Phương pháp xác định đường khử-đường tổng

Phương pháp xác định đường khử-đường tổng

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ ĐƯỜNG TỔNG

A.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG QUÁT

I Phương pháp Bertrand

Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm ( glucose,

fructose, maltose) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid

có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử

Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử Fehling 1 và 2 Khi

trộn hỗn hợp này ta có phản ứng :

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

Các phản ứng tiếp theo như sau:

Cu2O + Fe2(SO 4)3 + H2SO 4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O

10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO 4 +

8H2O

Từ lượng KMnSO4 tiêu tốn từ đó ta tính được Cu(I) và tính được

lượng Cu Do đó tính được lượng đường đã dùng

Vi dụ bảng tìm hàm lượng glucoza bằng phương pháp BERTRAND

BẢNG TÌM LƯỢNG GLUCOZA

0,1N(ml)

Glucoza(mg)

0,1N(ml)

Glucoza(mg)

0,1N(ml)10

11

12

3,243,553,87

343536

10,410,711,0

575859

16,917,217,4

818283

23,223,423,7

11,311,611,912,212,512,713,013,313,613,914,114,414,715,015,215,515,816,116,416,6

606162636465666768697071727374757677787980

17,718,018,218,518,819,019,319,519,820,120,220,520,821,121,321,621,822,122,422,622,9

84858687888990919293949596979899100

23,924,124,324,624,825,125,325,625,926,126,326,626,827,027,327,527,8

II.Phương Pháp Luff-Schoorl

Trong môi trường OH nhẹ, glucose bị khử trong thuốc thử Lupso

cho kết tủa Cu2O, dùng để định lượng glucose

O- Cu – O

COOH

Vi dụ :bảng tìm lượng glucoza theo LUFF-SCHOORL

BẢNG ĐỂ TÌM LƯỢNG GLUCOZA THEO LUFF-SCHOORL

2,42,42,5

13141516

33,035,738,541,3

2,72,82,8

17181920212223

44,247,150,053,056,059,162,2

2,92,92,93,03,13,13,1

III Phương pháp dùng đường kế

Dựa trên sự phân cực ánh sáng của saccharose và dùng đường kế

đo năng suất quang phân cực của sacchorose

Dụng cụ : đường kế ,nhiệt kế Bình định mức 100ml ,cân phân tích

Cân 2,6 g đường khử cho vào cốc nước cất, cho vào bình định mức, cho dung dịch vào đường kế Đọc chỉ số hàm lượng Saccharose trên đường kế

Trong 1 ống nghiệm, hút 1ml dung dịch saccharose và 1ml thuốc thử Fehling (pha 4 ml thuốc thử Fehling) Đun sôi cách thủy trong 3 phút, không có hoặc có ít trầm đỏ hiện ra

IV Phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5-dinitrosalycylic

acid

Có một vài tác nhân được dùng để định lượng đường nhờ đặc tính của đường 3,5-đinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam

V.Định lượng đường khử theo Schaffer-Hartmann:

Nếu ta pha trộn một dung dịch những ion đồng nhị thì ta có một cân bằng hóa học theo định luật tác dụng khối lượng :

Cu++ + 4I 2Cu+ +2I- + I2

Nếu có một chất nào đó nhận mất tất cả ion Cu++ cân bằng hoàn toàn dịch chuyển về phía trái ,trong dung dịch bây giờ chỉ có các chất hóa học oxalo-cuivric và những ion I chứ không còn một iod tự do nào nữa Bây giờ nếu ta thêm vào dung dịch một lượng thừa KIO3 và acid hóa dung dịch, IO3 - gặp ion I- phóng thích một lượng thừa ion là A Nếu ta khử một phân hợp chất oxalo Cu2+ thành Cu+

2Cu++ + 2OH- 2Cu+ + H2O

VI Phương pháp màu trên phổ quang kế

Ferricyanur

2K3Fe(CN)6 + KOH 2K4Fe(CN)4 + H2O + O

Các loại đường khử có khả năng khử Ferricyanur ( Fe3+) thành ferrocyanur ,ion này sẽ có màu xanh đậm ( xanh prusse) Nhờ vậy ta có thể dùng phương pháp này để định lượng đường

nước cất

Thuốc thử B : 375 mg K3Fe(CN)6 + 250 ml nước cất

VII Phương pháp đo màu

Nếu rọi một dòng sáng (cường độ I0) vào một cuvet đựng dung dịch thì một phần nhỏ của nó (cường độ Ir) bị phản xạ từ mặt cuvet, một phần khác (cường độ Ia) bị dung dịch hấp thụ, phần còn lại (cường độ It) đi qua cuvet Giữa các đại lượng này có hệ thức sau:

Trong thực tế, vì đối với một loại phân tích ta chỉ sử dụng một cuvet, nên cường độ dòng sáng phản xạ là không đổi, nó lại không lớn nên có thể bỏ qua Do đó phương trình trên có thể đơn giản thành:

Bằng cách đo trực tiếp ta có thể xác định được cường độ dòng sáng rọi vào (Io) và dòng sáng đi qua dung dịch thí nghiệm (It) Đại lượng Ia có thể tìm được theo hiệu số các đại lượng Io và It, chứ không đo trực tiếp được nó

Dựa trên nhiều thực nghiệm, P Bougueur rồi I Lambert đã thiết lập định luật phát biểu như sau: Những lớp chất hữu cơ chiều dày đồng nhất, trong những điều kiện khác như nhau, luôn luôn hập phụ một tỉ lệ như nhau của dòng sáng rọi vào những lớp chất đó

Định luật này được biểu diễn bởi phương trình:

It – Cường độ dòng sáng sau khi qua dung dịch

Io – Cường độ dòng sáng rọi vào

e – Cơ số logarit tự nhiên

L – Chiều dày của lớp

K – Hệ số hấp phụ

Nếu đổi sang cơ số logarit thập phân ta được phương trình có dạng: KL

o

t I

I = 10− (4)Trong phương trình này, hệ số K gọi là hệ số tắt Từ định luật này

ta suy ra:

1 Tỉ số giữa cường độ dòng sáng sau khi xuyên qua lớp dung dịch với cường độ dòng sáng rọi vào, không phụ thuộc vào cường độ tuyệt đối của dòng sáng rọi vào

2 Nếu chiều dày lớp dung dịch tăng theo cấp số cộng thì cường độ dòng sáng sau khi xuyên qua lớp đó giảm theo cấp số nhân

Để hiểu rõ ý nghĩa và trị số của hệ số K, ta giả thiết rằng cường độ dòng sáng sau khi qua lớp dung dịch giảm đi 10 lần, tức là:

Hệ số K chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan và bước sóng ánh sáng rọi vào Do đó định luật Bougueur_Lambert chỉ đúng cho tia đơn sắc, tức là cho ánh sáng có bước sóng xác định

Khi nghiên cứu sự hấp thụ ánh sáng bởi dung dịch, Beer đã xác định rằng hệ số tắt k tỉ lệ với nồng độ của chất hấp thụ, tức là:

ε - Hệ số không phụ thuộc nồng độ.

Định luật Beer tương tự định luật Bougueur_Lambert

Đinh luật Bougueur_Lambert khảo sát sự thay đổi độ hấp phụ ánh sáng dung dịch có nồng độ không đổi, khi thay đổi chiều dày lớp hấp phụ Còn định luật Bia khảo sát sự thay đổi độ hấp phụ ánh sáng bởi dung dịnh có chiều dày không đổi, khi thay đổi nồng độ

Kết hợp các công thức (4) và (6) ta được phương trình của định luật

cơ bản của phương pháp đo màu: định luật Bougueur_Lambert -Beer:

Bằng cách biến đổi phương trình (7) ta có thể rút ra ý nghĩa của một đại lượng thường gặp trong phương pháp đo màu

Tỷ số giữa cường độ dòng sáng sau khi qua dung dịch (It) với cường độ dòng sáng rọi vào dung dịch (Io) gọi là độ truyền qua, ký hiệu bằng:

VIII.Phương Pháp Sắc Ký Giấy

1.Nguyên lý cơ bản của phương pháp :

Có nhiều phương pháp sắc ký nhưng trong kỹ thuật chế biến thực phẩm, phương pháp sắc ký giấy được dùng nhiều nhất

2.Giấy sắc ký : là loại giấy có khả năng giữ trên bề mặt một lượng

nước lớn Trong khí quyển bão hoà hơi nước, giấy thấm được 22% nước, theo trọng lượng giấy Giấy sắc ký là loại giấy đặc biệt làm từ loại bông cao cấp, có hàm lượng xenluloza rất cao (>99%)

A

α

Trong đó :

A- Độ ẩm giấy

P- Khối lượng giấy

Căn cứ vào trị số Rf (trong cùng một hệ dung môi, ở cùng một nhiệt độ) ta có thể biết được thứ tự sắp xếp của các chất cần phân chia trên giấy, nghĩa là có thể định tính đựơc các chất (các giá trị Rf của các chất thường được công bố trong các sách)

Tuy nhiên, trong thực tế, nhất là ở điều kiện nước ta (khí hậu, thiết

bị, v.v…) giá trị Rf của chất cần phân chia thường không giữ được cố định, nên cách tốt nhất để nhận biết từng chất (định tính) là cho chất tiêu chuẩn và chất cần phân chia chạy song song trên cùng một giấy sắc ký

Muốn tủ sắc ký bão hoà hơi dung môi thì tủ phải kín và trong tủ nên đặt một số cốc chứa dung môi, trong mỗi cốc có đựng một vài tấm giấy sắc ký

- Trong lượng phân tử : nói chung trị số Rf tăng theo chiều tăng của trọng lượng phân tử các chất cần phân chia

- Dung môi : thường dùng rượu nhiều cacbon (butylic, amylic) làm dung môi chạy sắc ký các chất Nếu tăng hàm lượng nước trong hệ dung môi thì Rf cũng tăng Đặc biệt, nếu thêm axit hoặc bazơ vào hệ dung môi, sẽ làm thay đổi độ phân ly của chất tan, ảnh hưởng đến sự tích điện của nhóm chức phân cực của chất tan, do đó làm thay đổi rõ rệt trị số Rf, thậm chí có khi làm thay đổi cả thứ tự sắp xếp của các vết chất tan trên sắc phổ.

3.Dung môi :

Khả năng phân chia các chất phụ thuộc chủ yếu và hệ số phân bố của chất tan giữa hai tướng di động và bất động Do đó việc lựa chọn dung môi có ý nghĩa quan trọng hàng đầu Căn cứ để chọn dung môi di động :

- Cần phải chọn dung môi di động nào mà trong dung môi đó các chất bị phân chia có độ tan bé và cố định Nếu chất bị phân chia có độ tan lớn thì nó sẽ di chuyển song song với dung môi Nếu có độ tan bé trong dung môi di động thì chất cần phân chia sẽ nằm ngay tại vết chấm

Để phân chia tốt các chất thì hệ số phân bố của chúng phải lớn hơn 1 (α > 1), nghĩa là độ tan của chúng trong dung môi bất động phải lớn hơn dung môi di động

- Ngoài ra còn phải biết độ tan của các chất cần phân chia trong hỗn hợp của chúng khác nhau thế nào trong dung môi Trường hợp không khác nhau thì không thể phân chia được

- Đối với các chất tan trong nước thì dùng dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ – nước để làm dung môi di động Ngược lại, đối với các chất tan được trong dung môi hữu cơ mà không tan trong nước, thì dùng dung dịch nước bão hoà dung môi hữu cơ làm dung môi di động Trong trường hợp đầu, dung môi bất động là nước; trường hợp sau là các dung môi phân cực hoặc ít phân cực

4.Các phương pháp chạy sắc ký

Phương pháp một chiều : người ta cho dung môi di động chạy từ đầu trên của giấy xuống hoặc từ đầu dưới của giấy lên Cho dung môi di động từ dưới lên chỉ có kết quả tốt khi các chất cần phải chia có Rf khác

nhau rõ rệt Vì dung môi lúc này ngoài việc chịu tác dụng của lực mao dẫn hút lên, còn bị trọng lực kéo xuống.

Cho dung môi di động từ trên xuống thường được dùng để tách hỗn hợp các chất có Rf gần nhau Ưu điểm của phương pháp này là : nhờ sức hút của trọng lực làm dung môi chạy xuống nhanh hơn, giúp cho các chất dễ tách khỏi nhau hơn Tuy nhiên, phương pháp trên xuống đòi hỏi thao tác phức tạp hơn, nên để tách hỗn hợp ít chất và các chất có Rf khác nhau rõ rệt, người ta hay dung phương pháp dưới lên

- Phương pháp hai chiều : ưu điểm của phương pháp này là tách đựơc

không thể tách ra đựơc Trong phương pháp này, người ta cho hai dung môi chạy theo hai chiều giấy vuông góc với nhau

Ngoài ra còn phương pháp sắc ký tròn, cho dung môi chạy từ tâm giấy đặt nằm ngang toả ra các phía, song khả năng tách cũng không tốt lắm, nên phương pháp này cũng ít phổ biến

5 Các thuốc hiện màu sắc ký :

Giấy sắc ký sau khi được nhỏ các chất cần phân chia, để khô và cho vào tủ chạy sắc ký thì sau một thời gian nhất định, dung môi chạy trên giấy đến một đoạn nhất định, lấy giấy ra khỏi tủ và để khô và phun các thuốc hiện màu để hiện vết các chất cần phân chia trên sắc phổ

Nói chung, các thuốc hiện màu sắc ký là các chất hoá học, có phản ứng tạo thành hợp chất màu với chất cần phân chia (trong những điều kiện phản ứng nhất định : nồng độ thuốc hiện, nồng độ các chất cần phân chia, nhiệt độ, v.v…) Có hai loại thuốc hiện màu sắc ký :

- Thuốc hiện chung : là loại thuốc hiện có phản ứng với nhiều chất trong cùng hỗn hợp chất cần phân chia

- Thuốc hiện đặc biệt : là thuốc hiện chỉ có phản ứng đặc hiệu với một chất trong hỗn hợp chất cần phân chia

6.Sắc ký định lượng :

Định lượng là khâu cuối cùng, tiếp sau khâu định tính (tách các chất cần phân chia trên giấy sắc ký) Thường tiến hành định lượng như sau : Sau khi sắc phổ được hiện màu bằng thuốc hiện thích hợp, dùng bút chì khoanh những vòng tròn diện tích bằng nhau quanh vết màu chất cần

xác định và chất chuẩn (chấm trên cùng một giấy sắc ký và cùng một điều kiện chạy sắc ký) đồng thời khoanh một hoặc hai vòng trên khoảng giấy trắng (không có vết màu) để làm mẫu trắng Sau đó cắt những khoanh tròn ra khỏi giấy và cho vào ống so màu, cho dung môi thích hợp để thôi màu Để một thời gian cho màu thôi ra hết, rồi đem đo màu trên máy so màu với kính lọc và cuvet thích hợp.

B.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CACÙ LỌAI ĐƯỜNG

dịch Benedict, đun nóng tới 950C trong 2 phút

Đổi màu hoặc cho kết tủa màu đỏ gạchDung dịch

Fehling 1 và 2

2cm3 dung dịch chiết mô, đến

920C trong 2 phút

Đổi màu hoặc cho kết tủa màu đỏ gạchĐường

dung dịch chiết mô tươi với 1 cm3

dung dịch HCl loãng để thủy phân đường mía thành các đường đơn , trung hòa bằng NaOH, làm phép thử như đối với đường khử

Đổi màu hoặc cho kết tủa màu đỏ gạch

dung dịch KI

Nhỏ lên mẫu mô làm nát với nhiệt độ trong phòng

Màu xanh đen

dung dịch Nhỏ lên mẫu mô làm nát với nhiệt độ trong phòng Màu đỏ tím

Màu tím

phlorluxin acid hóa

Cho lát cắt mô cho vào dung dịch và đưa lên kính quang học để xem

Màu sáng đỏ

2 Các phép thử bằng Enzym

♦ Glucose : xác định bằng Enzym hexokinase theo các phản ứng sau

Galactose dehyrogenas hexokinase

D-mannose + ATP ADP + Mannose-6-phosphat

♦Rafinose có trong củ cải đường

Rafinose + H2O D-galactose + Saccharose

♦Tinh bột : có nhiều trong thực vật và trong một số vi sinh vật

Tinh bột + (n – 1) H2O n-D-glucose

3 Phản ứng với amin thơm

Nhiều amin thơm sẽ đông đặc lại với aldose và cetose trong acid acetic tinh khiết để hình thành các sản phẩm màu mà hệ số hấp thu của những chất này được dùng để định tính cho một glucid hoặc một nhóm glucid

Sử dụng những amin thơm hoặc đo lường hấp thu ở những bước sóng xoay chiều xen kẻ để cho ra một độ riêng biệt cho mỗi loại đường

Glucose, mantose, glactose phản ứng với toluidine tạo ra các sản phẩm có màu xanh với cùng hệ số cực đại hấp thụ ở 630nm trong khi đó fructose không hấp thu ở bước sóng này Disaccharide phản ứng ở những cấp độ khác nhau và pentose cho sản phảm màu mà phân tử có hệ số hấp thu trong khoảng 480-630nm

Các amin thơm được sử dụng bao gồm aminosalicylic acid, aminobezoic, diphenylamin, p-aminophenol P-aninophenol hoạt động ở nhóm ketose được dùng để định lượng fructose

4 Phản ứng với acid mạnh và phenol

Khi đun một acid mạnh với pentose và hexose bị đehydrat hóa tạo thành dẫn xuất furfural và hyroxyfurfural Nhóm andehyde của nhón này sẽ ngưng tụ với hỗn hợp phenolic tạo thành sản phẩm có màu làm cơ sở cho việc định tính glucid

♦Phản ứng màu của chất đường

Tất cả các chất đường đều cho máu tím đối với dung dịch Naphthol

2 giọt dung dịch Naphthol 15% trong rượu Lắc đều, nghiêng ống và cho

H2SO4 đậm đặc từ từ theo thành ống Có sự tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách giữa hai chất lỏng Nếu thay thế bằng anthrone tạo thành sản phẩm có màu xanh

∗ Phản ứng khử của đường

Tính khử oxygen của cetose và aldose

 Phản ứng với thuốc thử Fehling

và tartrat kép natrium và kalium Tác dụng của soude đậm đặc lên

diện của tartrat

2(CuO , H2O) → Cu2O + 2H2O + O

Trong một ống nghiệm đổ 1ml thuốc thử Fehling và 1ml dung dịch glucose Đun sôi cách thủy trong 5 phút có trầm hiện đỏ gạch Cu2O nhờ sự khử đồng nhị thành đồng nhất bởi glucose

2ml piric + 1 giọt kiềm đặc +1 ml glucose cho màu vàng

 Phản ứng với thuốc thử phenyl hydrozin

Trong môi trường acid acetic, chất đường tác dụng với phenyl hydrozin

cho ta một hợp chất gọi là osazon được biểu tính ở dạng tinh thể, quang

tính và dung điểm của chúng

CH3COOH đậm đặc và 5 ml nước cất Đun nhẹ lắc đều để hòa tan