Đề tài với mục tiêu nhằm nghiên cứu về củ dòm (Stephania die/siana Y. C. Wu) là cây dược liệu phổ biến có thể mang lại giá trị kinh tế cao. Nhân giống in vitro thông qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một phương pháp tiềm năng cho phép tạo ra lượng lớn cây con có năng suất và chất lượng tốt. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn khá hạn chế ở Việt Nam.
Công nghệ sinh học & Giống trồng XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH TỪ NUÔI CẤY LÁT MỎNG TẾ BÀO CÂY CỦ DÒM (Stephania dielsiana Y C Wu) Nguyễn Văn Việt1, Nguyễn Thị Thùy Dương2, Trần Việt Hà3, Phạm Thị Huyền4 1,2,3 Trường Đại học Lâm nghiệp Trường Cao đẳng Y tế Ninh Bình TĨM TẮT Củ dịm (Stephania dielsiana Y C Wu) dược liệu phổ biến mang lại giá trị kinh tế cao Nhân giống in vitro thông qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào phương pháp tiềm cho phép tạo lượng lớn có suất chất lượng tốt Tuy nhiên, phương pháp hạn chế Việt Nam Kết nghiên cứu cho thấy, sát khuẩn bề mặt mẫu thân non ethanol 70% phút, sau khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% phút nuôi cấy môi trường dinh dưỡng MS (Murashige T Skoog F.,1962) bổ sung 0,3 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP); 30 g/l sucrose 6,5 g/l agar cho tỉ lệ mẫu 85,96%, tái sinh chồi đạt 70,84% sau thời gian tuần nuôi cấy Cảm ứng tạo mô sẹo tái sinh chồi môi trường MS bổ sung 1,2 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo 80,83%, mẫu tái sinh chồi đạt tỷ lệ 78,30% với thời gian tái sinh 19,13 ngày Cảm ứng tạo đa chồi môi trường MS bổ sung 0,7 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA cho hiệu nhân nhanh kích thích tăng trưởng chồi tốt nhất, hệ số nhân chồi đạt 3,3 lần, chiều cao chồi đạt 3,83 cm, chồi mập, khỏe có màu xanh Chồi rễ đạt 96,68% chiều dài rễ trung bình 2,74 cm ni mơi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA; 0,3 mg/l IBA sau tuần Từ khóa: Cây dược liệu, Củ dịm, mô sẹo, nuôi cấy in vitro, nuôi cấy lát mỏng, vi nhân giống ĐẶT VẤN ĐỀ Lồi Củ dịm (Stephania dielsiana Y C Wu) vị thuốc nam mang nguồn gen quý phát Việt Nam ghi Sách đỏ Việt Nam (2007), thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) lồi thực vật có hoa họ Biển cát, chứa nhiều hoạt chất dược liệu quý Nhiều nghiên cứu lồi Củ dịm có chứa alkaloid bao gồm: L-tetrahydropalmatin (rotundian), stephrin, roemerin có tác dụng giảm đau, an thần hiệu quả, gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp, điều hịa hơ hấp tim mạch Cepharanthin tìm thấy Củ dịm có tác dụng kích thích miễn dịch làm giảm nhẹ cách hữu hiệu tác dụng phụ thuốc chống ung thư (Nguyễn Thượng Dong cộng sự, 2006) Ở Củ dòm phát cepharanthin có tác dụng ức chế dịng tế bào ung thư đại trực tràng ung thư gan, ức chế phát triển trực khuẩn lao Ngồi ra, Củ dịm cịn làm vật trang trí, làm cảnh nhiều người ưa chuộng Hiện nay, loài Củ dòm mức cảnh báo tuyệt chủng cấp VU b1+ b,c (Sách đỏ Việt Nam, 2007) nên cần bảo tồn phát triển nguồn gen quý Nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro đặc biệt nuôi cấy lát mỏng tế bào (TCL) giải nhanh chóng tốn 32 Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào phát triển 30 năm áp dụng thành cơng nhiều lồi thực vật (Da Silva, 2003) tạo giống trồng chuyển gen (Nhut cộng sự, 2001) mà phương pháp nuôi cấy truyền thống khác cịn gặp khó khăn Trong vài năm trở lại đây, phương pháp nghiên cứu ứng dụng số phịng ni cấy mơ Việt Nam đem lại hiệu đáng kể trình nhân nhanh số đối tượng như: Phong lan (Nguyễn Quang Thạch cộng sự, 2000), Dứa (Nguyễn Quang Thạch cộng sự, 2004), Dendrobium aducum (Nguyễn Thanh Tùng cộng sự, 2010), Spilanthes acmella (Singh cộng sự, 2009), Sesamum indicum (Chattopadhyaya cộng sự, 2010), Lilium (Nhut cộng sự, 2001; 2002), Hoa cúc vàng (Nguyen Van Viet, 2017) Bài báo này, công bố kết nghiên cứu tái sinh chồi in vitro lồi Củ dịm từ vật liệu lát mỏng tế bào đạt hiệu cao nhằm cải tiến quy trình nhân giống lồi Củ dịm phục vụ thương mại hóa giống dược liệu có giá trị kinh tế cao PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Cây Củ dịm (Stephania dielsiana Y C Wu) khỏe mạnh, khơng sâu bệnh thu thập ngồi tự nhiên TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 Công nghệ sinh học & Giống trồng Vườn quốc gia Ba Vì trồng vườn ươm Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp; Vật liệu nghiên cứu: Thân non Củ dòm dùng làm vật liệu khởi đầu; Hóa chất dùng để khử trùng mẫu: dung dịch HgCl2 0,1%; cồn 960; Môi trường sử dụng thí nghiệm ni cấy lát mỏng Củ dịm mô trường MS (Murashige Skoog, 1962), môi trường giầu dinh dưỡng dùng tương đối phổ biến nuôi cấy mô tế bào thực vật Các loại vitamin (B1, B2, B6, B12); chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHST): Benzyl amino purine (BAP), Kinetin, Naphthyl acetic acid (NAA) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tạo mẫu sạch: Mẫu thân non rửa nước máy, đem lắc rửa dung dịch xà phòng loãng - lần loại bỏ hết xà phòng, tráng lại thật nước cất, sát khuẩn bề mặt mẫu thân non ethanol 70% phút Khử trùng mẫu HgCl2 0,1%, với thời gian khác (5 - phút) Sau lần dùng hóa chất để khử trùng phải tráng rửa mẫu nước cất vô trùng Nuôi cấy khởi động: Sau khử trùng, dùng dao kéo sắc cắt phần bớt hai đầu mẫu (phần bị thấm hóa chất) Phần cịn lại cắt thành đoạn có hích thước - cm (có 01 mắt ngủ) Cấy mẫu môi trường nuôi cấy khởi động môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,3 mg/l BAP nhằm kích thích tái sinh chồi nhanh cung cấp vật liệu cho nghiên cứu (Nguyễn Quang Thạch cộng sự, 2000; 2004; Nguyen Van Viet cộng sự, 2017; Nguyễn Thanh Tùng cộng sự, 2010) Nuôi cấy lát mỏng: Các chồi in vitro thu thập thí nghiệm dùng để cắt lát mỏng, dùng dao sắc cắt ngang chồi thành lát mỏng (độ dầy lát mỏng kiểm tra dụng cụ panme có giá trị 0,4 - 1,6 mm) cấy lên môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,5 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar, theo dõi kết tuần (Nguyễn Quang Thạch cộng sự, 2000; 2004; Nguyen Van Viet cộng sự, 2017; Nguyễn Thanh Tùng cộng sự, 2010) Tạo mô sẹo tái sinh chồi: Các mẫu cấy chuyển sang môi trường tạo mô sẹo tái sinh chồi mơi trường khống MS bổ sung 0,4 - 1,2 mg/l BAP; - 0,3 mg/l NAA; - 0,2 mg/l Kinetin; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar Sau tuần nuôi cấy, thống kê số mẫu tạo mô sẹo, số mẫu tái sinh chồi thời gian mẫu tái sinh chồi (Nguyen Van Viet cộng sự, 2017) Nhân nhanh chồi: Các chồi tái sinh từ lát cắt cấy lên môi trường nhân nhanh chồi với thành phần mơi trường khống MS bổ sung 0,3 - 1,1 mg/l BAP; 0,3 mg/l NAA; 0,2 mg/l Kinetin; 30 g/l sucorse; 6,5 g/l agar Sau tuần nuôi cấy, thống kê tổng số chồi tạo thành chiều cao chồi (Nguyễn Quang Thạch cộng sự, 2000; 2004; Nguyen Van Viet cộng sự, 2017; Nguyễn Thanh Tùng cộng sự, 2010) Tạo hồn chỉnh: Các chồi có chiều cao từ - cm thu từ trình nhân nhanh chuyển sang mơi trường kích thích rễ tạo hồn chỉnh với thành phần mơi trường khoáng MS bổ sung - 0,5 mg/l IBA; - 0,5 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar Sau tuần chồi rễ, thống kê số chồi rễ, số rễ, chiều dài rễ (Nguyen Van Viet cộng sự, 2017) Tất môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH = 5,8 khử trùng nhiệt độ 1180 C 17 phút, mẫu nuôi ánh sáng giàn đèn neon, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux, nhiệt độ phịng ni 25 ± 20 C Các thí nghiệm bố trí bình thủy tinh hình trụ (3 - mẫu/bình 200 ml), cơng thức thí nghiệm sử dụng ≥ 30 mẫu, lặp lại lần Số liệu xử lý phần mềm Excel KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo mẫu in vitro Mẫu thân non lồi Củ dịm sau làm khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% với công thức khác thời gian Sau tuần nuôi cấy môi trường nuôi cấy khởi động, kết nghiên cứu tình bày bảng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 33 Công nghệ sinh học & Giống trồng Bảng Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu tạo mẫu CTTN KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 Thời gian (phút) Lần 4 Tỷ lệ mẫu (%) Tỷ lệ tái sinh (%) 32,04 62,01 72,45 85,96 89,26 22,06 48,67 61,85 70,84 28,67 Lần 2 2 í = 128,93 > Qua kết (Bảng 1) cho thấy, với thân non lồi Củ dịm, khử trùng thời gian phút tỉ lệ mẫu thấp đạt 32,04%, mẫu có màu xanh Khi tăng thời gian khử trùng lên đến phút (KT2, KT3, KT4) tỉ lệ mẫu tăng lên rõ rệt (62,01 - 85,96%), tái sinh chồi tăng theo tỷ lệ thuận (48,67 70,84%), mẫu xanh đều, đẹp Khi thời gian khử trùng tăng lên phút (KT5) tỉ lệ mẫu tăng lên (89,26%), mẫu lại có mầu thâm đen, khả tái sinh chồi (28,67%) Điều tương đối phù hợp chất khử trùng hóa chất độc, khử trùng lâu hóa chất ngấm vào mơ thực vật làm hỏng gây độc chồi khơng thể phát sinh (Jaime A cộng sự, 2015) Như với thân non lồi Củ dịm dùng cơng thức khử trùng HgCl2 0,1% , = 4,66 thời gian phút (chia thành hai lần) cho hiệu tốt Kết phân tích phương sai cho thấy khác ( í > , ), thời gian khử trùng khác ảnh hưởng đến khả tạo mẫu có ý nghĩa 3.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng Môi trường dinh dưỡng nhân tố quan trọng định tới khả tạo mô sẹo tái sinh chồi từ nuôi cấy lát mỏng Với lồi khác nhau, mơi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy cần phải phù hợp Do vậy, để phát huy tối đa khả tái sinh chồi, thí nghiệm tiến hành ni cấy chồi dựa loại môi trường dinh dưỡng khác Kết nghiên cứu trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Môi trường Tỷ lệ tái sinh (%) Chiều cao TB (cm) Đặc điểm chồi MS 43,33 1,0 +++ ½ MS 30,00 0,5 ++ WPM 20,00 0,3 + í = 104,75 > , = 4,06 Ghi chú: (+) xấu, đen, nhỏ, xốp; (++) trung bình, xanh, nhỏ, cứng; (+++) tốt, xanh, mập, cứng CTTN MT1 MT2 MT3 Từ kết thu (Bảng 2), cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi trung bình mẫu lát mỏng công thức môi trường khác cho hiệu tái sinh khác Khi sử dụng môi trường MS mẫu cho tỷ lệ tái sinh cao (43,33%), với mơi trường cịn lại ½MS cho tỷ lệ 30% WPM cho tỷ lệ 20% Có thể lý giải, mơi trường MS có hàm lượng cao gốc kim loại Mg++, K+, Na+, Zn++, Mn++… ảnh hưởng đến cảm ứng tái sinh chồi từ lát 34 mỏng Mơi trường ½ MS WPM có hàm lượng kim loại thấp so với MS nên cho tỷ lệ tái sinh khơng cao Vì vậy, sử dụng mơi trường MS thích hợp cho tái sinh chồi từ lát mỏng lồi Củ dịm Kết phân tích phương sai ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng khác ( í > , ), chứng tỏ kết nghiên cứu có khác biệt cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng 3.3 Ảnh hưởng kích thước lát mỏng đến khả tái sinh chồi Lát mỏng cắt từ đoạn chồi in vitro với kích thước khác (0,4 - 1,6 mm), sau cấy mơi trường khống MS bổ sung 0,5 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA Theo dõi thí nghiệm sau tuần ni cấy, kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng kích thước lát mỏng đến khả tái sinh chồi Kích thước lát mỏng Tỷ lệ tái sinh chồi Chiều cao TB/chồi CTTN Đặc điểm chồi (mm) (%) (cm) MT4 0,4 41,11 1,00 + MT5 0,7 51,11 1,20 ++ MT6 1,0 61,10 1,80 +++ MT7 1,3 40,00 1,30 ++ MT8 1,6 28,90 0,80 ++ Ftính = 46,82 > F0,05 = 3,14 Ghi chú: (+) chồi xanh, nhỏ, cứng cáp; (++) chồi xanh, trung bình, cứng cáp; (+++) chồi xanh, mập, cứng cáp Mẫu lát mỏng lồi Củ dịm có kích thước 0,4 mm (MT4) 1,6 mm (MT8) cho tỷ lệ tái sinh thấp 41,11%; 28,90% điều cho thấy cắt lát mỏng mơ bị tổn thương nhiều, cịn cắt q dày lát cắt khó tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng để cảm ứng tạo mô sẹo chồi Khi tăng độ dầy lát cắt tỷ lệ tái sinh tăng từ 41,11% đến 61,11% sau bắt đầu giảm xuống, chồi có đặc điểm tốt xanh, mập, cứng cáp Như vậy, kích thước lát cắt từ 0,7 - 1,3 mm cho tỷ lệ tái sinh chấp nhận được, tỷ lệ tái sinh cao kích thước độ dầy lát cắt mm (61,1%) Qua thí nghiệm, lựa chọn lát cắt phù hợp cho tái sinh Củ dòm từ 0,7 - 1,3 mm Kết phân tích phương sai khả tái sinh chồi từ lát cắt có kích thước khác cho kết CT TN ĐC MC1 MC2 MC3 MC4 MC5 MC6 MC7 MC8 MC9 khác biệt (Ftính > F0,05), chứng tỏ kết có khác cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa 3.4 Tạo mô sẹo tái sinh chồi Việc bổ sung Kinetin, BAP NAA kích thích phân chia mạnh mẽ tế bào, đặc biệt ảnh hưởng rõ rệt lên hình thành phân hóa chồi (Nguyễn Văn Kết cộng sự, 2010), dẫn đến hệ số nhân chồi tăng lên rõ rệt Thí nghiệm thiết kế với cơng thức, có thay đổi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật Môi trường sử dụng môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,4 - 1,2 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA Kết thu sau tuần ni cấy trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo mô sẹo tái sinh chồi ĐHST (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo mô Tỷ lệ mẫu tái Thời gian tái sẹo (%) sinh chồi (%) sinh chồi (ngày) BAP Kinetin NAA 0,0 0,4 0,8 1,2 0,4 0,8 1,2 0,4 0,8 1,2 0,0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 15,57 13,26 75,27 73,86 78,60 69,08 80,81 66,86 70,82 67,30 77,49 61,30 78,60 60,19 90,82 69,08 86,38 72,63 80,83 78,30 Ftính = 147,81 > F0,05 = 3,45 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 21,13 24,80 28,13 22,47 25,47 28,13 22,80 21,47 19,13 35 Công nghệ sinh học & Giống trồng Qua kết bảng cho thấy, bổ sung BAP (từ 0,4 mg/l lên 1,2 mg/l), có kết hợp khơng kết hợp với Kinetin (0,2 mg/l) NAA (0,3 mg/l) cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giảm tỷ lệ mẫu tái sinh chồi lại khác Các số liệu cho thấy, bổ sung BAP với nồng độ tăng cao có mặt Kinetin gây tác động kìm hãm hình thành mơ sẹo, ưu tiên phân hóa tái sinh chồi Cụ thể là, nhóm cơng thức bổ sung đầy đủ chất BAP, Kinetin NAA (MC7-9) cho hiệu tạo mô sẹo tái sinh chồi tốt cả, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt giá trị 80,83% (MC9) đến 90,82% (MC7), đồng thời thời gian mẫu tái sinh chồi giảm từ 22,8 ngày xuống 19,13 ngày Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giảm tỷ lệ mẫu tái sinh chồi lại tăng từ 69,08% (MC7) đến 78,3% (MC9), công thức MC9 cho hiệu tái sinh chồi tốt, công thức cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 80,83%, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 78,3%, thời gian mẫu tái sinh chồi 19,13 ngày Với nhóm cơng thức mơi trường bổ sung thiếu NAA Kinetin (MC1 đến MC6) cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tái sinh chồi thấp so với nhóm cơng thức bổ sung đầy đủ loại chất điều hòa sinh trưởng (BAP, Kinetin, NAA), tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo công thức MC1-6 đạt 70,82% đến 80,81%, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 60,19% đến 73,86%, thời gian tái sinh chồi từ 21,13 ngày đến 28,13 Như vậy, công thức môi trường cho khả tạo mô sẹo tái sinh chồi hiệu công thức MC9, với môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 1,2 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt 80,83%, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 78,30%, thời gian mẫu tái sinh nhanh 19,13 ngày Kết phân tích phương sai cho thấy khả tái sinh chồi từ công thức môi trường khác (Ftính > F0,05), chứng tỏ kết có khác biệt cơng thức thí nghiệm có ý nghĩa 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Giai đoạn nhân nhanh kích thích tăng trưởng chồi giai đoạn quan trọng, then chốt định hiệu tốc độ quy trình nhân giống in vitro Vì vậy, nghiên cứu kết hợp chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin (BAP, Kinetin) Auxin (NAA) vào mơi trường ni cấy để kích thích chồi phân hóa nhanh nhiều đồng thời kích thích chồi tăng trưởng chiều cao Thí nghiệm thiết kế với cơng thức, dùng mơi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,3 - 1,1 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA Kết thu sau tuần ni cấy trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi CTTN Chất ĐHST (mg/l) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi TB (chồi) Chiều cao chồi (cm) Đặc điểm chồi 10,00 0,65 0,78 + ĐC Kinetin 0,0 NAA 0,0 BAP 00 NN1 0,2 0,3 0,3 40,67 1,67 2,83 ++ NN2 0,2 0,3 0,5 61,67 2,30 3,30 ++ NN3 0,2 0,3 0,7 91,67 3,30 3,83 +++ NN4 0,2 0,3 0,9 71,67 2,30 3,00 +++ NN5 0,2 0,3 1,1 42,67 1,78 2,50 ++ í = 64,78 > , = 3,21 Ghi chú: (+) chồi xấu, vàng, nhỏ, mềm; (++) TB, xanh, nhỏ, cứng; (+++) tốt, xanh, mập, cứng Từ kết bảng cho thấy, nồng độ chất ĐHST khác ảnh hưởng tạo khác biệt nhân nhanh chồi Củ dịm Trong cơng thức thí nghiệm giai đoạn nhân nhanh 36 chồi Củ dịm hệ số nhân chồi dao động khoảng 1,67 - 3,30 Công thức NN3 cho hệ số nhân chồi cao (3,30 lần), chồi tạo thành có đặc điểm mập, xanh, khỏe, nhiều TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 Công nghệ sinh học & Giống trồng đồng Kết tương đồng với nghiên cứu Nguyễn Văn Vinh cộng (2011) Vì vậy, sử dụng cơng thức mơi trường MS bổ sung 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA; 0,7 mg/l BAP thích hợp cho nhân nhanh chồi Củ dịm Kết phân tích phương sai cho thấy ảnh hưởng tổ hợp chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi có khác ( í > , ), chứng tỏ cơng thức thí nghiệm khác cho kết sai khác có ý nghĩa 3.6 Kích thích rễ tạo hoàn chỉnh Giai đoạn cuối tạo hồn chỉnh, điều khiển biệt hóa chồi rễ tạo (có CTTN R0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 thân, rễ đầy đủ) Hầu hết sử dụng chất điều hịa sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA ) để kích thích rễ Tuy nhiên, lồi trồng lại có tích lũy hàm lượng auxin nội sinh khác nhau, cần xác định hàm lượng auxin bổ sung phù hợp cho rễ in vitro loài cụ thể Trong nghiên cứu này, sử dụng môi trường dinh dưỡng MS bổ sung chất ĐHST có nồng độ khác Những chồi Củ dòm khỏe mạnh, xanh, mập, có chiều cao từ - cm, thu từ trình nhân nhanh chuyển sang mơi trường tạo rễ Kết thí nghiệm thu sau tuần theo dõi trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả rễ tạo hoàn chỉnh Chất ĐHST (mg/l) Tỷ lệ chồi Chiều dài rễ Chất lượng Số rễ TB/cây rễ (%) (cm) NAA IBA 0,3 0,5 0,2 0,2 0,3 0,5 0,3 0,5 0,00 0,00 0,00 65,00 2,80 1,60 + 78,88 3,13 2,34 ++ 88,89 3,18 2,33 ++ 92,22 3,67 2,56 +++ 96,68 3,70 2,74 +++ 94,33 3,63 2,67 +++ Ftính = 199,61 > F0,05 = 3,15 Ghi chú: (+++) rễ phát triển tốt, trắng, mập, nhiều rễ phụ; (++) rễ phát triển khá, trắng, rễ phụ; (+) rễ phát triển Kết (Bảng 6) cho thấy, tất cơng thức thí nghiệm cho kết cao, tỷ lệ chồi rễ đạt từ 65% trở lên Tuy nhiên, công thức môi trường R5 bổ sung đầy đủ IBA NAA cho hiệu tạo rễ tốt nhất, tỷ lệ chồi rễ đạt 96,68%, số rễ TB/cây đạt 3,7 rễ, rễ dài 2,74 cm Các công thức môi trường bổ sung riêng rẽ IBA NAA cho hiệu so với công thức bổ sung đầy đủ loại, tỷ lệ chồi rễ đạt từ 65% (R1) đến 92,22% (R4); số rễ TB/cây đạt từ 2,8 rễ (R1) 3,67 rễ (R4); chiều dài rễ ngắn đạt 1,6 cm (R1) đến 2,56 cm (R4) Như vậy, công thức môi trường cho hiệu tạo rễ tốt mơi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA, tỷ lệ chồi rễ đạt 96,68%, số rễ TB/chồi đạt 3,7 rễ, chiều dài rễ 2,74 cm, rễ dài có màu trắng xanh Kết phân tích phương sai cho thấy khác (Ftính > F0,05), nghĩa nồng độ chất ĐHST khác có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tạo rễ KẾT LUẬN Nghiên cứu tái sinh chồi phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào lồi Củ dịm bước đầu thành công với kết cụ thể sau: Khử trùng mẫu HgCl2 0,1% thời gian phút cho tỷ lệ mẫu đạt 85,96%, mẫu tái sinh chồi đạt 70,84%, mẫu có màu xanh tươi Ni cấy tái sinh chồi môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 1,2 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 80,83%, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 78,30%, thời gian mẫu tái sinh chồi 19,13 ngày TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 37 Công nghệ sinh học & Giống trồng Nhân nhanh chồi môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,7 mg/l BAP; 0,2 mg/l Kinetin; 0,3 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar, hiệu nhân nhanh chồi đạt trung bình 3,3 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 3,83 cm, chồi mập, khỏe, có màu xanh đậm Kích thích rễ tạo hồn chỉnh với mơi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,3 mg/l IBA; 0,2 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar, chồi rễ đạt 96,68%, số rễ TB/cây đạt 3,7 rễ, chiều dài trung bình rễ 2,74 cm, rễ nhiều màu trắng sáng Hình Các giai đoạn quy trình nhân giống lồi Củ dịm từ vật liệu lát mỏng a) Mẫu cấy ban đầu, tái sinh chồi; b) Mẫu lát mỏng sau ngày; c) Mẫu tạo mô sẹo tái sinh chồi; d) Chồi hữu hiệu sau tuần; e) Nhân nhanh chồi công thức NN3 sau tuần; f) Nhân nhanh chồi NN4 sau tuần; g) Ra rễ R0; h) Ra rễ R2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chattopadhyaya B, Banerjee J, Basu A, Sen SK, Maiti MK (2010) Shoot induction and regeneration using intermodal transverse thin cell layer culture in Sesamum indicum L Plant Biotechnol Rep 4(2): 173-178 Da Silva J.A.T (2003) Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology Afr J Biotechnol (12): 683-691 Jaime A, Teixeira da Silva, Jean Carlos Cardoso, Judit Dobranszki, Songjun Zheng (2015) Dendrobium micropropagation/ a review Plant Cell Rep, 34: 671-704 Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue cultures Physiol plant, 15: 473-497 Nguyễn Quang Thạch, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Hương (2004) Nhân nhanh giống dứa Đài nông kỹ thuật nuôi cấy mô Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp, số 3/2004: 185-90 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga (2000) Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy lát mỏng nhân nhanh giống Vanda, Cattleya Phaleanopsis Tạp chí Nơng nghiệp - Công nghiệp thực phẩm (12): 546-548 Nguyễn Thượng Dong, Bùi Thị Bằng (2006) 38 Nghiên cứu thuốc từ thảo dược Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Văn Vinh (2010) Nghiên cứu khả nhân giống loài Lan Hoàng Thảo Sáp (Dendrobium crepidatum Lindl & Paxt.) in vitro Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48 (5): 89-95 Nguyễn Văn Vinh, Trịnh Ngọc Nam (2011) Nghiên cứu nhân giống in vitro khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ Bình Vơi (Stephania Rotunda Lour) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ số 49: 51-58 10 Nguyen Van Viet (2017) Study on application of thin cell layer culture for in vitro propagation of yellow daisy (Chrysanthemum indicum L.) Journal of Forestry Science and Technology, No 5: 37-42 11 Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị Bích Phượng (2010) Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân giống in vitro lan Hoàng thảo thân gẫy (Dendrobium aducum) Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (3): 361-367 12 Nhut D.T., Bui V.L., Teixeira da Silva J.A., Aswth C.R (2001) Thin cell layer culture system in Lilium: regeneration and transfomation perspectives In vitro Cell Dev Biol, (37): 516-523 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 Công nghệ sinh học & Giống trồng 13 Nhut D.T, Le B.V, Minh N.T, de Silva J.T, Fukai S., Tanaka M., Van T.T.K (2002) Somatic embryogenesis through pseudo-bulblet transverse thin cell layer of Lilium longiflorum Plant Growth Regu 37(2): 193-198 14 Sách Đỏ Việt Nam, Phần II - Thực vật (2007) Nxb Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Hà Nội 14 Singh S.K., Rai M.K., Asthana P, Sahoo L (2009) An improved micropropagation of Spilanthes acmella L through transverse thin cell layer culture Acta Physiol Plant 31(4): 693-698 AN EFFICIENT REGENERATION SYSTEM THROUGH THIN CELL LAYER CULTURE OF Stephania dielsiana Y.C WU Nguyen Van Viet1, Nguyen Thi Thuy Duong2, Tran Viet Ha3, Pham Thi Huyen4 1,2,3 Vietnam National University of Forestry Ninh Binh Medical College SUMMARY Stephania dielsiana Y.C Wu is a Medicinal plant which can bring highly economic and medicinal value Thin cell layer (TCL) culture is a potential method for in vitro propagation of S dielsiana However, this method is still limited in Vietnam After sterilization with HgCl2 0.1% solution for minutes and being cultured on Murashige T and Skoog F (1962) medium supplemented with 6-benzyl amino purine (BAP) 0.3 mg/l, sucrose 30 g/l, agar 6.5 g/l, the cultured samples were recorded with clean materials percentage of 85.96%, shoots were generated of 70.84% after weeks Callus induction and shoot regeneration on MS medium supplemented with BAP 1.2 mg/l, Kinetin 0.2 mg/l, α-naphthaleneacetic acid (NAA) 0.3 mg/l were obtained with 80.83% and 78.30%, respectively Shoots were generated after 19.13 days on average Multi shoots were generated by culturing on MS medium supplemented with BAP 0.7 mg/l; Kinetin 0.2 mg/l; NAA 0.3 mg/l, the result was indicated by multi shoot rate reaching 3.3 and the average length of the shoot being 3.83 cm Shoots were green and healthy Highest rooting rate (96.68%) was obtained on MS medium supplemented with NAA 0.2 mg/l, IBA 0.3 mg/l, and root length reaching 2.74 cm after weeks of culture Keywords: Callus, in vitro, medicinal plants, micropropagation, Stephania dielsiana, thin cell layer Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng : 14/9/2018 : 26/11/2018 : 03/12/2018 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2018 39 ... đến khả tái sinh chồi từ lát mỏng Môi trường dinh dưỡng nhân tố quan trọng định tới khả tạo mô sẹo tái sinh chồi từ nuôi cấy lát mỏng Với lồi khác nhau, mơi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy cần... được, tỷ lệ tái sinh cao kích thước độ dầy lát cắt mm (61,1%) Qua thí nghiệm, lựa chọn lát cắt phù hợp cho tái sinh Củ dòm từ 0,7 - 1,3 mm Kết phân tích phương sai khả tái sinh chồi từ lát cắt có... ứng tái sinh chồi từ lát 34 mỏng Mơi trường ½ MS WPM có hàm lượng kim loại thấp so với MS nên cho tỷ lệ tái sinh khơng cao Vì vậy, sử dụng mơi trường MS thích hợp cho tái sinh chồi từ lát mỏng