Luận văn : KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO part 2 pps

xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây 13 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28 Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 35 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36 Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 37 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 38 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 41 Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 43 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 46 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE 50 N2 N3 N1 I2 xii Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE 53 Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy 54 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa 7 Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa 8 Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline 10 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine 11 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất 12 Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy 39 Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày 42 Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 42 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA 44 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 45 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA 46 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 47 Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l 48 Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo tươi 49 Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo khô 50 xiv Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. 52 Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi 52 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô 34 Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 51 Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo 53 xv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TDC : Tryptophan decarboxylase STR : Strictosidine synthase TIA : Terpenoid indole alkaloid EOF : electroosmosis flow CE : Capillary electrophoresis HPLC : High – performance liquid chromatography DNA : Deoxy nucleic acid MS : Murashiga & Skoog IAA : Indole-3-acetic acid NAA : 1-Naphthalene acetic acid BA : Benzyladenine CRD : Completely Randomized Design 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thực vật bậc cao được coi là nguồn nguyên liệu quý giá để cung cấp các hợp chất thứ cấp đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Hiện nay, trên toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang phải sống chung với căn bệnh này và mỗi năm có thêm khoảng 11 triệu trường hợp mắc bệnh mới. Trong khi đó các loại thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hướng của thế giới hiện nay là nghiên cứu nhằm tìm phương pháp gia tăng lượng alkaloid ở các cây thảo dược để làm hạ giá thành của thuốc. Cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) là một trong các loại thực vật có khả năng sản xuất các indol alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo thuốc chống ung thư như vinblastine và vincristine. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật và không thể tổng hợp được bằng con đường hóa học, do có cấu trúc phức tạp. Vì vậy, phương pháp bán tổng hợp vinblastine từ sự kết hợp tiền chất vindoline với catharanthine là hết sức hữu hiệu, vì vindoline là một nguồn dồi dào trong cây Trường xuân hoa và catharanthine có thể đạt nồng độ cao trong cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô. Điều này có thể thực hiện được thông qua việc sử dụng các tác nhân kích thích như nấm và chất hóa học. Hiện nay, việc sản xuất catharanthine nhờ nuôi cấy mô vẫn còn quá thấp để tiến tới sản xuất công nghiệp. Bên cạnh đó, các alkaloid chỉ được tổng hợp trong những loại tế bào đặc trưng và vào những giai đoạn phát triển đặc biệt, điều này làm cho việc chiết xuất chúng gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn lọc các phương pháp và thời gian nuôi cấy hiệu quả là một trong những con đường quan trọng và thiết thực để gia tăng sức sản xuất các tiền chất như catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro. 2 Chính vì tầm quan trọng của các indol alkaloid trong việc điều trị bệnh và tính cấp thiết của việc gia tăng các hợp chất thứ cấp có giá trị này nên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro” nhằm kích thích khả năng sản xuất các indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro nhờ chất kích thích sinh trưởng (IAA. NAA). 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định giai đoạn nuôi cấy mô cây Trường xuân hoa sinh tổng hợp nhiều alkaloid nhất, từ đó chọn quy trình nuôi cấy cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất được nhiều catharanthine và vindoline thông qua việc sử dụng chất kích thích sinh trưởng IAA (indole - 3 - acetic acid) hay NAA (1- Naphthalene acetic acid). 1.3. Yêu cầu - Tạo được cây Trường xuân hoa in vitro có hàm lượng alkaloid cao . - Định tính sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa bằng thốc thử Wagner. - Phân tích định lượng được lượng alkaloid trong từng giai đoạn nuôi cấy mô bằng hệ thống điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE). 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây [7, 9] Sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển luôn tiến hành quá trình trao đổi chất, kết quả là tạo nên các sản phẩm của trao đổi chất. Trong thực vật các sản phẩm này được chia làm hai nhóm: - Chất trao đổi bậc một hay hợp chất sơ cấp: là các chất cơ bản cần cho sự sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng, bao gồm các hydrat cacbon, lipit và acid amin. Đó là những thành phần không thể thiếu trong cây. - Chất trao đổi bậc hai hay hợp chất thứ cấp: là những hợp chất đặc trưng cho loài cây trồng và chúng đóng vai trò quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực vật. Các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật [7]. 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp không có chức năng rõ ràng như các hợp chất sơ cấp nhưng thường có vai trò sinh thái học: góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho quá trình thụ phấn của cây, giúp cho cây thích nghi được với những điều kiện khắc nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng, các loại vi sinh vật và những động vật ăn mồi khác, như là cỏ ba lá hay cỏ đinh lăng có tác dụng như estrogen làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của động vật ăn cỏ [17]. Thậm chí là chúng còn ức chế sự phát triển của các thực vật khác bởi vì nhiều hợp chất thứ cấp có độc tính đối với thực vật. Vì vậy so với các chất sơ cấp, hợp chất thứ cấp được xem là nguồn nguyên liệu đặc biệt quý giá từ thực vật [14]. Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị và màu sắc cho các món ăn, đặc biệt hiện nay vấn đề sức khỏe rất được quan tâm do đó ngày càng nhiều các chất có nguồn gốc tự nhiên đang có xu hướng thay thế các chất tổng hợp làm 4 phụ gia trong thực phẩm. Bên cạnh đó các tinh dầu thơm của thực vật còn tham gia vào thành phần quan trọng của nước hoa. Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virút…, vì có nguồn gốc từ tự nhiên nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái. Bởi vì có hoạt tính sinh học dồi dào, nên các hợp chất thứ cấp từ lâu đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền, và ngày nay chúng vẫn là nguồn nguyên liệu có giá trị trong bào chế dược phẩm. Một số chất thứ cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để bào chế thuốc chống ung thư, hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin, quinidin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim… Hiện nay trên thế giới nhiều loại thuốc tổng hợp đã được sử dụng nhưng chúng vẫn không thay thế được các loại thuốc có nguồn gốc từ thực vật. Vì có một số hoạt chất thứ cấp chưa tổng hợp được bằng con đường hóa học hoặc nếu tổng hợp được thì giá thành của các loại thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn mà tác dụng lại không bằng các chất chiết xuất từ cây. Ví dụ như ajmalin, morphin, scopolamin, quinin, strychmin…. [5] 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp Các hợp chất thứ cấp ở thực vật được phân loại theo con đường sinh tổng hợp của chúng. Gồm có ba nhóm chủ yếu: phenolic, terpene và steroid, alkaloid. Phenolic là nhóm hợp chất phổ biến ở thực vật bậc cao vì những phân tử này liên quan đến quá trình tổng hợp lignin, còn các hợp chất khác như alkaloid thì phân bố rải rác, nó đặc trưng cho giống, loài thực vật [17]. 2.2. Alkaloid [27] Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng * Đặc điểm chung: Trên 10.000 loại alkaloid đã được biết, khoảng 10 – 15 % alkaloid ở trong mạch nhựa cây có hoa, loại hai lá mầm nhưng đôi khi cũng được tìm thấy ở nấm, sinh vật biển, ở một số loài động vật và côn trùng… 5 * Thuật ngữ: Alkaloid thường có tên tận cùng bằng “ine”. Chúng được đặt tên theo một phần tên La tinh của loài sinh vật tạo ra nó. Ví dụ atropine từ Atropa belladonna (cây cà dược). Một vài hợp chất được đặt tên dựa trên hoạt tính sinh học của chúng ví dụ như emetine (thuốc gây nôn - emetic). * Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn và độ nóng chảy cao. Tuy nhiên một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng như nicotine hay có màu như berberine. * Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Ở pH thấp alkaloid sẽ thêm vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ. Tính tan của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây, trong phân tích các loại alkaloid, và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng thuốc phù hợp. * Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện tử. Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính acid yếu. Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối. Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng: alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff (potassium bismuth iodide solution). Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền; tuy vậy, một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác nhân oxi hóa [27]. * Phân loại: do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi các alkaloid được chia thành 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (pseudoalkaloid). Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ, thường chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ . hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28 Bảng. 2. 2: Hoa Trường xuân hoa 7 Hình 2. 3: Cây Trường xuân hoa 8 Hình 2. 4: Công thức cấu tạo của catharanthine 10 Hình 2. 5: Công thức cấu tạo của vindoline 10 Hình 2. 6: Công thức cấu tạo của vincristine. catharanthine và vindoline khi ly trích cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 51 Biểu đồ 4. 2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in