Khảo Sát Đa Dạng Di Truyền Của Virus Đốm Trắng (WSSV) Trên Tôm Sú (Penaeus Monodon) Ở Các Hình Thức

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ ( Penaeus monodon) Ở CÁC HÌNH THỨC NI QUẢNG CANH CÁN BỘ HƢỚNG DẪN BÙI THỊ MINH DIỆU SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN KIM THÚY MSSV:3064420 LỚP:CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 5, năm 2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Kim Thúy DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Qua thời gian học tập trƣờng Đại Học Cần Thơ, em học đƣợc nhiều kiến thức bổ ích Bên cạnh kiến thức chun mơn cịn học quý báu lối sống, đạo đức, lĩnh niềm tin mà thầy cô dạy cho em Với đúc kết đƣợc cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô hƣớng dẫn Bùi Thị Minh Diệu, cô cố vấn Trần Thị Xuân Mai, tất thầy cô, anh chị Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sịnh hoc tận tình hƣớng dẫn, dạy, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em thời gian học tập đặc biệt qua trình thực luận văn Qua em xin chân thành cảm ơn gia đình ni dƣỡng ln sát cánh ủng hộ em sống đƣờng học vấn Cám ơn tất bạn lớp Công nghệ sinh học K32 ln bên em Để hồn thành đƣợc luận văn em đƣợc giúp đỡ tận tình chị Kim Hƣờng khoa thủy sản Đại học Trà Vinh, cám ơn chị nhiều Chân thành cảm ơn! Cần Thơ ngày 7/5/2010 Nguyễn Kim Thúy Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Cơng nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khố 32 - 2010 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC White spot syndrom virus ( WSSV) tác nhân gây bênh đốm trắng nghiêm trọng tôm sú Bệnh phát triển mạnh, lây lan nhanh, tỉ lệ chết cao, gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm VNTRs vùng tương đồng có khả biến đổi đơn vị lặp lại Ba thay đổi lớn VNTRs xác định vùng gen mang đơn vị lặp lại liên tục, không tương đồng, vùng mã hóa ORF75, ORF94 ORF125, chứng minh biến đổi số đơn vị lặp lại (RUs) chủng WSSV nhận biết Nghiên cứu đa dạng di truyền WSSV hình thức ni vùng biến đổi ORF75, ORF125, ORF94 nhằm tìm kiếm mối liên hệ yếu tố môi trường đến biến đổi di truyền để xác định nguồn thu mẫu thích hợp cho nghiên cứu dịch tễ học từ đóng góp vào việc hạn chế ngăn ngừa bệnh Đề tài thực xác định biến đổi vùng biến đổi ORF125, ORF75, ORF94 hình thức ni thuộc mơ hình quảng cạnh quảng canh Kết cho thấy chúng có khác hình thức ni hình thức ni khác Bên cạnh đó, hình thức ni tơm-rừng cải tiến nguồn mẫu phù hợp cho nghiên cứu dịch tễ ; ổn định di truyền cho thấy ORF125 làm dấu phân tử nghiên cứu dịch tể học phân tử WSSV quy mơ nhỏ (huyện) Từ khóa: White spot syndrome virus (WSSV), tôm sú, quảng canh, ORF75, ORF125, ORF94 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ i TÓM LƢỢC ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi TỪ VIẾT TẮT vii Chƣơng I: GIỚI THIỆU Chƣơng II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc tình hình ni tôm sú bênh tôm giới 2.2 Sơ lƣợc tình hình ni tơm sú bệnh tôm nƣớc ta 2.2.1 Tình hình ni tốm sú nƣớc ta 2.2.2 Tình hình dịch bệnh tơm sú 2.3 Các mô hình ni tơm sú nƣớc ta 2.3.1 Nuôi tôm quảng canh ( Extensive culture) 2.3.2 Nuôi bán thâm canh ( Semi-Intensive culture) 2.3.3 Nuôi thâm canh ( Intensive culture) 2.4 Tôm sú loại bệnh 2.4.1 Giới thiệu chung tôm sú 2.4.2 Một số bênh thƣờng gặp tôm sú virus gây 2.5 White spot syndrome virus 2.5.1 Hình thái 10 2.5.2 Bộ gen WSSV 10 2.5.1 Phân loại 15 2.6 Tình hình nghiện cứu giới đa dạng di truyền WSSV 16 2.7 Kỹ thuật PCR 17 PHẦN III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 20 3.2.1 Thiết bị, dụng cụ 20 3.2.2 Mồi, hóa chất 21 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT 3.3 Phƣơng pháp 22 3.3.1 Chuẩn bị mẫu 22 3.3.2 Tiến hành thí nghiệm 22 3.3.3 Ly trích ADN 22 3.3.4 Kiểm tra chất lƣợng ADN 23 3.4.5 Phản ứng khuếch đại PCR 23 3.4.6 Điện di 24 3.4.5 Ghi nhận kết 24 Chƣơng IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1Hình thức nuôi tôm- rừng 25 4.2 Hình thức ni tơm-lúa 27 4.3 Hình thức ni tơm cải tiến 29 4.4 Vùng biến đổi ORF14/15 ORF23/24 31 4.4 So sánh hình thức ni 33 Chƣơng V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Cơng nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khố 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Số đơn vị lặp lại ORF 15 Bảng 2: Các mồi sử dụng thí nghiệm 21 Bảng : Các kiểu gen VNTR WSSV hình thức ni tơm-rừng 25 Bảng 4: Kiểu gen WSSV hình thức tơm –lúa 27 Bảng 5: Kiểu gen cảu WSSV hình thức ni tơm cải tiến 29 Bảng 6: Kiểu gen WSSV vùng biên đổi ORF 14/15 ORF 23/24 31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Sản lƣợng tơm từ năm 1970 đến năm 2002 Hình 2: Mơ hình tơm- rừng Hình 3: (A) Ngƣời ni tôm chuẩn bị bơm nuớc vào vuông tôm cải tiến (B) Mơ hình ni tơm- lúa Hình : (A) Ảnh chụp tơm sú (P monodon) ,(B) Hình tơm bị bệnh đốm trắng Hình : Chu kỳ sống tơm sú Hình 6: Ảnh chụp virion WSSV dƣới kính hiển vi điện tử Hình 7: Mơ hình virion WSSV 10 Hình 8: Bản đồ di truyền gen DNA WSSV –TH 12 Hình 9: Vùng biến đổi đoạn lớn WSSV chủng WSSV- TH, WSSV –CN, WSSV –TW 13 Hình 10: Vùng biến đổi tái tổ hợp 14 Hình 11: Cây phát sinh lồi 16 Hình 12 : Một số thiết bị sử dung thí nghiệm: (A) máy chup gel, (B) mây PCR, (C) máy ly tâm, (D) Bộ điện di 20 Hình 13: Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ORF 75-flank 26 Hình 14: Hình gel điện di sản phẩm PCR ORF 125 có mẫu xuất band 28 Hình 15: band rõ điện di mẫu 116 30 Hình 16: Một vài mẫu phân tích với ORF 14/15 32 Hình 17: ORF 23/24 có xuất band thứ hai 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT RU VNTR WSSV WSSV-CN WSSV-TH WSSV-TW WSSV-VN RFLP PCR OD Repeat Unit Variable in the number of tandem repeat White Spot Syndrome Virus Chủng WSSV ly trích từ mẫu tơm có nguồn gốc từ Trung Quốc Chủng WSSV ly trích từ mẫu tơm có nguồn gốc từ Thái Lan Chủng WSSV ly trích từ mẫu tơm có nguồn gốc từ Đài Loan Chủng WSSV ly trích từ mẫu tơm có nguồn gốc từ Việt Nam Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase chain reaction Optical Density Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT Chƣơng 1: GIỚI THIỆU Tơm nói chung tơm sú nói riêng nguồn lợi vô to lớn cho ngƣời Đây nguồn dinh dƣỡng tốt, ăn ngon, nguồn lợi kinh tế cho ngƣời nuôi góp phần khơng nhỏ vào kinh tế quốc dân Nhƣng việc nuôi tôm gặp nhiều rủi ro tôm bị nhiễm bệnh chết hàng loạt gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngƣời ni Tình hình dịch bệnh tôm nƣớc giới đƣợc nghiên cứu nhiều Tuy nhiên, nghiên cứu chƣa đƣa hƣớng điều trị hiệu cho bệnh virus gây Chính điều thúc đẩy trình nghiên cứu để tìm hƣớng giải tối ƣu để giúp ích cho ngƣời dân Ngƣời dân nuôi tôm tỉnh Đồng sơng Cửu Long thời gian qua gặp khơng khó khăn vụ ni khơng đạt hiệu dịch bệnh Sự chuyển đổi sản xuất từ trồng lúa sang nuôi tôm không mang lại kết nhƣ mong muốn Các mơ hình ni tơm ngƣời dân cịn có nhiều điểm cịn hạn chế Diện tích ni tôm quảng canh lớn nƣớc đặc biệt tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau… mầm móng nguồn bệnh phát sinh đặc điểm khơng kiểm sốt đƣợc dịch bệnh mơ hình Từ nguồn nƣớc, nguồn thức ăn, đối tƣợng khác ao ni …có thể nguồn ký chủ trung gian gây bệnh Bên cạnh nguồn tơm giống nhiễm bệnh đƣợc di chuyển khắp nơi khiến dịch bệnh khó kiểm sốt Bệnh virus đốm trắng (White spot syndrome virus_WSSV) dịch bênh nghiêm trọng tôm Tuy nhiên, kiến thức lan truyền virus nhiều vấn đề chƣa đƣợc hiểu rõ Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử, việc khám phá gen WSSV mở nhiều hƣớng nghiên cứu Với gen có kích thƣớc khoảng 300kp, biến đổi di truyền xảy WSSV thƣờng xun Ngồi vùng gen có tính bảo tồn cao nhƣ VP28, VP26, VP24, VP15,…thì số locus gen WSSV cho thấy có biến đổi di truyền chủng khác nhau, biến đổi thƣờng xảy đoạn thiếu hụt (deletion), biến đổi nhỏ dọc theo gen (ORF14/15, ORF75, ORF94 ORF125) (Marks,H., et al., 2005) Trên giới nay, nghiên cứu dịch tể học phân tử WSSV việc thu mẫu thực cách ngẫu nhiên, khơng đặc trƣng, thiếu tính đại diện Chính vậy, xác định nguồn mẫu đặc trƣng phù hợp nghiên cứu dịch tể học WSSV cần thiêt Đối với nƣớc ta, Đồng Sông Cửu Long- vùng trọng điểm nuôi tôm nƣớc- nuôi tôm quảng canh phƣơng thức nuôi chủ yếu, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Cơng nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khố 32 - 2010 Trường ĐHCT giả thiết Tuy nhiên với kết tiến hành nghiên cứu thêm để khẳng định nguồn gốc, hƣớng lan truyền chủng WSSV từ thiết kế phƣơng pháp ngăn ngừa dịch bệnh hiệu T + 2a 11d 60 4a 4b 16b 5a 6a 19b 114 500bp Hình 16: Một vài mẫu phân tích với ORF 14/15 ORF23/24: sản phẩm PCR với primer ORF23/24 South có kích thƣớc lớn 400bp (bảng 6), có khác biệt kiểu di truyền với chủng phân lập trƣớc Theo Dieu, B T M, 2010 với cặp mồi ORF23/24- south, kích thƣớc PCR ~ 400bp WSSV có khoảng thiếu hụt 11 866bp so với trình tự WSSV- TW Từ cho thấy chủng WSSV đoạn nhỏ 11 866bp Vùng biến đổi đoạn lớn ảnh hƣởng đến trình chép WSSV, lây lan, xâm nhiễm gây chết tôm Trong cá thể ký chủ tồn nhiều chủng WSSV khác thể đa hình phân tích gel (Hình 14, hình 17) Trong trình phát triển WSSV ký chủ chúng có cạnh tranh Với kiểu di truyền thích hợp thích nghi chủng WSSV dần trở thành chủng WSSV chiếm ƣu quần thể Với gen có đoạn lớn, trình chép xảy nhanh hơn, khả lan truyền mạnh chủng cho sản phẩm PCR với OR23/24 - south nhỏ có khả chép nhanh, lan truyền mạnh chủng WSSV chiếm ƣu quần thể Qua trình phát triển chủng lan truyền, phát triển ký chủ biểu nhiều hơn, thể gel đậm hơn, nguyên nhân gây chết chủ yếu tôm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC & PT Cơng nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khố 32 - 2010 Trường ĐHCT 14b 3a 12b 12c 12d 15a 500bp 4a 16a 16b 19b 7c (+) >1kb 500bp 400bp Hình 17: ORF 23/24 có xuất band thứ hai 4.4 So sánh hình thức ni Ở ba hình thức ni tơm- rừng, tơm –lúa, cải tiến có khác kiểu di truyền thể mẫu ao, ao hình thức ni cho thấy đa dạng WSSV ORF75 có khác biệt hình thƣc ni Ở hình thức tơm-rừng có kiểu gen, cải tiến có biến đổi gen, tơm-lúa có kiểu gen ORF125 xảy biến đổi truyền nhƣng mức độ biến đổi Ở hình thức tơm- rừng cải tiến có ổn đinh kiểu gen đặc trƣng ORF94 có biến đổi di truyền khác biệt hình thức ni bên cạnh cịn thể khác biệt độ chênh lệch lớn số đơn vị lặp kiểu gen Kết ổn định ORF14/15 ORF23/24 Ở ORF14/15 có kiểu di truyền 500bp 600bp kiểu di truyền đặc trƣng chủng WSSV Việt Nam ( Dieu, B.T.M et al 2004) Đối với ORF23/24 tất cho kích thƣớc PCR lớn 1kb, có mẫu 700bp Cho thấy marker thích hợp cho mơ hình hay khơng gian nhỏ đơn vị huyện Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với mục đích khảo sát đa dang di truyền WSSV để xác định kiểu di truyền dự đoán nguồn gốc chủng WSSV vùng địa lý khác Từ đƣa nhận định hƣớng lan truyền chế biến đổi di truyền WSSV nghiên cứu thực với mẫu tôm bệnh đốm trắng đƣợc thu từ ao nuôi tôm quảng canh: tôm – rừng, tôm - lúa, cải tiến thời điểm khác Kết nghiên cứu cho thấy có đa dang di truyền WSSV hình thức ni khác thuộc mơ hình ni tơm quảng canh Kiểu gen ORF75 ORF94 biến động nhiều hình thức nuôi Do đặc điểm nuôi mà kiểu di truyền hình thức ni tơm- lúa chủ yếu kiểu di truyền nguồn giống (1) ORF125 ổn định huyện Đầm Dơi, hình thức tơm-rừng cải tiến bên cạnh điểm thời gian thu mẫu khác Chính vùng biến đổi làm dấu phân tử cho nghiên cứu dịch tể học phân tử WSSV mơ hình quảng canh đặc biệt huyện Đầm Dơi (2) Dựa vào kết khảo sát vùng biến đổi ORF125 cho thấy hình thức ni tơm–rừng cải tiến thích hợp cho việc thu mẫu phục vụ cho nghiên cứu lan truyền WSSV mơ hình quảng canh (3) VNTRs có hiệu khảo sát đa dạng di truyền quy mô nhỏ Đối với ORF 75 94 tốt khảo sát đa dạng quy mô ao hay ao kế cận (4) Vùng biến đổi ORF23/24 ORF14/15 khơng thích hợp khảo sát đa dạng di truyền quy mô nhỏ 5.2 Đề nghị Do thời gian nghiên cứu đề tài bị giới hạn gặp khó khăn việc thu mẫu nên có nhiều vấn đề mà phạm vi đề tài chƣa đƣợc nghiên cứu Qua kết nghiên cứu , đề tài có vài kiến nghị: Cần phải thu nhiều mẫu đủ để nghiên cứu thêm mức độ biến động ORF94 so với ORF125 ORF75 Phân tích tƣơng quan di truyền ORF14/15 tôm thẻ chân trắng tôm sú Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT Giải trình tự để đƣa nhận định xác đa dang WSSV, xác định chủng WSSV Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng đến cấu trúc di truyền WSSVở mơ hình cơng nghiệp, mơ hình bán cơng nghiệp hình thức ni quảng canh Nghiên diện chủng WSSV khác cá thể để xác định mối liên hệ kiểu gen tính độc virus So sánh khác biệt di truyền chủng WSSV từ mẫu tôm chết sống ao bị nhiễm WSSV Từ nhận định chất WSSV, nguồn gốc, đặc điểm tính độc… để thiết kế chiến lƣợc phịng chóng hiệu Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 35 Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bernard R Glick & Jack J Pasternak (bản dịch) 2007 Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý ứng dụng AND tái tổ hợp NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Bùi Thị Nga & R Roijackers, 2004 Ảnh hƣởng rừng ngặp mặn hệ thống nuôi tơm rừng Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2004: 26-31 Trƣờng Đại học Cần Thơ Huỳnh Thị Tú, Nguyễn Thanh Phƣơng, Silvestre F, Douny.C, Châu Tài Tảo, Maghuin-Rogister G Kestemont P, 2006 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc – hóa chất nuôi tôm tồn lƣu Entrofloxacin Furazolidone tơm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2006: 70 -78 Trƣờng Đại học Cần Thơ Trần Ngọc Hải & Nguyễn Thanh Phƣơng 2009 Nguyên lý kỹ thuật nuôi tôm sú (Penaeus monodon) NXB Nông nghiệp Tp HCM Tiếng Anh Cai, S.L., Huang, J., Wang, C.M., Song, X.L., Sun, X., Yu, J., Zhang, Y., and Yang, C H 1995 Epidemiological studies on the explosive epidemic disease of prawn in 1993-1994 J China Fish 19,112-117 Dieu,B.T.M., Marks,H., Siebenga, J.J, Goldbach,R.W, Zuidema,D., Duong,T.P & Vlak, M.J 2004 Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam Journal of General Virology 85, 3607–3618 Dieu, B.T.M., Marks H, Zwart, M.P., & Vlak J.M 2010 Evaluation of white spot syndrome virus variable DNA loci as molecular markers of virus spread at intermediate spatiotemporal scales Journal of General Virology 91, 1164–1172 Durand, S., Lightner, D.V., Redman, R.M., and Bonami, J.R 1997 Ultrastructure and morphogenesis of White Spot Syndrome Baculovirus (WSSV) Dis Aquat Org 29, 205-211 Escobedo-Bonilla, C.M., Alday-Sanz, V., Wille1, M., Sorgeloos, P., Pensaert, M.B., & Nauwynck, H.J 2008 A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome Virus Journal of Fish Diseases 31, 1–18 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC & PT Cơng nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khố 32 - 2010 Trường ĐHCT Hendrik Marks, 2005 Genomics and transcriptomics of White spot syndrome virus PhD thesis Wageningen University – with references – with summary in Dutch ISBN: 90-8504-318-2 Lightner, D.V 1996 A Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Penaeid Shrimp Special publication of the World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA Marks,H., Mennens, M., Vlak, J.M., &Van Hulten,M.C.W 2003 Transcriptional analysis of the white spot syndrome virus major virion protein genes.Journal of General Virology 84, 1517–1523 Marks, H., Vorst, O., Van Houwelingen, A.M.M.L., Van Hulten, M.C.W., & Vlak1, J.M 2005 Gene-expression profiling of White spot syndrome virus in vivo Journal of General Virology 86, 2081–2100 Mayo, M.A 2002 A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV Arch Virol 147, 2081-2100 Tsai, J.M., Wang, H.C., Leu ,J.H., Hsiao, H.H., Wang, A.H.J., Kou, G.H., & Lo,C.F 2004 Genomic and Proteomic Analysis of Thirty-Nine Structural Proteins of Shrimp White Spot Syndrome Virus Journal of virology , p 11360–11370 Van Hulten, M.C.W., Goldbach, R.W., and Vlak ,J.M 2000 Three functionally diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by gene duplication Journal of General Virology 81, 2525–2529 Van Hulten, M.C.W., Westenberg, M., Goodall, S.D., and Vlak, J.M 2000c Identification of two major virion protein genes of White Spot Syndrome virus of shrimp Virology 266, 227-236) Van Hulten M.C.W., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer.N., Tarchini.R.,² Fiers.M., Sandbrink.H.,² Lankhorst R K.,² and Vlak J M 2001.The White Spot Syndrome Virus DNA Genome Sequence Virology 286, 7-22 Wongteerasupaya, C., Vickers, J.E., Sriurairatana, S., Nash, G.L., Akarajamorn, A., Boonsaeng, V., Panyim, S., Tassanakajon, A., Withyachumnarnkul, B., and Flegel, T.W 1995 A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon Dis Aquat Org 21, 69-77 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT Wang, Q, Nunan, L.M., Lightner, D.V 2000 Identification of genomic variations among geographic isolates of white spot syndrome virus using restriction analysis and Southern blot hybridization Dis Aquat Org 43: 175–181 Witteveldt, J., Vermeesch, A.M., Langenhof, M., de Lang, A., Vlak, J.M & van Hulten, M.C.W 2005 Nucleocapsid protein VP15 is the basic DNA binding protein of White spot syndrome virus of shrimp Arch Virol 150, 1121-1133 Trang web http://agriviet.com/ ( ngày 12/3/ 2010) http://vst.vista.gov.vn ( ngày 26/4/2010) http://www.fao.org/fi/figis ( ngày 12/7/ 2009) http://diendan.camau.gov.vn( ngày 22/7/ 2009) http://google.image.com.vn ( ngày 23/4/ 2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Thông tin chung mẫu: Stt Mẫu Ký hiệu Nơi thu ngày thu Hình thức ni Kích thƣớc ORF 75 Kích thƣớc ORF 125 RU 17 ĐH1a_8_CT Đông Hải-Bạc Liêu 7/8/2009 cải tiến 360 630 18 ĐH2a_8_CT Đông Hải-Bạc Liêu 7/8/2009 cải tiến 460 630 30 ĐH3a_8_CT Đông Hải-Bạc Liêu 7/8/2009 cải tiến 460 700 86 ĐD4a_10_CT Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 cải tiến 860 500 87 ĐD4b_10_Ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 cải tiến 860 500 105 ĐD5a_10_Ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Cải tiến 500 107 ĐD6a_10_ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Cải tiến 115 ĐD7a_10_ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Cải tiến 460 500 116 ĐD7b_10_ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Cải tiến 500 500 10 117 ĐD7c_10_ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Cải tiến 500 11 118 ĐD7d_10_ct Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Cải tiến 12 HD8a_5_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 1/5/2009 13 HD8b_5_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 1/5/2009 HD9a_5_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 15 HD9b_5_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 16 35 HD10a_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 17 36 HD10b_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 18 42 HD11a_7_TL 19 20 43 44 21 Kích thƣớc ORF 94 RU 700 550 600 4 600 600 4 600 500 500 500 500 900 10 Tôm -lúa 500 750 600 Tôm -lúa 500 700 Tôm -lúa 500 750 Tôm -lúa 500 750 Tôm -lúa 500 670 1000 12 29/7/2009 Tôm -lúa 460 600 900 10 Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 Tôm -lúa 460 630 1000 12 HD11b_7_TL HD11c_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 29/7/2009 Tôm -lúa Tôm -lúa 500 500 900 600 10 45 HD11d_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 Tôm -lúa 500 600 22 56 HD12a_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 Tôm -lúa 500 670 900 10 23 57 HD12b_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 Tôm -lúa 460 600 900 10 24 58 HD12c_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 Tôm -lúa 460 600 900 10 25 59 HD12d_7_TL Hồng Dân-Bạc Liêu 29/7/2009 Tôm -lúa 460 600 900 10 26 64 HD13a_4_TL Hồng Dân-Bạc Liêu Tôm -lúa 500 500 600 27 50 ĐD14a_7_TR Đầm Dơi-Cà Mau 29/7/2009 Tôm -rừng 500 500 800 28 51 ĐD14b_7_TR Đầm Dơi-Cà Mau 29/7/2009 Tôm -rừng 460 500 29 84 ĐD15a_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 900 500 600 30 85 ĐD15b_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 900 500 600 31 88 ĐD16a_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 400 500 600 32 89 ĐD16b_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 400 500 650 33 92 ĐD17a_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 1000 500 600 34 106 ĐD18a_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 400 35 111 ĐD19a_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 1100 600 36 112 ĐD19b_10_TR Đầm Dơi-Cà Mau 3/10/2009 Tôm-rừng 400 600 14 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1/5/2009 1/5/2009 31/7/2009 20/4/2009 700 700 Viện NC & PT Cơng nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khố 32 - 2010 Trường ĐHCT Hình gel PCR + ORF 94 + 18 36 42 44 51 57 86 43 115 18 36 42 44 57 86 + B A Hình 1: (A) Kích thƣớc mẫu sản phẩm PCR với ORF94-Flank khơng thang chuẩn, (B) Có thang chuẩn 1kb T 50 52 56 57 64 84 85 88 92 105 106 111 116 118 (-) 107 1kb A 10 12 13 17 30 35 42 500bp B 17 30 43 57 58 59 45 87 89 112 117 (-) 500bp C Hình 2: Sản phẩm PCR với ORF 94 A,B,C Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT + Với ORF 75 T 50 64 87 105 115 (+) (-) 860bp 460bp 500bp 500bp T 13 35 43 45 52 56 60 85 92 106 111 116 118 (+) (-) 1kp 500bp 500bp 400bp 900bp T 17 18 30 36 42 44 51 57 58 59 84 86 88 89 112 117 860bp 500bp 500bp 400bp 350bp Hình 3: Hình gel sản phẩm PCR với cặp mồi ORF75- Flank Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT + Với ORF 125 T 51 57 58 59 84 86 600bp 500bp 500bp T 17 + 18 30 36 500bp 42 117 44 700bp 88 T 13 89 35 43 45 112 52 56 60 85 92 106 111 116 118 (+) 500bp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 T Trường ĐHCT T 50 64 87 105 115 (+) 500bp Hình 4: hình gel thể kích thƣớc mẫu sản phẩm PCR125- Flank + ORF 14/15 T T 58 30 36 105 111 117 12 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 43 52 25 115 84 + 85 118 Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT T 57 59 88 92 T 10 17 35 42 93 + 134 44 + 51 Hình 5: Sản phẩm PCR với cặp mồi ORF 14/15- Screen + ORF 23/24 30 51 57 58 59 84 86 88 89 112 117 TH(+) Hình 6: Gel điện di sản phẩm PCR ORF23/24 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 T 17 H Trường ĐHCT 18 X 30 N1 36 N2 42 44 Hình 7: Sản phẩm PCR với cặp mồi ORF 23/24 Các mẫu H, X, N1,N2 thuộc thí nghiệm khác Vị trí địa lý số huyện tỉnh Bạc Liêu- Cà Mau Huyện Đông Hải Bạc Liêu Đầm Dơi Cà Mau nằm giáp ranh nhau, cửa biển Gành Hào cửa ngỏ dòng chảy từ biển vào quan hai huyện Huyện Hồng Dân thuộc Bạc Liêu khơng nằm giáp biển nhƣng có hệ thống sơng ngịi chằng chịt mang dòng chảy nƣớc mặn vào Huyện Đơng Hải Diện tích 538,8 km2 Đơng Hải huyện phía Nam tỉnh Bạc Liêu; Bắc giáp huyện Giá Rai; Tây giáp huyện Đầm Dơi, tỉnh Cà Mau, ranh giới sơng Gành Hào; Đơng giáp huyện Hồ Bình; Nam giáp biển Về hành chánh, huyện bao gồm thị trấn Gành Hào 10 xã là: Long Điền, Long Điền A, Long Điền Đông, Long Điền Tây, Điền Hải, An Trạch, An Trạch A, An Phúc, Định Thành, Định Thành A Huyện có diện tích lớn tỉnh Bạc Liêu, địa hình phẳng thấp trũng phía Tây, đất phèn, nhiễm mặn Quốc lộ 1A chạy cắt ngang huyện Sông Gành Hào, kênh Cà Mau - Bạc Liêu tuyến giao thông thủy quan trọng huyện Huyện có 24 km bờ biển, cửa sơng lớn: cửa Cống Cái Cùng, cửa Gành Hào, có nhiều tiềm phát triển du lịch kinh tế biển, đặc biệt nghề làm muối nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, nay, Đông Hải huyện nghèo, phát triển kinh tế chƣa tƣơng xứng với tiềm Huyện Hồng Dân Diện tích 423,7 km2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ SInh học Luận văn Tốt nghiệp khoá 32 - 2010 Trường ĐHCT Huyện nằm phía Bắc tỉnh Bạc Liêu; Bắc giáp huyện Long Mỹ tỉnh Hậu Giang huyện Gò Quao tỉnh Kiên Giang; Nam giáp huyện Phƣớc Long tỉnh; Tây giáp huyện Vĩnh Thuận tỉnh Kiên Giang; Đông giáp huyện Ngã Năm tỉnh Sóc Trăng Về hành chính, huyện bao gồm thị trấn Ngan Dừa xã: Vĩnh Lộc, Vĩnh Lộc A, Ninh Hoà, Ninh Quới, Lộc Ninh, Ninh Quới A, Ninh Thạnh Lợi, Ninh Thạnh Lợi A Huyện Đầm Dơi Diện tích 782,1 km2 Huyện phía Đơng Nam tỉnh Cà Mau; Bắc giáp thành phố Cà Mau tỉnh Bạc Liêu; Nam giáp huyện Năm Căn; Tây giáp huyện Cái Nƣớc; Đơng giáp biển Đơng Về hành chính, huyện bao gồm thị trấn Đầm Dơi 15 xã: Thanh Tùng, Quách Phẩm, Quách Phẩm Bắc, Trần Phán, Tân Duyệt, Tạ An Khƣơng, Tạ An Khƣơng Đông, Tạ An Khƣơng Nam, Tân Đức, Tân Tiến, Nguyễn Huân, Tân Thuận, Ngọc Chánh, Tân Trung, Tân Dân Đầm Dơi huyện nơng, q trình cơng nghiệp hố cịn thấp, mức độ thị hố chƣa cao, nên tài ngun thiên nhiên môi trƣờng chƣa bị ảnh hƣởng nhiều Huyện có tiềm du lịch sinh thái du lịch biển, sân chim Đầm Dơi bãi cát cửa biển Giá Lồng Đèn nơi có khả thu hút nhiều khách ngồi nƣớc đến tham quan Hình 8: Vị trí địa lý Hồng Dân, Đông Hải, Đầm Dơi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ SInh học ... tài “ Khảo sát đa dạng di truyền virus đốm trắng (WSSV) tốm sú hình thức ni quảng canh” đƣợc thực với mong muốn đóng góp phần kiến thức sở mối liên hệ đa dạng di truyền virus đốm trắng hình thứcni... tổ tiên (Dieu B.T.M., et al, 2004) Sự đa dạng di truyền chủng WSSV phức tạp Theo Dieu.B.T.M mơ hình ni khác ảnh hƣởng đến đa dạng di truyền tính độc virus Tác giả cho có ảnh hƣởng mơ hình ni thay... chiếm 11.1% Hình thức ni có đa dạng di truyền vùng biến đổi ORF75 (Bảng 5) Cũng giống hình thức phân tích trên, ORF ao xảy khác biệt mẫu phân tích Có thể thấy đa dạng di truyền ORF75 hình thức ni