Phương Pháp Điện Di

Giới thiệu chung về phương pháp điện di

[...]... 5.2 Điện di trong điều kiện tự nhiên •  Điện di với hệ thống bất liên tục – Áp dụng với các mẫu protein hòa tan và không bị kết tủa trong quá trình điện di – Môi trường điện di có pH bất liên tục, gồm 2 lớp gel khác nhau có pH ban đầu hoàn toàn khác nhau, được đặt liền kề nhau 6 Điện di hội tụ (Isoelectric focusing, IEF) •  Điểm đẳng điện (isoelectric point, pI): giá trị pH mà protein không còn điện. .. 7.1 Nguyên tắc – Protein được tách theo chiều thứ nhất bằng điện di đo điểm đẳng điện (dựa vào sự khác biệt về giá trị điểm đẳng điện) và chiều thứ 2 bằng SDS-PAGE (dựa vào sự khác biệt về MW) •  Điện di đo điểm đẳng điện (IMF): gel có dạng hình cái que –  Mẫu phân tích được đặt lên 1 đầu que, mỗi que chứa 1 mẫu, điện di nhiều que 1 lúc •  Điện di SDS-PAGE: –  Các que gel được thụt tuột ra khỏi ống chứa,... một protein được đặt vào bản gel gradient pH, protein này di chuyển về vị trí pI của nó •  Nếu protein ở trong môi trường có pH cao hơn giá trị pI của nó, protein có điện tích toàn phần là điện tích âm, và di chuyển về phía anod và ngược lại •  Chỉ ở môi trường pH = pI, protein có điện tích toàn phần = 0 (zero net charge) và không di chuyển trong điện trường 7 Điện di SDS-PAGE 2 D 7.1 Nguyên tắc – Protein... gradient pH ổn định –  Sử dụng chất điện ly lưỡng tính: hợp chất tổng hợp, sản phẩm của sự polymer hóa các loại acid oligoamino (-NH2) oligocarboxylic (COOH) có MW nhỏ –  Trộn các hợp chất điện ly khác nhau (không có sự hiện di n của điện trường): hỗn hợp chỉ có 1 pH duy nhất –  Khi có dòng điện, từng chất riêng lẻ di chuyển đến vị trí pI của nó à chúng hoạt động như dung dịch đệm và có pH gradient... ở phần lớp gel chuẩn bị của một tấm gel SDS-PAGE 8 Hiện hình bản gel •  sau khi điện di, bản gel cần được làm cố định, nghĩa là làm cho các protein kết tủa, cố định trên bản gel và đồng thời loại bỏ những thành phần không phải là protein vì các thành phần này có thể gây trở ngại cho quá trình hiện hình bản gel •  Phương pháp cố định tốt nhất: ngâm bản gel trong dung dịch 10 – 20% w/v acid trichloroacetic... thể đa dòng (polyclonal antibody): một số epitope hiện di n trên bề mặt của 1 antigen •  Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody, Mab): 1 epitope hiện di n trên 1 antigen 16 2/13/12 9.1 (tt) •  Sử dụng lượng thừa Ag hoặc Ab, sau khi nhuộm màu phức tạo thành giữa Ag-Ab à đo nồng độ của Ag hoặc Ab 9.2 Nguyên tắc •  •  •  •  Tách chiết protein điện di Chuyển lên màng lai Rửa màng lai với “dung dịch khóa”... loại bạc tại các vùng có sự hiện di n của protein hoặc DNA tạo thành vùng màu đen •  Ưu điểm: –  Độ nhạy cao gấp 20 – 200 lần so với CBB (0.05 – 0.1ng protein/mm2 gel, có thể phát hiện các protein ở lượng vết •  Nhược điểm –  Các protein như Ig dây ngắn cho hiện màu rất kém –  Đắt tiền, tốn nhiều thời gian 9 Western blotting •  Kỹ thuật điện thấm (electroblotting): áp dụng điện trường vuông góc với bản... focusing, IEF) •  Điểm đẳng điện (isoelectric point, pI): giá trị pH mà protein không còn điện tích 11 2/13/12 6 (tt) 6 (tt) Giá trị điểm đẳng điện của một số protein Protein Pepsin Pepsinogen ovalbumin Bovine serum albumin urease pI 1.0 2.8 4.6 4.9 5.0 6 (tt) Điện di hội tụ có pH tuyến tính nhờ các chất bất động •  Sử dụng những hợp chất là dẫn xuất của acrylamide (CH2=CH-CONH2, chất bất động), trong... que gel được thụt tuột ra khỏi ống chứa, rồi đặt lên trên 1 tấm agarose ấm –  Khi agarose nguội, que gel đã gắn dính vào tấm agarose –  Tấm agarose được đặt nằm ngang, phía trên đầu gel SDS-PAGE –  Điện di SDS-PAGE theo chiều có góc 90o so với chiều thực hiện IEF 13 2/13/12 7.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG SDS – PAGE 2 CHIỀU •  Thực hiện IEF trên tấm gel đặt trong hình ống trụ làm bằng thủy tinh, đường... giữa vùng biến đổi (variable region) của kháng thể và epitope (vùng đặc biệt ở trên kháng nguyên) của kháng nguyên •  Các epitope khác nhau trong những cấu trúc protein có thể nhận di n bởi các Ab đặc trưng – PAb: nhận di n nhiều epitope trong cùng 1 Ag – MAb: nhận ra 1 epitope 9.1 Kháng nguyên và kháng thể •  Kháng nguyên: các chất miễn dịch – Hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ (các phân tử đường)