các ion khí và phân tử mẫu trung hòa ở áp suất cao • Chùm e ion hóa các phân tử khí (ít ion hóa mẫu) • Tương tác ion - phân tử ! ion hóa mẫu • Ion phân tử được tạo thành bền, ít phân mảnh Cơ chế CH4 + e- ! [CH4]+ + 2e- [CH4]+ + CH4 ! [CH5]+ + [CH3]+ [CH3]+ + CH4 ! [C2H5]+ + H2 … [CH5]+ và [C2H5]+ đóng vai trò như các acid và cho phân tử mẫu proton [CH5]+ + M ! [MH]+ + CH4 [C2H5]+ + M ! [MH]+ + C2H4 2/13/12 4 Một số tác nhân khí thường được sử dụng: Metan, propan, isobutan, H 2 , NH 3 , He,… Bắn phá ion/nguyên tử nhanh (Fast Atom/Ion Bombardment – FAB) Mẫu được bắn phá bằng 1 nguồn năng lượng cao (chùm nguyên tử Xenon, ion Cs+, nền tẩm Glyceryl-NH4+) Dung môi: không bay hơi, hòa tan được mẫu (rượu m-nitrobenzyl, glyceryl) Mẫu tích điện bằng cách phản ứng với các phân tử và ion khác Ưu điểm Nhược điểm Khối lượng phân tích ~7KDa Phân tích nhanh Tạo ion phân tử ít phân mảnh Chỉ nhạy với các phân tử có MW lớn Pico mol – nanomol Thông tin về cấu trúc thu được rất hạn chế Mẫu phải tan trong dung môi Không hiệu quả với chất không phân cực, không tích điện 2/13/12 5 Ion hóa theo cơ chế giải hấp sử dụng nguồn laser với sự trợ giúp nền (Matrix-asisted Laser Desorption/ Ionization MS – MALDI/MS) Phân tích các hợp chất có MW lớn, không bay hơi (protein, peptide, glycoprotein,…) Ion hóa và chuyển mẫu từ pha mẫu lỏng vào pha khí • FAB: nguyên tử/chùm ion, nền mẫu: dung môi lỏng • MALDI: nguồn laser, nền mẫu: chất rắn Chiếu chùm laser vào mẫu đã được trộn hay hòa tan chất nền Vai trò chất nền: hấp thụ năng lượng laser và tạo ra sản phẩm dễ bay hơi Phân tử không tích điện phản ứng với nền hoặc các phân tử khác ! hợp phần tích điện Nền mẫu: gắn kết với các phân tử mẫu cần quan tâm được tẩm trên 1 đế làm bằng vật liệu rắn không bay hơi Nhờ sự chiếu xạ, nền mẫu được bay hơi và kéo theo sự bay hơi của các phân tử mẫu kèm theo nền Nền hấp thụ phần lớn năng lượng để bảo vệ mẫu không bị phá hủy bởi laser Ưu điểm Nhược điểm MW ~300KDa Femtomol – picomol Ít hoặc không phân mảnh Phân tích mẫu phức tạp … Độ phân giải thấp Nền mẫu gây khó khăn khi phân tích các hợp chất có MW < 1KDa 2/13/12 6 Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI) Tạo các phân tử ion hóa pha khí từ các dd lỏng Dung dịch mẫu được phun trong vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở 4000V Phân tích các phân tử phân cực Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI) Tạo ra dòng phun mịn của các giọt nhỏ tích điện cao dưới 1 trường điện từ Các giọt nhỏ trước khi đi vào thiết bị phân tích sẽ được kết hợp với dòng khí khô hoặc nhiệt để làm bay hơi dung môi Cơ chế ion hóa Loại bỏ electron Proton hóa Cation hóa Đề proton hóa Chuyển các phân tử tích điện vào pha khí Bắt giữ electron Loại bỏ electron Phân tích các hợp chất có MW thấp không phân cực EI, FAB, MALDI 2/13/12 7 Proton hóa Thêm 1 proton vào phân tử FAB, ESI, MALDI Cation hóa Thêm 1 ion tích điện dương (cation) vào 1 phân tử trung hòa để tạo 1 phức tích điện Hiệu quả với các phân tử không bền khi proton hóa ESI, MALDI, FAB Đề proton hóa Loại bỏ 1 proton FAB, MALDI, ESI Chuyển phân tử tích điện vào pha khí Chuyển các phân tử tích điện trong dung dịch vào pha khí FAB, MALDI, ESI 2/13/12 8 Bắt giữ electron Hấp thụ hoặc bắt giữ electron để tạo phân tử tích điện âm Sử dụng cho các phân tử có ái lực e cao (halogen) EI, FAB, MALDI Thiết bị phân tích khối lượng • Thiết bị phân tích tứ cực (quadrupole) • Bẫy ion tứ cực (quadrupole ion traps) • Thiết bị phân tích khối lượng sử dụng từ trường (magnetic sector) • Phân tích thời gian bay (time-of-flight - TOF) • Thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ electron (time-of-flight reflectron) • Cộng hưởng gia tốc ion chuyển hóa Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance – FT-ICR) phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. Thiết bị phân tích khối lượng • Thiết bị phân tích tứ cực (quadrupole) Các ion chuyển động trong trường điện từ sẽ dao động phụ thuộc vào tỷ số giữa m/z và trường RF phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. 2/13/12 9 Thiết bị phân tích khối lượng • Bẫy ion tứ cực (quadrupole ion traps) phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. Thiết bị phân tích khối lượng • Thiết bị phân tích khối lượng sử dụng từ trường (magnetic sector) phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. Thiết bị phân tích khối lượng • Phân tích thời gian bay (time-of-flight – TOF) phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. Thiết bị phân tích khối lượng • Thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ electron (time- of-flight reflectron) phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. 2/13/12 10 Thiết bị phân tích khối lượng • Cộng hưởng gia tốc ion chuyển hóa Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance – FT-ICR) phân tách các ion trên cơ sở tỷ số m/z. DETECTOR Kiểm soát và khuếch đại tín hiệu dòng ion Chuyển tín hiệu đến hệ thống dữ liệu Các detector hay sử dụng • Cốc Faraday • Thiết bị nhân electron • Dinôt chuyển hóa nhân quang (thiết bị đếm tín hiệu hay detector Daly) • Detector dinôt năng lượng cao (high energy dynode detector: HED) • Detector chuỗi