Luận văn : KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO part 3 pps

6 amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicine, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithine, lysin, phenilalanine, tryptophan, histidine, acid antranilic…) hơn là theo vòng dị hoàn. Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescaline và N,N - dimetiltryptamine. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn. Các giả - alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid. Bao gồm hai hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (như conesine) và purine (cafeine) [8]. Vài họ thực vật rất giàu alkaloid, ví dụ như họ Apocynaceae Lindl., Juss. Họ này phân bố trên toàn thế giới đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong số đó các terpenoid indol alkaloid nổi lên với vai trò là các chất có hoạt tính sinh học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học. Terpenoid indole alkaloid (TIA) bao gồm hơn 3000 hợp chất trong đó có các chất chống ung thư như vinblastine, vincristine từ loài Catharanthus roseus và Vinca spp., camptothecin từ Camptotheca acuminata, chống sốt rét như quinine từ Cinchona officinalis [15]. Xét về vai trò sinh thái học các terpenoid indole alkaloid đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh. Trường hợp các chất indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa là một ví dụ: năm 1989, Chockalingam và các cộng sự tìm thấy cao chiết Trường xuân hoa có hoạt tính chống lại sự ăn của ấu trùng Spodoptera. Theo Frischknecht (1987) sau khi gây vết thương vừa phải trên cây Trường xuân hoa, thì có sự gia tăng tổng hợp các alkaloid này như một cơ chế phòng vệ. Ngoài ra các alkaloid từ cây Trường xuân hoa còn có khả năng chống lại các loài vi sinh vật, ví dụ như ajmalicine, catharanthine và vindoline được tạo ra để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (Hemandez, 1979) [16]. Hiện nay ngƣời ta đang dựa trên những đặc tính này của thực vật 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa để tìm ra phƣơng thức tăng cƣờng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. TIA gồm có hai thành phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một nhóm terpenoid có nguồn gốc từ iridoid glucoside secologanin [10]. Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid với sự tham gia của các enzym TDC: tryptophan decarboxylase, STR: strictosidine synthase [32]. 2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trƣờng xuân hoa [23, 33] Nguồn gốc phân loại [33] Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Magnoliophyta Ngành phụ : Spermatophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae Tên khoa học : Catharanthus roseus 8 Tên thông thường: Bông dừa, hoa hải đằng, phjắc pót đông (Tày), dừa cạn, trường xuân hoa, Madagascar periwinkle… Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagasca, cây Trường xuân hoa được du nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào đầu khoảng giữa thế kỷ 18, Trường xuân hoa được trồng ở Paris, sau đó có mặt tại nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu. 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trƣờng xuân hoa [23] Cây Trường xuân hoa là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành. Thân mọc thẳng, hình trụ nhẵn, màu xanh lục nhạt hay nâu đỏ. Lá mọc đối, hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 – 3 cm, hai mặt nhẳn, mặt trên sẩm bóng, mặt dưới nhạt (Hình 2.3). Hoa màu hồng hoặc trắng (trắng hiếm hơn). Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn, dài 5 thùy, hình ống ngắn, tràng có 5 cánh, ống tràng hẹp phình ra ở dưới các cánh hoa, nhị 5 đính vào họng của ống tràng (Hình 2.2). Quả dài 2,5 – 3 cm, mọc thẳng hơi choãi ra, hạt nhỏ, hình trứng màu nâu nhạt hoặc nâu đen. Mùa hoa quả, tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10. Ở Việt Nam, Trường xuân hoa là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa 9 tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, Trường xuân hoa có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Trường xuân hoa còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc. Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa. Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Môi trường ven biển cũng là nơi mọc tập trung của Trường xuân hoa ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin, Malaysia, Thái Lan. Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1.500m. Trường xuân hoa là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt (ở Hà Nội - vườn hoa, nông trường Đồng Gia - Ninh Bình, 1972) và ở Tuy Hòa hiện nay. Cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả sau 4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Nguồn Trường xuân hoa mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [23]. 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trƣờng xuân hoa [22] Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, Trường xuân hoa có chứa một số alkaloid có tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana Benth). Ngoài ra còn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin và hoạt chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở lá. Năm 1958, Noble và cộng sự đã chiết được một alkaloid từ lá Trường xuân hoa vincaleucoblastine (còn gọi là Vinblastine) [29]. Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristine) [30]. 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline Hàm lượng các alkaloid này trong Trường xuân hoa rất nhỏ khoảng 1 phần vạn trong lá Trường xuân hoa khô đối với Vinblastine còn đối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa. Tùy theo nơi thu hái hàm lượng các alkaloid này thay đổi từ 0,2% đến 1% và khi dùng cũng dùng với liều rất thấp. Căn cứ vào cấu tạo hóa học người ta chia alkaloid trong cây Trường xuân hoa làm ba nhóm chính: Nhóm alkaloid có nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicine… Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine Nhóm alkaloid có nhân indoline: lochnericine, lochneridin, lochrovine, vindoline, ajmaline … Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005% - 0,015% trong lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá. 11 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine Về mặt tính chất hóa học, các alkaloid có thể tham gia phản ứng cộng, oxi hóa khử… Dưới tác dụng xúc tác của enzyme, một số monomer có thể kết hợp tạo thành các dimer, ví dụ như sự kết hợp của hai tiền chất catharanthine với vindoline tạo thành vinblastine và vincristine như hình 2.7. 12 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất [20] Đơn phản ứng Đa phản ứng 13 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của Trường xuân hoa tùy thuộc nhiều vào các yếu tố liên quan đến quá trình sinh tổng hợp của cây. Sự hình thành alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu vào cây. Quá trình tạo alkaloid trong rễ cây không có phản ứng quang hợp như các bộ phận trên mặt đất của cây nên các alkaloid trong rễ cây là indol alkaloid không chứa nhóm methoxy như ajmalicin, cathidine, serpentine, perivin, alstonin, tertrahydroalstonin, còn các alkaloid ở lá có chứa nhóm methoxy như anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine, leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin, vincedine, còn ở hoa chỉ có có vinblastine dạng vết [4]. Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và cũng rất khác nhau tùy vào các bộ phận thu hái: Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây [5] Các bộ phận của cây Hàm lượng (%) Lá 0,37 - 1,15 Thân 0,46 Rễ chính 0,7 - 2,4 Rễ phụ 0,9 - 3,7 Hoa 0,14 - 0,84 Vỏ quả 1,14 Hạt 0,18 2.3.5. Tính chất dƣợc lý của cây Trƣờng xuân hoa [23, 24, 25] Theo tài liệu cổ, Trường xuân hoa vị hơi đắng, tính hàn, có tác dụng kháng nham (chống ung thư), an thần, trấn tĩnh, bình can, thanh nhiệt, lương huyết, giải 14 độc thường được áp dụng chữa huyết áp cao, bệnh bạch huyết, u lim-phô [25]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ, ít và làm thuốc điều kinh. Ở nam châu Phi, người dân dùng trị bệnh đái tháo đường. Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ [23]. Nói đến Trường xuân hoa trong cây thuốc của Việt Nam như là một cây thuốc rất quý dùng nhiều trong các bệnh về nội khoa mà đặc trưng ở 3 nhóm bệnh: bệnh lý về nội tiết, bệnh lý về tim mạch và bệnh lý về máu. Cao lỏng Trường xuân hoa có tác dụng hạ huyết áp, an thần gây ngủ và có độc tính nhẹ. Khi cho chuột cống trắng cái đã thụ tinh uống cao Trường xuân hoa, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ nhưng có dấu hiệu ngăn cản sự phát triển của thai. Cao Trường xuân hoa dùng để trị bệnh cao huyết áp trên lâm sàng có tác dụng giảm huyết áp trên bệnh nhân thấy rõ rệt. Việc điều trị đơn giản, dễ áp dụng, không thấy biến chứng ngộ độc. Hai loại thuốc chế từ Trường xuân hoa chữa ung thư được dùng là Vinblastine và Vincristine. Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây Trường xuân hoa 2 alkaloid vinblastine và vincristine, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [24]. Vinblastine có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyển hoá của glutamat và aspartat, và vincristine ngăn cản sự tổng hợp RNA và các protein. Ngoài ra cao Trường xuân hoa còn có tác dụng kháng một số chủng nấm gây bệnh [23]. 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trƣờng xuân hoa trong điều trị bệnh  Vinblastin sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp trị bệnh ung thư lá lách, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư 15 biểu mô thận. Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [24].  Vincristin sulfat: Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh ung thư biểu mô phổi, ung thư Hodgkin (ung thư hạch ở hệ bạch huyết), u bạch huyết không - Hodgkin, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân [18]. Phối hợp thuốc chứa Vincristin là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Hiện nay, Trường xuân hoa đang được ta xuất khẩu sang Pháp, chủ yếu để bào chế thuốc chữa bệnh bạch cầu.  Vindoline và catharanthine: vindoline và catharanthine được dùng trong việc điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ lượng đường trong máu. Từ vindoline và catharanthine người ta tổng hợp được những alkaloid chứa nhóm dimer như vinblastine, vincristine có tác dụng trị ung thư.  Ajmalicine: là chất có biệt tính dược học mạnh, dùng để điều trị cao huyết áp, dùng làm thuốc giảm đau và điều trị các bệnh về hệ thần kinh và các triệu chứng lâm sàng khác.  Serpentine: dùng để điều trị bệnh cao huyết áp và thuốc an thần. 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trƣởng [6] Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy: - Chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào - Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi, thân , lá, rễ. - Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và cấu trúc tế bào: auxin cần thiết cho nuôi cấy tế bào như IAA, NAA, 2,4- . 2. 7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất [20] Đơn phản ứng Đa phản ứng 13 2 .3. 4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Sự. thuốc chế từ Trường xuân hoa chữa ung thư được dùng là Vinblastine và Vincristine. Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây Trường xuân hoa 2 alkaloid vinblastine và vincristine, là những. [24]. Vinblastine có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyển hoá của glutamat và aspartat, và vincristine ngăn cản sự tổng hợp RNA và các protein. Ngoài ra cao Trường xuân hoa còn