Đặc điểm hình thái và hoạt tính một số enzyme ngoại bào của các mẫu nấm sợi phân lập được tại Hà Nội

Đặc điểm hình thái và hoạt tính một số enzyme ngoại bào của các mẫu nấm sợi phân lập được tại Hà Nội

Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2009: Tp VII, s 1: 10-16 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI 10 ĐặC ĐIểM HìNH THáI V HOạT TíNH MộT Số ENZYME NGOạI BO CủA CáC MẫU NấM SợI PHÂN LậP ĐƯợC TạI H NộI Morphological Characteristics and Enzymatic Activity of Some Fungal Isolates Collected in Hanoi Phan Trng Nht Khoa Cụng ngh sinh hc, Trng i hc Nụng nghip H Ni TểM TT Mi sỏu mu nm si c phõn lp t 30 mu t ly t cỏc t mi cht vựng H Ni. Da vo cỏc c im hỡnh thỏi nh mu sc, hỡnh dng v kớch thc ca cỏc khun lc cng nh bo t la chn ra 5 chng c trng, kớ hiu l M1, M6, M9, M13 v M16. Dch lc thụ ca 5 mu nm si t cỏc mụi trng nuụi lc c th cỏc hot tớnh enzyme ngoi bo nh kitinaza, proteaza v xenlulaza. Kt qu th nghim cho thy mu nm M16 cú kh nng sinh enzyme ngoi bo kitinaza cao nht. Hiu lc dit mi trc tip ca bo t 5 mu nm si cng c xỏc nh l liu lng 0,005 gam bo t/100 cỏ th mi, c 5 mu nm si u cho hiu lc dit mi t 100% sau 4 ngy thớ nghim. T khoỏ: Bo t, khun lc, Metarhizium, mi Coptotermes, nm si, tn nm. SUMMARY Sixteen fungal isolates were isolated from 30 soil samples collected from dead termite colonies in Hanoi. Based on morphological characteristics such as colour, shape and dimension of colonies and spores, five representative isolates designated as M1, M6, M9, M13 and M16 were selected. The filtrates obtained from culture media of these 5 isolates were tested for enzymatic activity of chitinase, protease and cellulase. The isolate M16 exhibited the highest activity of chitinase. The ability of direct control of fungal spores again termites was also tested. The results showed that at a dose of 0.005 g spores/100 termites individuals of the 5 isolates could exterminate 100% termites after 4 days of treatment. Key words: Colony, Coptotermes, fungi, Metarhizium, spore. 1. ĐặT VấN Đề Từ những năm 80 của thế kỷ XIX, một số bệnh do nấm sợi gây ra trên côn trùng cánh cứng hại lúa mỳ v sâu non bọ đầu di hại củ cải đờng đã đợc nh khoa học Nga Metsnhicov nghiên cứu v phát hiện. Cho tới những thập kỷ gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về nấm sợi đã xác định đợc khoảng 700 loi nấm gây bệnh cho các loại côn trùng khác nhau. Trong các loi nấm sợi thì Beauveria v Metarhizium đợc xác định l mầm bệnh nguy hiểm của hơn 200 loi côn trùng nh: mối đất, châu chấu, bọ ngô đầu đỏ ở Mỹ, Đi Loan, Nam Phi, Austraylia (Tsai v cộng sự, 1992; Nasr v Moein, 1997). ở Việt Nam, năm 1996, Tạ Kim Chỉnh khi thử nghiệm nấm sợi Metarhizium trên mối Coptotermes formosanus cho thấy mối chết do nấm sau 3 ngy đạt 91,35% ở nồng độ 18 x 107bt/ml (Tạ Kim Chỉnh, 1996). Nguyễn Dơng Khuê v cộng sự (1998) tại Viện Khoa học Lâm nghiệp đã thử nghiệm bo tử nấm Metarhizium để diệt mối Coptotermes formosanus trong điều kiện phòng thí nghiệm. c im hỡnh thỏi v hot tớnh mt s enzyme ngoi bo . 11 Kết quả cho thấy mối chết 76,2% sau 2 tuần phun v 94,4 % sau 3 tuần phun. Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh v cộng sự (2001) ở Trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối đã tuyển chọn đợc nhiều chủng nấm Metarhizium có khả năng gây chết mối trong điều kiện phòng thí nghiệm với hm lợng bo tử thích hợp l 0,005g/100 cá thể mối. Phạm Thị Thuỳ v cộng sự (2002) đã sử dụng nấm Metarhizium để phòng trừ bọ dừa (Brontispa sp.) ở Bến Tre v kết quả cho thấy khả năng phòng trừ đạt 78% sau 7 ngy phun. Mục đích nghiên cứu ny l tiến hnh phân lập các nấm sợi từ các mẫu đất thu đợc tại vùng H Nội, phân tích các đặc điểm hình thái v hoạt tính enzyme ngoại bo của chúng. Sau đó thử nghiệm khả năng gây bệnh cho một số loi côn trùng gây hại trong nông nghiệp nhằm cung cấp một nguồn thuốc sinh học phục vụ công tác trồng rau sạch nói chung v bảo vệ cây trồng trong tơng lai. 2. VậT LIệU V PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 30 mẫu đất đợc thu thập tại các điểm trên địa bn H Nội. Môi trờng Czapek_Dox: C12H22O11: 30,0 g, NaNO3: 2,0 g, C3H7MgO6P: 0,5 g, KCl: 0,5 g, K2SO4: 0,35 g, FeSO4.7H2O: 0,01 g, C11H12Cl2N2O5: 0,5 g, Thạch: 15,0 g, pH: 6,8 0,2. Môi trờng Sauboraud: Pepton cazein: 5,0 g, Pepton thịt: 5,0 g, Đờng glucoza: 40,0 g, Chất kháng sinh chloramphenicol: 0,5 g, Thạch: 15,0 g, pH: 5,6 0,2. 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập nấm sợi từ các mẫu đất Các mẫu nấm sợi đợc phân lập trên môi trờng Sauboraud v Czapek - Dox, có bổ sung chất kháng sinh chloramphenicol, để ngăn không cho các loại vi khuẩn phát triển, theo phơng pháp pha loãng (Nguyễn Lân Dũng v cộng sự, 1978). 2.2.2. Phơng pháp xác định số lợng bo tử trần bằng đếm trực tiếp dới kính hiển vi Số lợng bo tử trần của các mẫu nấm sợi đợc xác định theo hai phơng pháp đếm l phơng pháp đếm trực tiếp v phơng pháp đếm khuẩn lạc. Đếm số lợng bo tử trên buồng đếm hồng cầu có 25 ô lớn, khoảng trống giữa phiến kính v lá kính có chiều cao 0,02 mm, tổng diện tích l 1 mm2, tổng thể tích l 0,02 mm3. Nh vậy 1 cm3 (1 ml) sẽ ứng với 5 x 104 lần thể tích buồng đếm. Đếm số lợng bo tử có trong vi ô lớn, tính giá trị trung bình (a), gọi K l độ pha loãng. Khi đó số lợng bo tử đợc xác định theo công thức sau: Số bo tử/ml = a ì 25 ì 5 ì 104 ì 1/K 2.2.3. Phơng pháp xác định số lợng bo tử trần bằng đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch Để xác định tổng số tế bo có trong một đơn vị thể tích ngời ta thờng dùng thuật ngữ Đơn vị hình thnh khuẩn lạc trong một đơn vị thể tích (CFU/v - Conoly Forming Unit/v). Trừ những đĩa khuẩn lạc dầy đặc không đếm đợc chỉ lấy các đĩa m khuẩn lạc có đơn vị đo trong khoảng 30 CFU - 300 CFU. Từ số khuẩn lạc trên đĩa có thể suy ra số tế bo (CFU) có trong mẫu vật theo công thức dới đây, trong đó a: số khuẩn lạc trung bình; V: thể tích dịch pha loãng; K: độ pha loãng của dịch cấy. CFU/ml = a ì 1/K ì 1/v 2.2.4. Phơng pháp chiết tách v thử hoạt tính enzyme ngoại bo Các enzyme ngoại bo đợc thử hoạt tính theo phơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Hoạt tính phân giải cơ chất đợc tính bằng hiệu số D - d (mm) trong đó D l đờng Phan Trng Nht 12 kính vòng phân giải (mm) v d l đờng kính lỗ khoan (mm). 2.2.5. Phơng pháp thử khả năng diệt mối trực tiếp của các mẫu nấm sợi Sau khi tuyển chọn, xác định các đặc điểm hình thái, số lợng bo tử v hoạt tính của các enzyme ngoại bo của 5 mẫu nấm sợi, chúng tôi tiến hnh thử khả năng diệt mối trực tiếp của 5 mẫu nấm sợi ny. Thí nghiệm đợc tiến hnh trên đĩa petri với 100 cá thể mối (90% mối thợ, 10% mối lính) nuôi trên giấy lọc. Rắc 0,005g bo tử của từng chủng lên từng đĩa thí nghiệm. Hm lợng ny theo các nghiên cứu trớc (Tạ Kim Chỉnh, 1999; Trịnh Văn Hạnh v cộng sự, 2001) đã chỉ ra l thích hợp nhất khi thử trực tiếp trên 100 cá thể mối. Mối thí nghiệm ở các lô đối chứng không rắc bo tử m rắc bột đất. Theo dõi sự hoạt động của các cá thể mối theo từng ngy. 3. KếT QUả V THảO LUậN 3.1. Phân lập, tuyển chọn các mẫu nấm sợi 16 mẫu nấm sợi thu đợc từ phân lập 30 mẫu đất của các tổ mối chết trên địa bn H Nội. Các tản nấm có các mu sắc khác nhau nh trắng, xanh, vng, đen nâu v xanh lục. Từ đó, 5 mẫu đại diện đợc chọn để tiến hnh các thí nghiệm tiếp theo. Năm mẫu ny đợc ký hiệu l M1, M6, M9, M13 v M16. 3.2. Đặc điểm nuôi cấy v hình thái của 5 mẫu nấm sợi (Bảng 1) Cả năm mẫu nấm sợi M1, M6, M9, M13, M16 đều có hình dạng bo tử hình elip. Hình dạng bo tử của cả 5 mẫu nấm sợi ny đều giống với hình dạng bo tử của nấm Metarhizium (Ine, 1999; Kimberly, 2004). Kết quả quan sát mu sắc tản nấm cũng cho thấy sự tơng đồng với mu sắc có thể có của tản nấm Metarhizium (Tạ Kim Chỉnh, 1996; Ine, 1999). Mu sắc mặt sau của tản nấm có mu vng nâu, trắng ng hay xanh vng, các đặc điểm không thấy mô tả ở các ti liệu nghiên cứu về Metarhizium. Ngoi ra, ba mẫu M1, M6, M9 có những đặc điểm gần giống với nhau về mu sắc tản nấm, tốc độ sinh trởng. Bo tử của 3 mẫu ny đều có bề mặt nhăn, song mu sắc của chúng lại khác nhau. Mặt khác, hai mẫu M13, M16 lại có bề mặt bo tử mịn v mu sắc bo tử giống nhau, khác 3 mẫu đầu tiên. Kích thớc tản nấm đo đợc sau 10 ngy nuôi cấy của các mẫu M1, M6 v M16 đạt cao nhất (8,0 cm), sau l mẫu M9 (7,9 cm), v thấp nhất l mẫu M13 (7,2 cm). Hình ảnh của tản nấm của các mẫu nấm sợi đợc mô tả rõ ở hình 1. Bảng 1. Đặc điểm nuôi cấy v hình thái của 5 mẫu nấm sợi c im nuụi cy (trong 10 ngy) c im hỡnh thỏi bo t trn (sau 4 ngy) Mu Mu sc tn nm Mu sc mt sau tn nm Tc sinh trng ng kớnh tn nm (cm) B mt bo t Mu sc bo t trn M 1 Nõu en Vng nõu Mc nhanh 8,0 Nhn Vng rm M 6 Nõu en Vng nõu Mc chm 8,0 Nhn Vng nht M 9 en Vng nõu Mc chm 7,9 Nhn Nõu sm M 13 Xanh rờu Trng ng Mc nhanh 7,2 Mn Xanh xỏm M 16 Xanh sm Xanh vng Mc chm 8,0 Mn Xanh xỏm c im hỡnh thỏi v hot tớnh mt s enzyme ngoi bo . 13 Hình 1. Tản nấm của 5 mẫu nấm sợi M1 (a), M6 (b), M9 (c), M13 (d) v M16 (e) sau 10 ngy nuôi cấy v hình dạng bo tử của mẫu nấm sợi M16 (f) 3.3. Xác định số lợng bo tử trần của 5 mẫu nấm sợi Kết quả của phơng pháp đếm khuẩn lạc đợc quan tâm nhiều hơn vì phơng pháp ny xác định đợc số bo tử sống m khả năng ký sinh gây bệnh của nấm sợi phụ thuộc vo khả năng nảy mầm của bo tử sống. Số lợng bo tử của các mẫu nấm sợi rất khác nhau: chủng M16 l chủng có số bo tử lớn nhất, thứ hai l chủng M9 còn chủng có số lợng bo tử ít nhất l chủng M6 (Bảng 2). Tuy nhiên, số lợng bo tử ở cả 5 chủng đều dao động trong khoảng từ 77x 108 đến 312 x 108 bo tử/g. Sự sai khác về số lợng bo tử có thể l do sự khác nhau về khả năng sinh bo tử giữa chúng. 3.4. Khả năng hình thnh một số enzyme ngoại bo của 5 mẫu nấm sợi Khả năng sinh enzyme ngoại bo l một trong các yếu tố quan trọng quyết định đến khả năng gây bệnh của nấm sợi trên các đối tợng côn trùng khác nhau. Sau 3 ngy nuôi cấy, khả năng sinh các enzyme ngoại bo kitinaza, proteaza v xenlulaza của năm mẫu nấm sợi thể hiện rõ (Bảng 3). Cả 5 chủng nấm sợi đều sinh ra 3 loại enzyme ngoại bo (kitinaza, proteaza, cellulaza) với hoạt tính khác nhau. Kitinaza đợc sinh ra nhiều nhất ở cả năm mẫu nấm sợi. Vòng phân giải đo đợc cao nhất ở mẫu M16 v thấp nhất ở mẫu M1 v M9. Sự khác nhau ny có thể đợc giải thích l do các mẫu nấm sợi ny đợc phân lập tại các nguồn mẫu khác nhau nên có các điều kiện ngoại cảnh khác nhau ảnh hởng đến khả năng sinh enzyme ngoại bo, nhng sự khác nhau ny không phải l quá nhiều. Kitinaza đợc sinh ra nhiều hơn proteaza v xenlulaza có thể l do các mẫu nấm sợi ny đều đợc phân lập từ mẫu đất lấy tại tổ mối chết nên khả năng sinh enzyme ny l cao nhất. Proteaza cũng đợc sinh ra ở cả 5 mẫu nấm với hoạt tính gần nh l tơng đơng nhau, không có sự khác biệt nhiều ở các mẫu nấm khác nhau. Điều ny có thể đợc giải thích l enzyme proteaza chỉ đợc sinh ra sau khi sợi nấm đã xuyên đợc qua cơ thể côn trùng rồi, khi đó proteaza đợc sinh ra để phân huỷ các cơ quan nội tạng của côn trùng với thnh phần chủ yếu l proteaza. Xenlulaza đợc sinh ra có sự khác nhau rõ rệt giữa các mẫu nấm. Cao nhất vẫn l ở mẫu M16 v thấp nhất l ở mẫu M13. Các thử nghiệm đo hoạt tính của enzyme ngoại bo mới chỉ đợc thực hiện từ dịch nuôi cấy thô nên mới chỉ xác định đợc khả năng sinh enzyme ngoại bo một cách tơng đối, để có các kết luận chính xác v cụ thể hơn thì cần phải tinh sạch v xác định đơn vị hoạt động của từng enzyme ny. Phan Trọng Nhật 14 B¶ng 2. Sè l−îng bμo tö cña 5 mÉu nÊm sîi Số lượng bào tử/gam x 108 Mẫu Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp đếm trực tiếp M1 102 ± 28 130 ± 36 M6 77 ± 21 96 ± 25 M9 268± 36 290± 38 M13 126 ± 47 159 ± 52 M16 312 ± 29 373 ± 34 B¶ng 3. Ho¹t tÝnh mét sè enzyme ngo¹i bμo cña 5 mÉu nÊm sîi Hoạt tính enzyme ngoại bào (mm) Mẫu Kitinaza Proteaza Xenlulaza M1 11 10 5 M6 12 12 5 M9 11 12 6 M13 12 12 4 M16 13 12 10 020406080100Tỷ lệ (%) mối chết1234NgàyHiệu lực diệt mối của 5 mẫu nấm sợiM1M6M9M13M16ĐCH×nh 2. HiÖu lùc diÖt mèi cña 5 mÉu nÊm sîi c im hỡnh thỏi v hot tớnh mt s enzyme ngoi bo . 15 3.5. Khả năng diệt mối của 5 mẫu nấm sợi Sau 1 ngy rắc bo tử ở các lô thí nghiệm tỷ lệ mối chết lần lợt l 18%; 16%; 15%; 37,5%, 18% v 30% tơng ứng với 5 chủng. Còn ở các lô đối chứng tỷ lệ mối chết không đáng kể chỉ 1%. Có thể giải thích nguyên nhân gây chết mối ngy thứ nhất l do độc tố destrucxin mới bắt đầu đợc vi nấm tiết ra, các loại enzyme ngoại bo lúc ny cha đợc tiết ra (Tạ Kim Chỉnh, 1999). Sau ngy thứ 2, tỷ lệ mối chết tăng rất nhanh, cao nhất ở chủng M4 đạt đến 67%, 70%, 65%, 62% v 78% tơng ứng với các chủng. Còn ở các lô đối chứng tỷ lệ mối chết cao nhất cũng chỉ đạt 2%. Sau 3 ngy, tỷ lệ mối chết ở cả 5 lô thí nghiệm đều đạt xấp xỉ 100%, trong khi tỷ lệ mối chết do chủng M16 đạt 100. Có thể giải thích l do đến ngy thứ 3 lợng enzyme ngoại bo nh kitinaza, xenlulaza, proteaza đợc nấm sợi tiết ra nhiều nhất v các độc tố destrucxin A, B vẫn đợc tiết ra do đó gây chết đồng thời hng loạt các cá thể mối. ở lô đối chứng, lợng mối chết l 4%. Sang đến ngy thí nghiệm thứ 4 thì 100% các cá thể mối ở tất cả các lô thí nghiệm đều chết, những cá thể mối chết cuối cùng đều l các cá thể mối lính. Một giả thiết khác đợc đa ra l các cá thể mối chết ngoi con đờng xâm nhập qua lớp vỏ kitin thì còn bị chết qua đờng miệng. Tức l các cá thể mối ăn bo tử vi nấm vo ruột, từ đó bo tử nảy mầm v gây chết mối. Có thể giải thích l do các cá thể mối lính phải đợc mớm thức ăn từ các cá thể mối thợ v các cá thể mối lính đều khoẻ hơn mối thợ nên có thể chịu đợc trong thời gian lâu hơn. Trong nghiên cứu ny, hiệu lực diệt mối mới đợc thử trực tiếp từ các mẫu nấm sợi. Để kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học hơn, hiệu lực diệt mối của các mẫu nấm ny cần đợc thử nghiệm trên mô hình hộp lây nhiễm v với số lợng nhiều cá thể hơn nữa. Mặt khác, các mẫu nấm ny cần đợc thử để đánh giá khả năng diệt các loại côn trùng khác nh sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh . thì mới đánh giá chính xác v hiệu quả hơn của chúng trong việc áp dụng diệt trừ côn trùng. Có nh vậy ý nghĩa trong việc phòng trừ các loi côn trùng gây hại của các mẫu nấm sợi ny sẽ cao hơn. 4. KếT LUậN M1, M6, M9, M13 v M16 l 5 mẫu nấm sợi đợc phân lập từ 30 mẫu đất thu tại các tổ mối chết tại khu vực H Nội. Năm mẫu nấm sợi ny có nhiều đặc điểm đặc điểm hình thái, tản nấm giống nh nấm Metarhizium, chi nấm sợi có phổ diệt côn trùng rất rộng. Cả 5 mẫu nấm sợi đều có khả năng sinh các enzyme ngoại bo kitinaza, xenlulaza v proteaza. Enzyme ngoại bo kitinaza đợc sinh ra nhiều nhất bởi mẫu M16. Cả 5 mẫu nấm sợi phân lập đợc đều có khả năng diệt mối trực tiếp, trong đó chủng M16 có hiệu lực diệt mối cao nhất. ở liều lợng 0,005g bo tử/100 cá thể mối hiệu lực diệt mối 100% chỉ sau 3 ngy thí nghiệm. Lời cảm ơn Nghiên cứu l một phần nội dung của đề ti khoa học cấp Bộ "Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium hiệu lực cao nhằm phòng trừ một số loi côn trùng gây hại nông nghiệp". Kinh phí do Bộ Giáo dục v Đo tạo cấp. TI LIệU THAM KHảO Tạ Kim Chỉnh (1996). Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại ở Việt Nam v khả năng ứng dụng. Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lơng, Đon Xuân Mợn, Phạm Văn Ty (1978). Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3. NXB Khoa học Kỹ thuật. Phan Trng Nht 16 Nguyễn Dơng Khuê v cộng tác viên (2001). Thử nghiệm dùng vi nấm Metarhizium cho phòng trừ mối nh. Tạp chí Nông nghiệp v Phát triển nông thôn số 5/2001. Trịnh Văn Hạnh, Võ Thu Hiền, Phan Trọng Nhật (2001). Nghiên cứu khả năng gây chết loi mối Coptotermes formosanus bởi bo tử của một số chủng Metarhizium. Tuyển tập kết quả khoa học v công nghệ 1999 - 2000, Viện Khoa học Thuỷ lợi. NXB Nông nghiệp, tr 261 265. Nasr, F. N. and Moein, S. I. M (1997). New trend of the use of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sokorin and Verticillium indicum (Petch) Gams as entomopathogens to the termite Cryptotermes brevi (Walker) (Isoptera: Kalotermitidae). Anz, Schadlingskde., Pflanzenschutz, Umweltschutz 70: 13 - 16. Ine Stolz (1999). The effect of Metarhizium anisopliae (Mestch.) Sorokin (=flavoride) Gams and Rozsypal var. acridum (Deuteromycotina: Hyphomycetes) on non-target Hymenoptera. PhD Thesis, Basel University (Germany). Kimberly M. E (2004). Effects of multiple generations of Metarhizium anisopliae on subterranean termite feeding and mortality. Master thesis, Texas A&M University (USA). Tsai, Y. S., C. W. Kao., R. E. Hou (1992). Effect of insecticedes on the virulence of the green muscardine fungus Metarhizium anisopliae var. anisopliae againts the beetle Armywom Spodoptera exigua. Bull. Plant Protection (Taipei). 34: 26 - 216. . TRNG I HC NễNG NGHIP H NI 10 ĐặC ĐIểM HìNH THáI V HOạT TíNH MộT Số ENZYME NGOạI BO CủA CáC MẫU NấM SợI PHÂN LậP ĐƯợC TạI H NộI Morphological Characteristics. cứu ny l tiến hnh phân lập các nấm sợi từ các mẫu đất thu đợc tại vùng H Nội, phân tích các đặc điểm hình thái v hoạt tính enzyme ngoại bo của chúng. Sau