nuôi cấy lát mỏng potx

 Nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một phương pháp cho nhiều ưu thế hơn so với những phương pháp nhân giống in vitro truyền thống khác và được ứng dụng thành công trên nhiều loài cây khác n

cấy invitro, phương pháp thủy canh

Nhóm thực hiện:

Nguyễn Tiến Chiến

Phạm Thanh Huyền

Võ Tiến Diễn

I.  Sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng của

giống điều

1. M  Đ UỞ Ầ

 Cây điều là cây công nghiệp đem lại hiệu quả kinh tế cao ở một số nước thuộc vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi do nhân hạt điều có giá trị cao

trong xuất khẩu

 Thông thường cây được nhân giống từ hạt, nhưng phương pháp này đem lại tính không đồng nhất về di truyền

 Các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống như giâm cành, ghép cành thường được sử dụng để nhân các dòng điều có năng suất cao, tuy nhiên hệ

số nhân giống không đáp ứng được nhu cầu.

 Nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một phương pháp cho nhiều ưu thế hơn so với

những phương pháp nhân giống in vitro truyền thống khác và được ứng dụng

thành công trên nhiều loài cây khác nhau

 Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở cây thân

gỗ chưa được công bố nhiều.

2 Vật liệu và phương pháp

a Vật liệu:

- Mẫu nuôi cấy là hạt trưởng thành của giống điều cao sản BO1

b Phương pháp:

- Hạt được khử trùng bằng dung dịch NaOCl với nồng độ 1%

trong 24 giờ, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần

- Cây mầm phát triển từ hạt nuôi cấy trên môi trường khoáng MS

không có đường và vitamin sau 2 tuần được dùng làm nguyên liệu cho thí nghiệm.

- Lớp mỏng cắt ngang từ 2 loại vật liệu là đốt tử diệp và đốt

thân của cây mầm (có bề dày khoảng 0,3-0,5mm) được cấy trên các đĩa petri (Ф = 10cm) chứa 20ml môi trường.

­ Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung nước dừa

10%, adenine sulphate 40mg/L, saccharose 20g/L, maltose 10 g/L, agar 9g/L, than hoạt tính 3g/L

- Môi trường được bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật

là benzyladenine (BA), kinetin (KN) và naphthalene -1-acetic

acid (NAA) ở các nồng độ khác nhau pH của môi trường trước khi khử trùng là 5,9

- Môi trường được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút

Phòng nuôi cây có nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 ± 5% Đĩa petri đựng mẫu được che tối trong 3 ngay đầu, với thời gian chiếu sáng

12 giờ/ngày

-Mỗi đĩa petri có 24 mẫu cấy của mỗi loại vật liệu (đốt thân mầm hoặc đốt tử diệp)

-Thí nghiệm có 3 yếu tố là 3 chất điều hòa tăng trưởng thực vật, mỗi yếu tố có hai mức độ

-Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi nghiệm thức gồm 4 đĩa petri lập lại 3 lần Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC

-Thí nghiệm được theo dõi trong 28 ngày

 

 3. K T QUẾ Ả

­ Kết quả thí nghiệm sau 28 ngày nuôi cấy cho thấy các lát mỏng

ở vùng đốt thân chỉ cho một chồi còn ở vùng đốt tử diệp thì cho nhiều chồi hơn

- Điều này cho thấy là do vùng sinh mô chờ hiện diện chung

quanh đốt tử diệp dễ bị kích hoạt dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

    

Chồi hình thành từ lớp mỏng đốt thân mầm và đốt tử diệp sau

28 ngày

 ­ Số chồi cao nhất (5, 7 chồi) từ lớp mỏng ở đốt tử diệp thuộc nghiệm thức 6 có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN và 0,5mg/l

NAA Lớp mỏng tạo chồi thấp nhất (3 chồi) khi được nuôi trên môi trường có bổ sung 5mg/l BA v à 0,5mg/l NAA

- Ảnh hưởng của BA và KN lên sự tạo chồi của lớp mỏng vung đốt tử diệp thấy rõ nhất khi nồng độ BA 10mg/L và KN 1mg/L, trong khi ảnh hưởng của NAA không thấy rõ lắm trong thí

nghiệm này

- Đối với đốt thân mầm, nồng độ của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng trong thí nghiệm này không đem lại sự khác biệt về số chồi hình thành ở cả 8 nghiệm thức

S  ch i t o thành t  l p lát m ng đ t  ố ồ ạ ừ ớ ỏ ố thân m m và đ t t  di p sau 28 ngày ầ ố ử ệ

 Các chồi hình thành từ lớp mỏng được tiếp tục cấy chuyền

sang môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 1mg/l KN để phát triển thành cây với số lần cấy chuyền là 2 tuần/lần Chiều cao cây trung bình đạt 3-4cm sau 2 tháng cấy chuyền

C m ch i cây đi u phát tri n sau 2 tháng c y chuy n ụ ồ ề ể ấ ề

4. K T LU N Ế Ậ

- Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào có thể được sử dụng để tạo chồi trực tiếp từ trục thượng diệp của hạt điều nảy mầm Số chồi được tạo trực tiếp từ lớp mỏng đốt tử diệp là cao nhất khi môi trường có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN v à 0,5mg/l NAA

- Đối với nuôi cấy lớp mỏng của đốt thân mầm thì chồi

có thể phát triển trên môi trường có BA 5mg/L và có hoặc không có kinetin và NAA

 

II. Hi n t ng hóa nâu ệ ượ

   ­ Hi n t ng hóa m u hóa nâu hay b  đen là ch t ệ ượ ẫ ị ế

m u hay làm gi m s  tăng tr ng. ẫ ả ự ưở

   ­ Nguyên nhân c a hi n t ng này là do m u ủ ệ ượ ẫ

nuôi c y có ch a nhi u tannin hay hydroxyphenol ấ ứ ề

có nhi u trong mô già h n mô s oề ơ ẹ

­ M t s  ph ng pháp làm gi m s  hóa nâu m u:ộ ố ươ ả ự ẫ

+ tách các ph n t  phenol ra kh i môi tr ngầ ử ỏ ườ

+ b  sung các ch t kh  redox (oxidation­redution) ổ ấ ử

phenol vào môi tr ngườ

+ ngăn ch n s  ho t đ ng c a enzim phenolaseặ ự ạ ộ ủ

+ gi m l ng phenol có s n trong m u b ng môi tr ng ả ượ ẵ ẫ ằ ườ

l ng gi ng môi tr ng r nỏ ố ườ ắ

+ m u chu n b  có v t c t nh , đ  ngoài vài gi  tr c ẫ ẩ ị ế ắ ỏ ể ờ ướkhi c y, hay n i c y trong môi tr ng không có ánh ấ ơ ấ ườ

sáng

 Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thụ chất kìm hãm phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loại phong lan, nồng độ thường 0,1-0,3%

 Tuy nhiên than hoạt tính sẽ làm chậm quá trình phát triển của

mô do hấp thụ chất kích thích sinh trưởng và các chất khác

Polyvinylpyrolidone (pvp), một chất thuộc loại polyamide, hấp thụ phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn sự hóa nâu, hiệu quả phụ thuộc vào các loài cây trồng khác nhau

 Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxi hóa vào môi trường ngăn chặn sự oxi hóa phenol Chất khử thường dùng: vitamin C, axit citric, L-cystein hydroclorit, gluta thione,

và mecaptoethanol Phương pháp quan trọng là phối hợp

vitaminC và axit citric

 Phương pháp đề nghị:

+ sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo

+ gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

+ ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C và axit citric vài giờ

trước khi cấy

+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp không có đèn 1-2 tuần chuyển mẫu từ môi trường có nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường có nồng độ cao

III. Hi n t ng th y tinh th ệ ượ ủ ể

-Nhân giống vô tính in vitro chỉ có hiệu quả khi cây con

được nhân giống chuyển ra đồng ruộng có tỉ lệ sống cao

Có hiện tượng trong nuôi cấy mô là xuất hiện cây in vitro

thủy tinh thể

-Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con đễ dàng bị

mất nước và tỉ lệ sống thấp Đây là một dạng bệnh sinh

lý Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường thạch có hàm lượng thạch thấp, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

­ Đặc điểm cây thủy tinh thể

+ Nhận thấy là có sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở cây nuôi cấy mô và cây ngoài tự nhiên Lượng sáp chứa trong cây ngoài

vườn ươm cao hơn hẳn cây in vitro Tế bào có chứa nhiều phân

tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó, gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vô tính và đưa đến

sự chết của mô trong nuôi cấy

- Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể

+ giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường

+ giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi

sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi.

+ giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi

trường cấy ít nhất ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng.

+ giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

+chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị

thủy tinh thể.

+ giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt

+ tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

IV Quy trình tạo củ lily bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro

- Lily là cái tên được đặt cho loài hoa đẹp, bền và đa số có toả hương thơm dịu dàng

Quy trình nhân giống cây hoa Lily bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro được tiến hành qua các công đoạn sau:

Khử trùng mẫu

Nhân giống invitro

- Tạo mô sẹo

V Phương pháp nuôi cấy chồi bất định

 Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này

hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật Một số loại

mẫu vật được dùng như sau:

- Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải…

- Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao…

- Cuống lá: thủy tiên…

- Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…

- Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…

- Đoạn mầm: măng tây.

 Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu

mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển Các thể phân sinh này rõ ràng có

nguồn gốc từ các tế bào đơn Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone

 Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không

có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật

VI. Nuôi tr ng th y canh ồ ủ

 Th y canh là k  thu t tr ng cây không dùng đ t ủ ỹ ậ ồ ấ

mà tr ng tr c ti p vào môi tr ng dinh d ng ồ ự ế ườ ưỡ

ho c giá th  mà không ph i là đ t. các giá th  có ặ ể ả ấ ể

th  là cát , tr u, v  x  d a, than bùn, ể ấ ỏ ơ ừ

 K  thu t th y canh là m t trong nh ng ngh  ỹ ậ ủ ộ ữ ề

làm v n hi n đ i. ch n l a môi tr ng t  nhiên ườ ệ ạ ọ ự ườ ự

c n thi t cho cây phát tri n là ch n s  d ng ầ ế ể ọ ử ụ

ngh ng ch t thích h p cho s  sinh tr ng và ữ ấ ợ ự ưở

phát tri n c a cây, tránh đ c s  phát tri n c a ể ủ ượ ự ể ủcôn trùng, c  d i và các b nh t t t  đ t.ỏ ạ ệ ậ ừ ấ

u đi m

đi m c a k  thu t th y canh có th  k  đ n nh  sau:  ể ủ ỹ ậ ủ ể ể ế ư

• Tr ng đ c nhi u v , có th  tr ng trái v   ồ ượ ề ụ ể ồ ụ

quả

Nh c đi m ượ ể

-Chi phí đ u t  ban đ u cao h n tr ng trên đ tầ ư ầ ơ ồ ấ

- Ph i hi u bi t c  b n v  tr ng tr tả ể ế ơ ả ề ồ ọ

 Chúc cô và các bạn có một buổi thuyết trình ý

nghĩa và vui vẻ