KHẢO SÁT CƠ CHẾ DI TRUYỀN CỦA BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG TÝP I (WERDNIG-HOFFMANN) pps

KHẢO SÁT CƠ CHẾ DI TRUYỀN CỦA BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG TÝP I (WERDNIG-HOFFMANN) TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 ở người lành mang gen bệnh Werdnig-Hoffmann. Phương pháp: Chúng tôi dùng phản ứng khuếch đại cạnh tranh tạo ra các sản phẩm PCR của SMN1 và SMN2. Sau đó, làm đứt đoạn sản phẩm PCR của gen SMN bằng men Hinfl. Sản phẩm thu được sẽ được chạy điện di trên gel, rồi scan bằng máy ảnh Polaroid dưới tia cực tím, và phân tích đậm độ (phần mềm 1.16/ppc NIH Image) đối với hai dãi band 101 bp (SMN2) và 78 bp (SMN1). Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 được xác định dựa trên tỉ lệ đậm độ của đoạn 78 bp/101 bp. Kết quả: 11 (73,3%) người có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 0,5 và 1; bốn người còn lại (26,7%) có tỉ lệ là 1/3. Kết luận: Kết quả này hỗ trợ cho quan điểm cho rằng mất đoạn (deletion) chứ không phải chuyển đổi đoạn (conversion) là cơ chế di truyền chính trong bệnh Werdnig-Hoffmann. ABSTRACT Objective: To determine the SMN1/SMN2 ratios of carriers of Werdnig- Hoffmann disease. Methods: We used competitive PCR to amplified SMN1 and SMN2 gene products. The PCR products were digested by Hinfl. The samples were run on gel, and scanned by Polaroid camera under UV-light. Densitometric analysis was performed on the two bands that correspond to the 101 bp fragment of SMN2 and the 78 bp fragment of SMN1. The SMN1/SMN2 copy ratio was determined based on the 78 bp/101 bp ratio obtained from densitometric analysis. Results: We found that the SMN1/SMN2 ratio was 0.5 or 1 in 11 (73.3%) carriers; the remaining 4 (26.7%) carriers had an SMN1/SMN2 ratio of 1/3. Conclusion: The finding supports the idea that deletion rather than conversion is the main genetic event in Werdnig-Hoffmann disease. MỞ ĐẦU Bệnh teo cơ tủy sống (SMA) là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự yếu liệt và teo các cơ tiến triển do sự thoái hóa của các tế bào vận động ở sừng trước tủy sống. SMA gồm 3 thể lâm sàng, phân loại được dựa trên thời điểm khởi phát và mức độ trầm trọng của biểu hiện lâm sàng (13) . Bệnh nhân SMA type I (còn gọi là bệnh Werdnig-Hoffmann) không thể ngồi được nếu không được giúp đỡ, trong khi bệnh nhân SMA type III (bệnh Kugelberg-Welander) thì có thể đi được. SMA type II là thể trung gian với sự yếu cơ tiến triển chậm hơn SMA type I. Tần số mắc của SMA là 1 trên 10.000 lần sinh, với tần số người lành mang gen bệnh là 1/50 (15) . Gen SMN là gen gây bệnh SMA và được xác định là nằm trên nhiễm sắc thể 5q13 (1,12) . Không liên quan đến mức độ trầm trọng của bệnh, 90-98% các bệnh nhân SMA có sự mất đồng hợp tử của SMN1, do mất exon 7 hoặc 8 hoặc cả hai (6,10,16,22) . Phần lớn bệnh nhân người Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật có sự mất đồng hợp tử của exon 7 và 8 của gen SMN1 (2,8,18) . Gen protein ức chế sự tự chết tế bào thần kinh (neuronal apoptosis inhibitory protein: NAIP) là gen nằm gần với gen SMN. Chúng bị mất đoạn trong 50% bệnh nhân bị SMA type I (17) . Tần suất bị mất gen NAIP trong bệnh SMA thể nhẹ xảy ra ít hơn so với trong bệnh SMA type I, điều này có lẽ phản ảnh mức độ rộng của sự mất đoạn trên nhiễm sắc thể SMA (21,25) . Gen SMN là gen cần cho sự tồn tại và sống còn của các tế bào thần kinh vận động tủy sống. Gen SMN gồm hai gen khá giống nhau, đó là SMN1 và SMN2 trên nhiễm sắc thể 5q13. Cả hai gen đều có độ dài khoảng 20 kb nhưng chỉ khác nhau có 5 nucleotide. Ở bệnh nhân bị SMA, có ít nhất một gen SMN2 còn sót lại. Người bình thường có một gen SMN1 và một gen SMN2 trên mỗi nhiễm sắc thể, do đó, tỉ lệ SMN1/SMN2 là 1. Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 ở cha mẹ của bệnh nhân đã được sử dụng để phân tích vai trò của số gen SMN2 trên độ nặng của bệnh SMA. McAndrew và cs, và Velasco và cs nhận thấy rằng ở người Tây Ban Nha, Mỹ và Canada thì cha mẹ của bệnh nhân bị SMA type II và III có tỉ lệ SMN1/SMN2 nhỏ hơn so với cha mẹ của bệnh nhân SMA type I (11,22) . Tuy nhiên, Schwartz và cs (20) lại không ghi nhận hiện tượng này trong gia đình bệnh nhân người Scandinavi. Ngược lại, Nishio và cs lại ghi nhận tỉ lệ SMN1/SMN2 bằng 2 ở hai trong số bốn người lành mang gen bệnh, họ là cha mẹ của hai bệnh nhi người Nhật bị SMA type I (14) . Tác giả tiên đoán rằng tần suất tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 ở người lành mang gen bệnh trong dân Nhật cao hơn so với dân phương Tây (14) . Chúng tôi muốn tìm hiểu liệu tiên đoán này có đúng không. Do đó, chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ SMN1/SMN2 trên 15 người Nhật là người lành mang gen bệnh SMA type I. Để xác định tỉ lệ SMN1/SMN2, điều quan trọng là phải phân biệt được hai loại gen này. Chúng tôi dùng phản ứng khuếch đại cạnh tranh (competitive polymerase chain reaction: competitive PCR) bằng cách dùng mồi ghép cặp sai (mismatch primer) để tạo nên các vị trí hạn chế khác nhau (restriction site) (xem thêm phần Đối Tượng và Phương Pháp Nghiên Cứu) trên gen SMN1 và SMN2. Điều này cho phép chúng tôi phân biệt được SMN1 với SMN2, qua đó xác định được tỉ lệ SMN1/SMN2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng là 14 cha mẹ và 1 người em ruột bình thường về lâm sàng của 7 gia đình với 9 bệnh nhân bị SMA type I. Bảy gia đình này không có mối liên hệ huyết thống với nhau. Tất cả 9 bệnh nhân đều được xếp loại là SMA type I theo tuổi khởi phát và mốc vận động đạt được của trẻ dựa trên tiêu chuẩn của International SMA Consortium (13) . Tất cả bệnh nhân đều có đồng hợp tử mất đoạn exon 7 và 8 (18) . Phân tích haplotype của tất cả các bệnh nhân và thành viên trong gia đình cho thấy tất cả 14 cha mẹ và 1 người em ruột đều là người lành mang gen bệnh (xem them chi tiết trong tài liệu tham khảo 3). Ngoài ra, nhóm chứng gồm 19 người tình nguyện bình thường cũng tham gia trong nghiên cứu này. Phương pháp xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 Chúng tôi dùng phản ứng khuếch đại cạnh tranh (competitive PCR: PCR cạnh tranh) dựa trên mồi SMN ghép cặp sai như đã được mô tả bởi Wirth và cs (25) . Mồi ghép cặp sai sẽ tạo ra các vị trí hạn chế HinfI khác nhau trên SMN1 và SMN2. Mồi theo chiều xuôi (forward primer) là mồi ghép cặp sai được thiết kế dựa trên trình tự các nucleotid của SMN1 exon 7 (SMN7F: 5’- CTTCCTTTTATTTTCCTTACAGGGATT-3’), và mồi ngược (reverse primer) trên intron 7 (SMN7R: 5’-TCCACAAACCATAAAGTTTTAC-3’). Sản phẩm PCR của gen SMN sẽ có chiều dài là 135 bp. Phản ứng PCR cạnh tranh được thực hiện trong 20 µl hỗn hợp phản ứng, bao gồm 30 ng DNA của bộ gen (genomic DNA), 1 x Perkin-Elmer dung dịch đệm PCR, 200 µM của dNTP, 0,6 U Taq polymerase (Perkin-Elmer), và 10 pmol cho mỗi mồi SMN7F và SMN7R. Các điều kiện tiến hành phản ứng theo chu kỳ được thực hiện như đã được mô tả bởi Wirth và cs (25) với một chút thay đổi, là mẫu của chúng tôi được khuếch đại với 35 chu kỳ. Hình 1. Sản phẩm PCR sau khi được ủ với men HinfI và điện di trên gel polyacrylamide 16%. Hai dải band trên cùng, tương ứng với đoạn 101 bp của SMN2 và đoạn 78 bp của SMN1. Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 được xác định dựa trên tỉ lệ đậm độ của đoạn 78 bp/101 bp. Chúng ta thấy ở người lành mang gen bệnh vẫn còn đủ gen SMN1 và SMN2, như ở người cha (F) và mẹ (M). Trong khi bệnh nhân (P) thì không có gen SMN1 nhưng vẫn còn gen SMN2. Sau khi có sản phẩm PCR của SMN, chúng tôi ủ 10 µl sản phẩm PCR với 15 U men HinfI (Toyobo) ở nhiệt độ 37°C trong 3 giờ, để làm đứt đoạn gen SMN. Do sản phẩm PCR của SMN2 chỉ có một vị trí hạn chế HinfI nên chúng sẽ bị cắt thành hai đoạn với chiều dài là 101 và 34 bp, trong khi sản phẩm PCR của SMN1 có hai vị trí hạn chế HinfI nên chúng sẽ bị cắt thành ba đoạn có chiều dài là 78, 34, và 23 bp. Sau đó các sản phẩm này sẽ được chạy điện di trên gel polyacrylamide 16% ở điện thế 100 V trong 3 giờ, rồi được nhuộm bằng ethidium bromide, rồi scan gel đó bằng máy ảnh Polaroid dưới tia cực tím, và phân tích đậm độ bằng phần mềm 1.16/ppc NIH Image. Phân tích đậm độ được thực hiện đối với hai dải band trên cùng, tương ứng với đoạn 101 bp của SMN2 và đoạn 78 bp của SMN1 (Hình 1). Tỉ lệ gen SMN1/SMN2 được xác định dựa trên tỉ lệ đậm độ của đoạn 78 bp/101 bp. Để kiểm tra tính khả thi của việc xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 bằng phân tích tỉ lệ đậm độ, chúng tôi xác lập khoảng chuẩn về tỉ lệ đậm độ bằng cách xử dụng các hỗn hợp biết trước với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau. Gen SMN1 và SMN2 được khuếch đại bằng hai phản ứng PCR riêng rẻ. Một PCR để khuếch đại SMN1 từ một bệnh nhân với một bệnh lý thần kinh khác, người này chỉ có SMN1 mà không có SMN2. Trong khi SMN2 được khuếch đại từ mẫu của một bệnh nhân SMA, người này không có gen SMN1 nhưng còn SMN2. Sản phẩm của hai PCR này được làm tinh khiết bằng gel agarose với bộ kit chiết xuất ADN Supre TM -02 và -01 (Takara-Biochemicals). Các khuôn mẫu (template) pha trộn 9000 bản sao (copies) SMN1 với số lượng khác nhau của SMN2 để tạo các tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau là 2, 1, 0,5 và 1/3. Phản ứng PCR cạnh tranh với các tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau này được tiến hành tương tự như đã nêu ở trên. KẾT QUẢ Để kiểm tra tính khả thi của việc xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 bằng tỉ lệ đậm độ, chúng tôi xác lập khoảng chuẩn và đường biểu diễn về tỉ lệ đậm độ bằng cách dùng các hỗn hợp khuôn mẫu với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau đã được biết trước. Chúng tôi thấy có mối tương quan dương tính rõ rệt giữa tỉ lể phân tử (tỉ lệ khuôn mẫu SMN1/SMN2) và tỉ lệ sản phẩm PCR (tỉ lệ đậm độ SMN1/SMN2) trong khoảng 0-2 (Hình 2), với hệ số tương quan là r = 0,959. Điều này chứng tỏ rằng tỉ lệ gen SMN1/SMN2 có thể được xác định bằng cách phân tích đậm độ của các sản phẩm PCR. Sau đó, chúng tôi đã tiến hành xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 của 15 người lành mang gen bệnh và 19 người chứng bình thường. Tỉ lệ SMN1/SMN2 của mỗi người rơi vào một trong bốn nhóm là 1/3, 0,5, 1 và 2, mà không có trùng lắp. Điều đó chứng tỏ một cách tương ứng rằng số gen SMN1 là 1/3, phân nửa, bằng hoặc gấp đôi số gen của SMN2. Bốn người lành mang gen bệnh (26,7%) có tỉ lệ là 1/3, sáu người (40%, trong đó có người em) có tỉ lệ là 0,5, và năm người (33,3%) có tỉ lệ là 1 (Bảng 1 và Bảng 2). Tỉ lệSMN1/SMN2 Hình 2. Đường biểu diễn chuẩn PCR cạnh tranh. Trục hoành là tỉ lệ các hỗn hợp khuôn mẫu với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau đã được biết trước (1/3, 0,5, 1 và 2). Trục tung là tỉ lệ đậm độ của sản phẩm PCR cạnh tranh từ các khuôn mẫu với tỉ lệ SMN1/SMN2 khác nhau. Hệ số tương quan r là 0,959. Không có người lành mang gen bệnh nào có tỉ lệ là 2 hoặc không có gen SMN2. Ở nhóm chứng, 2 người (10,5%), 12 người (63,2%) và 5 người (26,3%) có tỉ lệ tương ứng là 0,5, 1 và 2. Không có người chứng nào có tỉ lệ là 1/3. Bảng 1. Tỉ lệ SMN1/SMN2 của người lành mang gen bệnh SMA type I (NLMGB SMA I) và người chứng bình thường (NCBT) [...]... axit amin được mã hóa b i exon 7, một số lượng nhỏ là protein v i chiều d i đầy đủ giống hoàn toàn v i protein của SMN1, và một số protein khác v i các tỉ lệ khác nhau Chính lượng nhỏ protein có chiều d i đầy đủ này có vai trò bù trừ quan trọng khi bị mất gen SMN1(4,23) Ngo i ra, Hsieh-Li và cs đã chứng minh rằng có sự tương quan mạnh mẽ giữa số lượng gen SMN2 và thể lâm sàng của SMA ở chuột(7) Nghiên... không ghi nhận một trường hợp nào có tỉ lệ là 2 trong 60 cha mẹ của bệnh nhân ngư i Scandinavi(20) McAndrew và cs chỉ ghi nhận 1 trường hợp (1,3%) trong tổng số 79 cha mẹ có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 ở ngư i Mỹ và Canada(11) Nghiên cứu của chúng t i không ghi nhận một trường hợp nào có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 Để kết luận, mặc dù đã có nghiên cứu cho rằng cơ sở di truyền học của bệnh SMA ở bệnh nhân ngư i Nhật... của bệnh SMA ở bệnh nhân ngư i Nhật khác v i ngư i phương Tây, kết quả nghiên cứu của chúng t i cho thấy tỉ lệ SMN1/SMN2 ở ngư i lành Nhật mang gen bệnh SMA type I phù hợp v i kết quả nghiên cứu được thực hiện ở ngư i phương Tây Kết quả này cũng hổ trợ cho quan i m cho rằng mất đoạn chứ không ph i chuyển đ i đoạn là cơ chế di truyền chính trong bệnh SMA type I ... hơn hoặc bằng 1 Mặc dù Nishio và cs cho rằng tỉ lệ SMN1/SMN2 là 2 ở bệnh nhân SMA type I là đặc trưng của bệnh SMA ở ngư i Nhật(14), kết quả nghiên cứu của chúng t i không ủng hộ nhận xét này Ngược l i, kết quả này phù hợp v i các kết quả nghiên cứu được thực hiện ở các nước phương Tây Velasco và cs nhận thấy rằng không có ngư i nào trong 112 cha mẹ của bệnh nhận SMA type I ngư i Tây Ban Nha có tỉ lệ... bình thường Một ngư i lành mang gen bệnh có tỉ lệ SMN1/SMN2 là 1:2 là do nhiễm sắc thể bệnh chỉ bị mất đoạn ngắn chứa SMN1 Vì phần lớn các bệnh nhân SMA type I trong lô nghiên cứu của chúng t i có mất đoạn rộng(3,9), chúng t i mong đ i tỉ lệ SMN1/SMN2 không lớn hơn 1 trong phần lớn các ngư i lành mang gen bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả ngư i lành mang gen bệnh trong nghiên cứu này đều có tỉ... F, M BÀN LUẬN Bệnh nhân SMA có nhiều kiểu hình lâm sàng khác nhau, từ thể nhẹ cho đến thể nặng Tất cả các thể đều có sự mất gen SMN1 đồng hợp tử, nhưng không có đột biến chuyên biệt nào trên gen SMN1 có thể gi i thích cho các thể lâm sàng khác nhau(1,6,10,12) Nghiên cứu của Wirth và cs cho thấy rằng kích thước của sự mất đoạn liên quan đến độ nặng của bệnh( 24), b i vì một số gen lân cận của SMN1 được... cứu của chúng t i cũng cho thấy rằng những bệnh nhân bị SMA type I có tần suất mất đoạn vùng SMA rộng trên 5q13(3,9) Tất cả những i u này chứng tỏ rằng có sự mất kèm theo của các gen bù trừ lân cận trên bệnh SMA type I Nếu một ngư i lành mang gen bệnh SMA type I có mất đoạn rộng, mất cả SMN1 và SMN2 trên nhiễm sắc thể bệnh, thì tỉ lệ SMN1/SMN2 của họ vẫn là 1/1 do họ có một SMN1 và một SMN2 trên nhiễm... xem là có vai trò bù trừ và i u chỉnh thể lâm sàng của SMA, ví dụ như gen SARF1 và btfp44(19) Do đó, mất đoạn càng rộng thì thể lâm sàng càng nặng Gen SMN2 là gen nằm gần v i SMN1 trên vùng SMA của nhiễm sắc thể 5q13, và giống gần như hoàn toàn v i SMN1 Có nhiều protein xuất phát từ gen SMN2, do có sự kết n i ở những vị trí khác nhau trong quá trình gi i mã(4,5) Trong số đó, chủ yếu là protein không...Tỉ lệ Phạm NLMGB NCBT SMN1/SMN2 vi tỉ lệ SMA I đậm độ 1/3 0,86 – 4 (26,7)* 0 0.90 0,5 0,98 – 6 (40.0) 2 (10,5) 1,04 1 12 1,15 2 1,06 – 5 (33,3) (63,2) 1,17 – 0 5 (26,3) 1,25 Tổng cộng 15 19 * Số trong ngoặc đơn là giá trị phần trăm Bảng 2 Phân bố của tỉ lệ SMN1/SMN2 trên ngư i lành mang gen bệnh SMA type I (NLMGB SMA I) ; F: cha; M: mẹ và S: em; NLMGB Gia SMN1/SMN2 SMA I đình thứ 1/3 0,5 1 1 M F 2 M, . Conclusion: The finding supports the idea that deletion rather than conversion is the main genetic event in Werdnig-Hoffmann disease. MỞ ĐẦU Bệnh teo cơ tủy sống (SMA) là bệnh di truyền. KHẢO SÁT CƠ CHẾ DI TRUYỀN CỦA BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG TÝP I (WERDNIG-HOFFMANN) TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỉ lệ gen SMN1/SMN2 ở ngư i lành mang gen bệnh Werdnig-Hoffmann. Phương. đình bệnh nhân ngư i Scandinavi. Ngược l i, Nishio và cs l i ghi nhận tỉ lệ SMN1/SMN2 bằng 2 ở hai trong số bốn ngư i lành mang gen bệnh, họ là cha mẹ của hai bệnh nhi ngư i Nhật bị SMA type I (14) .