Luận văn : KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO part 6 docx

36 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều dài rễ trung bình (mm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 0,00 a 2,22 a 5,22 a 5,63 a 7,59 a 2 0,5 0,00 a 7,59 b 5,77 b 10,07 b 12,44 b P 0,00 0,01 0,00 0,00 CV (%) 11 13,2 14,1 14,2 * Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ trung bình 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 0,00 a 2,22 a 3,00 a 4,74 a 8,33 b 2 0,5 0,00 a 3,19 b 4,22 b 6,11 b 6,04 a P 0,00 0,00 0,00 0,00 CV (%) 19,6 9,2 13,5 11,4 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột và các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự tác động của NAA là rất có ý nghĩa lên chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro. Cây được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo rễ dài hơn so với cây đối chứng và chiều dài rễ tỉ lệ thuận so với thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên sự tác động của NAA lên số rễ của cây có sự khác biệt 37 giữa các giai đoạn nuôi cấy (Bảng 4.3), trên môi trường có bổ sung NAA cây có số rễ cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy. Ở giai đoạn này cây có số rễ và chiều dài rễ dài gấp 1,5 lần so với cây sau 21 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, sau 35 ngày nuôi cấy số rễ của cây trên môi trường có NAA giảm dần. Điều này chứng tỏ khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy cây tạo rễ tốt nhất ở giai đoạn 28 ngày tuổi. Vì các tiền chất alkaloid được sản xuất nhiều ở rễ nên giả thiết đặt ra là hàm lượng alkaloid đạt được cao nhất ở cây 28 ngày tuổi nên thí nghiệm tiếp theo được theo dõi ở giai đoạn này. 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,9 ab 2,93 c 4,19 c 2 0,1 51,8 ab 3,00 c 5,22 d 3 0,5 55,7 b 4,19 e 5,48 de 4 1 55,9 b 3,67 d 5,63 e 5 5 49,5 a 1,93 b 2,44 b 6 10 49,3 a 0,67 a 1,11 a P 0,02 0,00 0,00 CV (%) 17,1 19,8 17,5 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone * Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Trong các nghiệm thức thí nghiệm thì sự bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l tác động tốt lên chiều cao trung bình của cây nhưng khi nồng độ này quá 38 cao (5 – 10 mg/l) sẽ làm giảm khả năng phát triển của cây. Kết quả này cũng phù hợp với sự tác động của NAA lên sự hình thành rễ. Nồng độ tạo rễ tốt nhất trong thí nghiệm này là NAA 0,5 mg/l với số rễ trung bình là 4,19 trong khi ở nghiệm thức 6 (NAA = 10 mg/l) số rễ tạo thành là thấp nhất 0,67 (Bảng 4.4). Bên cạnh đó quan sát thấy ở nồng độ NAA cao (5 mg/l, 10 mg/l) có sự phát sinh mô sẹo ở phần gốc cây (Hình 4.1) bởi vì nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự tạo sẹo (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Như vậy tác động của NAA phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, việc thay đổi nồng độ NAA trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự khác biệt về khả năng tạo rễ ở cây nuôi cấy mô. Ở thí nghiệm này nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ của cây là 0,5 mg/l. 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,8 b 2,93 b 4,19 b 2 0,1 51,5 b 4,30 c 4,81 c 3 0,5 50,4 b 4,04 c 5,67 d 4 1 49,4 ab 5,63 d 5,85 d 5 5 48,7 ab 2,67 ab 4,67 c 6 10 46,3 a 2,59 a 3,78 a P 0,03 0,00 0,00 CV (%) 13,1 16,4 13,5 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone * Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) 39 N2 N3 N1 I2 I3 I1 Sẹo Sẹo Rễ NAA = 0,5 mg/l N3 = 1 mg/l NAA = 0,1 mg/l NAA = 5 mg/l NAA = 10 mg/l IAA = 0,5 mg/l IAA = 1 mg/l IAA = 5 mg/l IAA = 10 mg/l IAA = 0,1 mg/l Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy. 40 Kết quả phân tích thống kê cho thấy các cây nuôi cấy mô trên môi trường có bổ sung IAA đều bị ảnh hưởng nhưng ở mức độ khác nhau. Khi bổ sung IAA ở nồng độ thấp 0 – 0,5 mg/l tác động khác biệt không có ý nghĩa lên chiều cao cây, nhưng khi tăng nồng độ IAA lên (1 - 10 mg/l) thì chiều cao trung bình của cây giảm dần và ở nghiệm thức 6 (IAA = 10 mg/l) cây có chiều cao thấp nhất (Bảng 4.5). Cây đối chứng và cây trên môi trường chứa IAA có sự khác biệt về số rễ và chiều dài rễ trên phương diện thống kê (P< 0,05). Nồng độ IAA 1 mg/l cho thấy cây tạo được nhiều rễ nhất với chiều dài trung bình là 5,85 mm nhưng khi tăng nồng độ IAA sử dụng lên 10 mg/l thì chiều dài rễ là 3,78 mm và số rễ của cây giảm xuống còn 2,59. Ngoài ra ở nghiệm thức 5 và 6 còn có hiện tượng tạo sẹo và rễ bị biến dạng về hình thái (Hình 4.1) bởi vì khi sử dụng IAA liều cao sẽ kích thích cảm ứng sự tạo mô sẹo làm giảm khả năng tạo rễ.  Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy việc sử dụng NAA 0,5 mg/l hoặc IAA 1mg/l đều tác động tốt lên sự sinh trưởng của cây. Tuy nhiên số rễ được tạo thành khi sử dụng IAA vẫn cao hơn so với khi sử dụng NAA (đặc biệt ở nghiệm thức 6, nồng độ 10mg/l). Điều này có thể là do IAA là loại auxin tự nhiên nên khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cao không gây kích ứng như khi sử dụng auxin nhân tạo NAA. 4.4. Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner  Định tính alkaloid từ cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng của cây (7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi) bằng thuốc thử Wagner 41 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner Môi trƣờng Ngày nuôi cấy Phản ứng màu với thuốc thử Wagner MS 7 dung dịch đục mờ, không lắng 14 dung dịch tạo tủa ít 21 dung dịch tạo tủa ít 28 dung dịch tạo tủa nhiều 35 dung dịch đục, tạo tủa vừa MS + NAA 0,5 mg/l 7 dung dịch đục mờ, không lắng 14 dung dịch tạo tủa ít 21 dung dịch tạo tủa ít 28 dung dịch tạo tủa nhiều 35 dung dịch đục, tạo tủa vừa Tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa nuôi cấy in vitro phản ứng với thuốc thử cho lượng kết tủa khác nhau (Hình 4.2, 4.3), điều này có nghĩa là alkaloid hiện diện trong tất cả các mẫu cây nuôi cấy in vitro nhưng với lượng khác nhau. Quan sát sự tạo kết tủa của alkaloid sau khi cho phản ứng với thuốc thử nhận thấy mẫu cây được nuôi trên môi trường có NAA cho kết tủa nhiều hơn so với mẫu cây nuôi trên môi trường MS ở cùng một thời điểm. Việc thay đổi môi trường sống của cây có thể đã tác động đến chu trình hình thành các alkaloid vì alkaloid được sản xuất ở thực vật nhằm giúp cho cây thích nghi với môi trường, dẫn đễn lượng alkaloid cao ở mẫu cây trên môi trường có NAA. Đặc biệt ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy xuất hiện kết tủa nhiều nhất, chứng tỏ hàm lượng alkaloid ở giai đoạn này là cao nhất. Điều này phù hợp với giả thiết đã đặt ra. Ở các giai đoạn còn lại cũng thu được kết tủa nhưng với lượng ít hơn, trong số đó mẫu cây sau 7 ngày nuôi cấy cho kết tủa ít nhất (dung dịch đục và có vòng nhẫn). 42 Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy, cây sản xuất lượng alkaloid cao nhất sau 28 ngày.  Định tính alkaloid trong thân lá cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên). 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên). 43 Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết alkaloid từ mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro 28 ngày tuổi trên các môi trường có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau, để chọn nồng độ phù hợp kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid nhất. Kết quả trình bày ở bảng 4.7. Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy Chất kích thích sinh trƣởng Nồng độ (mg/l) Phản ứng màu với thuốc thử Wagner NAA 0 dung dịch đục, tạo tủa vừa 0,1 dung dịch đục mờ, không lắng 0,5 dung dịch tạo tủa nhiều 1 dung dịch đục, tạo tủa vừa 5 dung dịch tạo tủa ít 10 dung dịch tạo tủa ít IAA 0,1 dung dịch tạo tủa ít 0,5 dung dịch đục mờ, không lắng 1 dung dịch đục, tạo tủa vừa 5 dung dịch đục mờ, không lắng 10 dung dịch tạo tủa ít Khi cho phản ứng với thuốc thử,ở các mẫu trên môi trường có bổ sung NAA cho kết tủa nhiều hơn so với các mẫu trên môi trường chứa IAA. Có nghĩa là lượng alkaloid được tạo ra nhiều trong cây nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA. Điều này có thể giải thích là do IAA là chất kích thích tăng trưởng có nguồn gốc từ thực vật nên việc sử dụng IAA như chất cảm ứng để kích thích khả năng tổng hợp alkaloid không có hiệu quả như khi sử dụng chất có nguồn gốc hóa học như NAA. 44 Trong số các nồng độ NAA sử dụng thì thấy mẫu cây trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l tạo kết tủa nhiều nhất khi phản ứng với thuốc thử. Ở nồng độ 1 mg/l, 5 mg/l và 10 mg/l cho phản ứng tạo tủa vừa, dung dịch đục còn ở 0,1 mg/l thì dung dịch đục và tạo kết tủa rất ít. Như vậy, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l cây sản xuất được nhiều alkaloid nhất (Hình 4.4). Các mẫu cây nuôi trên môi trường chứa IAA khi cho phản ứng với thuốc thử thì thấy dung dịch đục mờ ít lắng, điều này có thể là do lượng alkaloid toàn phần trong cây trên môi trường này được tạo ra ít. Trong các nồng độ thí nghiệm thì khi dùng IAA 1mg/l cho hiện tượng tạo kết tủa rõ ràng nhất, ở các nồng độ còn lại có thể do lượng alkaloid trong mẫu ít nên không quan sát thấy kết tủa, chỉ thấy dung dịch vẫn đục (Hình 4.5). 1 2 3 4 5 6 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau,1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l. 45 . Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một lượng auxin thích hợp (NAA 0,5 mg/l hay IAA 1 mg/l) thì kích thích khả năng tạo alkaloid ở cây Trường xuân hoa. Tuy nhiên, xét về mặt kinh tế, sử dụng NAA 0,5 mg/l có hiệu quả hơn.  Định tính alkaloid trong rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner Tiến hành ly trích alkaloid của rễ cây Trường xuân hoa 28 ngày tuổi trên các môi trường khác nhau trong acid H 2 SO 4 loãng sau đó nhận diện alkaloid bằng thuốc thử Wagner. 1 2 3 4 5 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l. . Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner  Định tính alkaloid từ cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng của cây (7, 14,. rễ ở cây nuôi cấy mô. Ở thí nghiệm này nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ của cây là 0,5 mg/l. 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro. xuân hoa in vitro Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình