Vi sinh thực phẩm

Tổng quan, đặc tính và cơ chế hoạt động của oxyrase, phân đoạn màng có chức năng tương tự oxyrase, một số sản phẩm oxyrase hiện nay, các triển vọng trong tương lai

1 Tổng quan về oxyrase

2 Đặc tính và cơ chế hoạt động của oxyrase

3 Phân đoạn màng có chức năng tương tự

oxyrase

4 Một số sản phẩm oxyrase hiện nay

5 Các triển vọng trong tương lai

1) Tổng quan về oxyrase

1.1 Định nghĩa

1.2 Nguồn gốc

1.3 Lợi ích

Định nghĩa

• Oxyrase là tên thương mại được đặt cho enzyme có khả năng khử oxy (hay enzyme mang chuỗi chuyển e- đóng vai trò quan trọng cho quá trình hô hấp mà bản chất là cytochrome)

• Theo định nghĩa của công ty OXYRASE Inc

Oxyrase là hỗn hợp thương mại của 2 loại enzym

monooxygenase và dioxygenase có khả năng loại

bỏ oxy một cách nhanh chóng và hoàn toàn ra khỏi môi trường lỏng và bán rắn (OXYRASE Inc., 1991)

• Một đơn vị hoạt tính Oxyrase được định nghĩa là

lượng enzyme để khử 1,0% oxy hòa tan trong 1 giây trong 1 ml

Nguồn gốc

• Phân đoạn màng E.coli : Adler phát hiện oxyrase từ phân đoạn tế bào có chứa enzyme hô hấp có khả năng hình thành môi trường kỵ khí

• Schnaitman (1970): E.Coli

Cytochrome và các enzyme khử khử O2 hoà tan thành H2O

1/3 protein màng bao 1/2 phospholipid

Như vậy phân đoạn màng tế bào có chứa Oxyrase, cụ

thể là ở bào quan Mesosome

Nguồn gốc

Lợi ích của oxyrase

Những khó khăn khi thao tác với đối tượng là vi sinh vật kị khí:

• Nhìn về mặt lý thuyết:

Tập hợp vi sinh vật kị khí lớn, đa dạng

Một số có khả năng gây bệnh cho người

• Trong thực nghiệm: VSV kị khí rất khó nuôi cấy và tăng sinh

Nguyên nhân cốt lỏi chính là phải tạo được môi

trường có điều kiện kị khí đảm bảo cho VSV kị khí

có thể sống và sau đó là tăng sinh

Tại sao vấn đề này gặp khó khăn???

• Trong thực tế: cho chất khử vào tạo môi trường kị khí

chính chất khử tạo thành các peroxyde hữu cơ  ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật

• Sử dụng hệ thống rút không khí, bơm chân không, tạo hỗn

hơp khí nhằm loại oxy hệ thống này lại khá cồng kềnh và phức tạp.

• Nếu tạo được môi trường kị khí thao tác khó khăn

Oxyrase đã giải quyết vấn đề trên

nhanh hiệu quả

2) Đặc tính và cơ chế hoạt động của

Oxyrase

2.1 Các đặc tính của Oxyrase

2.2 Cơ chế hoạt động của Oxyrase

2.3 Tác động của Oxyrase lên sự tăng trưởng vi

sinh vật kị khí

Các đặc tính của oxyrase

• Khử O2 thành H2O khi có mặt của chất cho điện tử

• Phạm vi hoạt động của oxyrase:

 pH: 3.5-7.0

 Nhiệt độ: nhiệt độ phòng - 50 0 C

 Mối tương quan giữa nồng độ chất cho điện tử và

nồng độ O2 hoà tan Nồng độ chất cho điện tử phải

tương ứng với nồng độ O2 hoà tan (1-10mM; <1mM)

Cơ chế hoạt động của Oxyrase

• Về mặt bản chất: mono- và di-oxygenase

• Xúc tác khử O2 thành nước ( lấy trực tiếp nguyên tử oxy từ không khí để thực hiện phản ứng oxi hóa

cơ chất.)

Là những enzyme quan trọng trong các quá trình

biến dưỡng năng lượng và trao đổi chất

Đặc tính của oxyrase

Về mặt lưu trữ:

Ổn định trong 1 năm hoặc lâu hơn nếu

Oxyrase được giữ đông ở -100C hoặc lạnh hơn Quá trình đông và giải đông không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của nó

Vẫn hoạt động tốt trong 30 ngày nếu giữ ở nhiệt độ 2-80C

Giữ ở nhiệt độ phòng rất mau mất hoạt tính

Cơ chế hoạt động của oxyrase

• Ở vi khuẩn:

Oxyrase nằm trên màng tế bào và thực

hiện chức năng hô hấp

 Oxyrase sử dụng hai loại cơ chất khác

nhau: phân tử oxy và chất cho điện tử

Các chất cho điện tử bao gồm formate,

lactate, succinate, α-glycerophosphate…

Khả năng hoạt động của oxyrase tăng hay giảm phụ thuộc vào bản chất của chất cho điện tử

Cơ chế hoạt động của oxyrase

• Việc khử O2 của enzyme màng phụ thuộc vào khả

năng của hệ cytochrome , trong đó, Ubiquinone đóng vai trò chủ đạo nghĩa là thiếu Ubiquinone, hệ màng không thực hiện được chức năng khử O2

• Chất cho điện tử sau khi bị oxi hóa thành chất khác

không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV kị khí như:

Lactate  pyruvate, formate  CO2 + H2O.

* Hệ thống Oxyrase không làm thay đổi đáng kể pH của môi trường như hệ thống CO2 (Retsema et al,1991)

Tác động của oxyrase lên sự tăng

trưởng của vi sinh vật kị khí

Khi dùng Oxyrase cần chú ý:

 Tạo được môi trường kị khí hay không?

 Có tác dụng kích thích sinh trưởng của VSV mục tiêu hay không?

 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính và tốc độ khử O2

của enzyme Oxyrase và các phân đoạn màng có tính năng tương tự khác

 Tác động của Oxyrase lên sự tăng trưởng của

Salmonella, Listeria,Campylobacter, E.coli O157

Tác động của oxyrase lên sự tăng

trưởng của Salmonella và Listeria

• Theo kết quả thực nghiệm của Fahimeh

NirooMand và Daniel Y.C Fung trong nghiên

cứu “Tác động của Oxyrase lên sự tăng trưởng

của Salmonella spp và Listeria monocytogenes

trong môi trường tiền tăng sinh phổ quát” (1992)

• Tiền tăng sinh : môi trường này có tác dụng phục hồi VSV mục tiêu có trong mẫu trước khi thực hiện tăng sinh chúng trong môi trường chuyên biệt

Tác động của oxyrase lên sự tăng

trưởng của Campylobacter

• Một số Campylobacter nuôi cấy thành công khi có sự hiện

diện của Oxyrase trong môi trường nuôi cấy.

• Nuôi cấy lắc C jejuni và C coli ở 42o C trong dịch nuôi cấy brucella có sự hiện diện của Oxyrase Khi gia tăng nồng

độ Oxyrase từ 0-0,8 đơn vị/ml thì sự tăng trưởng của

Campylobacter cũng tăng theo Trong dãy nồng độ này,

sự tăng trưởng nhanh nhất và thời gian thế hệ ngắn nhất

của Campylobacter đạt được khi môi trường nuôi cấy có

sự hiện diện của Oxyrase ở nồng độ ≥ 0,6 đơn vị/ml

• Ảnh hưởng của oxyrase lên Campylobacter chủ yếu trong pha log hơn là pha ổn định.

Tác động của oxyrase lên sự tăng

trưởng của E.coli O157

Oxyrase TM làm gia tăng sự tăng trưởng của E Coli O157

O157 trong các mẫu thực phẩm và môi trường(Phebus et

al 1993; Thippareddi et al 1995; Jiang et al.1998)

Jiang et al (1998): môi trường có Oxyrase TM giúp hồi phục

lượng nhỏ E Coli O157 trong mẫu Đặc biệt là trong

trường hợp có các vi sinh vật cạnh tranh khác.

3 Phân đoạn màng có chức năng

3 Phân đoạn màng có chức năng

tương tự oxyrase

3.1 Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn

3.2 Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi

khuẩn (non- bacterial source)

Phân đoạn màng có nguồn gốc vi

khuẩn

1) Chủng thí nghiệm

2) Các bước thực hiện

• Tăng sinh

• Thu nhận các phân đoạn màng

• Thanh trùng các phân đoạn màng

Chủng thí nghiệm

• Chủng sử dụng: từ American Type Culture

Collection (ATCC), Rock ville, MD gồm:

Escherichia coli (E8) ATCC 11775

Acetobacter xylinum ATCC 12878

Gluconobacter oxydans subsp suboxydans

ATTC33448

Ngoài ra còn sử dụng các chủng: Pseudomonas aeruginosa, Acetobacter vinlandii,

Mycobacterium phlei và cả Salnonella

typhimurium

Phân đoạn màng có nguồn gốc vi

khuẩn

1) Chủng thí nghiệm

2) Các bước thực hiện

• Thanh trùng các phân đoạn màng

Phân đoạn màng có nguồn gốc vi

khuẩn

1) Chủng thí nghiệm

2) Các bước thực hiện

• Thu nhận các phân đoạn màng

• Thanh trùng các phân đoạn màng

Escherichia coli (E8) ATCC 11775

Tăng sinh

Qui mô nhỏ: E.coli trong 250ml BHI, lắc

250v/ph trong 24h

Quy mô lớn: nuôi tế bào E.coli trong các thiết

bị lên men 2l , với mức thông khí là 0.5-1.0 thể tích/diện tích chất lỏng/phút ở 37oC trong 24h

Bảo quản trên thạch nghiêng BHI và cấy

chuyền hàng tháng

Acetobacter xylinum ATCC 12878 Gluconobacter oxydans subsp suboxydans

 Qui mô lớn: A xylinum và G oxydans được nuôi cấy trong

các thiết bị lên men 2 lít với mức thông khí là 0,5 – 1,0 dung tích khí / dung tích chất lỏng ở 30 0 C trong thời gian 36h và 24h

Bảo quản ở ở 4 0 C cho tới khi cần sử dụng, cấy chuyền hàng tháng để duy trì trạng thái sống.

Phân đoạn màng có nguồn gốc vi

khuẩn

1) Chủng thí nghiệm

2) Các bước thực hiện

• Tăng sinh

• Thanh trùng các phân đoạn màng

Thu nhận các phân đoạn màng

Phân đoạn màng có nguồn gốc vi

khuẩn

1) Chủng thí nghiệm

2) Các bước thực hiện

• Tăng sinh

• Thu nhận các phân đoạn màng

• Thanh trùng các phân đoạn màng

Thanh trùng các phân đoạn màng

• Sử dụng phương pháp lọc vô trùng

Phân đoạn màng của E coli (E8) và

Gluconobacter được lọc 2 lần bằng lọc có đường kính lỗ là 0,45µm

Các phân đoạn màng của Acetobacter

được lọc bằng lọc có đường kính lỗ là

1,2µm, sau đó qua lỗ 0,8µm và cuối cùng qua lỗ 0,45µm 2 lần, bởi vì chúng có lớp polysaccharide

3 Phân đoạn màng có chức năng

tương tự oxyrase

3.1 Phân đoạn màng có nguồn gốc vi khuẩn

3.2 Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi

khuẩn (non- bacterial source)

Phân đoạn màng có nguồn gốc phi vi khuẩn

• Ti thể của các loại nấm, tảo, thực vật, có khả năng khử O2 thành H2O nếu có sự

hiện của chất cho điện tử

• Quá trình tạo phân đoạn màng theo các bước: Phân lập

Thu các mảnh

vỡ ty thể thô

Lọc vô trùng và bảo quản ở 0 o C

Siêu ly tâm siêu lọc

4 Một số sản phẩm oxyrase hiện nay

Oxyrase for Broth

4 Một số sản phẩm oxyrase hiện nay

• Oxyrase for Agar

 cần sử dụng kết hợp

Oxyrase for Agar với

OxyDish tối ưu hoá hoạt

Oxyrase: môi trường = 1:30

chỉ thêm vào môi trường lúc ở trạng thái tan chảy và chỉ thêm vào môi trường đã hấp khử trùng

4 Một số sản phẩm oxyrase hiện nay

OxyDish™

OxyDish là lồng chứa các

đĩa môi trường nuôi cấy

sau khi thêm Oxyrase for

Agar nhằm tạo điều kiện

thuận lợi để ủ vi khuẩn

trong điều kiện hiếu khí.

4) Một số sản phẩm oxyrase hiện nay

5) Một số sản phẩm oxyrase hiện nay

OxyPRAS™ Plates

Là loại môi trường làm sẵn ,

sử dụng tốt nhất so với

buồng ủ, bình yếm khí

hoặc túi ủ yếm khí để tạo

môi trường yếm khí hoàn

toàn, cũng là môi trường

5 Các triển vọng trong tương lai

• Tạo môi trường kị khí cho các nghiên cứu liên quan

• Loại bỏ oxy khỏi môi trường lỏng dung

môi nước thường ổn định mùi vị, màu sắc thực phẩm, giải khát

• Loại bỏ oxy khỏi môi trường dầu ngăn

ôi thiu sản phẩm dầu, thay đổi màu sắc

bơ, kem