Luận văn : KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƯỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO part 8 pps

56 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu được có thể đưa ra một số kết luận sau  Sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa Việc bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy chỉ ảnh hưởng lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Nồng độ thích hợp cho sự phát triển rễ của cây là 0,5 mg/l khi sử dụng NAA và 1mg/l đối với IAA.  Định tính alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng bằng thuốc thử Wagner: Có sự hiện diện của alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa. Lượng alkaloid khác nhau tùy theo thời gian nuôi cấy. Giai đoạn cây in vitro tạo nhiều alkaloid nhất là sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Lượng alkaloid được phát hiện nhiều nhất ở mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.  Thử nghiệm ly trích alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa Quy trình ly trích alkaloid từ mẫu khô cho kết quả phân tích trên máy CE tốt hơn so với quy trình ly trích alkaloid từ mẫu tươi, hơn nữa mẫu được bảo quản dễ dàng với phương pháp ly trích bằng vật liệu khô và phương pháp này có thể định danh được alkaloid nếu dựa vào píc alkaloid chuẩn.  Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây in vivo Hàm lượng alkaloid ở mẫu cây ngoài đồng thu được thấp hơn so với mẫu cây nuôi cấy mô, đặc biệt là các tiền chất quan trọng như catharanthine và vindoline. 57 Việc nuôi cấy cây in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng bước đầu thể hiện khả năng tăng sinh tổng hợp alkaloid ở cây Trường xuân hoa.  Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng kĩ thuật điện di mao quản Lượng vindoline cao nhất thu được trong cây Trường xuân hoa ở 7 ngày tuổi và lượng catharanthine cao nhất thu được ở cây 28 ngày tuổi. 5.2. Đề nghị Trường xuân hoa là một giống cây dược liệu có thể sản sinh các các alkaloid quý có tác dụng trị liệu cao. Nên việc tìm hiểu các kĩ thuật nuôi cấy nhanh và tạo ra một lượng lớn cây in vitro có khả năng tích lũy alkaloid cao rất có ý nghĩa do đó tôi xin đề nghị một số hướng nghiên cứu tiếp theo: Cần tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid trong từng bộ phận của cây, từ đó xác định bộ phận sản xuất lượng alkaloid nhiều. Khảo sát khả năng cảm ứng hình thành alkaloid bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các yếu tố sinh học và hóa học có khả năng ảnh hưởng đến sự tăng sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp như chất kích thích sinh trưởng IAA, methyle jasmonat, nấm Trichoderma… 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Vương Văn Ánh, Nguyễn Minh Đức, Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Võ Văn Lẹo, Bùi Mỹ Linh, Ngô Thị Xuân Mai, Phạm Đông Phương, Phạm Thanh Tâm, Hùynh Ngọc Thụy, Võ Thị Bạch Tuyết, 2006. Giáo trình thực tập dược liệu. Bộ môn dược liệu, khoa dược, Đại học Y dược, TP. Hồ Chí Minh, tr50 - 72. 2. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ. Bài giảng chiết xuất dược liệu, trường đại học Y dược, TP. Hồ chí Minh, trang10. 3. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học. 4. Nguyễn Ngọc Hồng, 2004. Bước đầu khảo sát hợp chất trao đổi bậc hai bằng kĩ thuật nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây dừa cạn Catharanthus roeus. Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh, 2002. Bài giảng dược liệu, tập 2. Nhà xuất bản y học Hà Nội. 6. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 7. Trần Thị Lệ Minh, 2006. Giáo trình hoạt chất thứ cấp thực vật. Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm. TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000. Các phương pháp nhận danh trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Học phần cao học chuyên ngành hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, Việt Nam. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 9. Aniszewski Tadeusz, 2007. Alkaloids - Secrets of life. Alkaloid Chemistry, Biological Significance. Applications and Ecological Role, 335 pages 10. Facchini J. Peter, 2001. Alkaloid biosynthesis in plants: Biochemistry, Cell Biology, Molecular Regulation, and Metabolic Engineering Applications. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: p29 – 66. 59 11. Inhou Chu, Bodnar A. Joy, White L. Earl, Bowman N. Robert, 1996. Quantification of vincristine and vinblastine in Catharanthus roseus plants by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A, p281- 288. 12. Jian Zhao, Wei-Hua Zhu, Qiu Hu, 2001. Enhanced cathanthine production in Catharanthus roseus cell culture by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors. Enzyme and Microbial Technology 28: p673 – 681. 13. Jorgenson J.W. and Lukacs K.D, 1981. High resolution separation based on Electrophoresis and Electroosmosis. J Chromatogr 218 : p209 - 216. 14. Klocke A. J., Balandrin F. M., Wurtele E. S., Bollinger W. H., 1985. Natural Plant Chemicals: Sources of Industrial and Medicinal Materials. Science 228: p1154-1160. 15. Kutchan Toni M., 1995. Alkaloid Biosynthesis -The Basis for Metabolic Engineering of Medicinal Plants. The Plant Cell, Vol. 7, p1059 - 1070. 16. Luijendijk J. C. Tues, ed Van Der Meijden, and Rob Verpoorte, 1996. Involvement of strictosidine as a defensive chemical in Catharanthus roeus. Journal of Chemical Ecology, Vol. 22, No. 8: p1356 – 1366. 17. Milesi S., Bourgaud F., Gravot A., Gontier E., 2001. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: p839 – 851. 18. Marmont M. A. and Damasio E. E., 1967. The Effects of Two Alkaloids Derived from Vinca Rosea on the Malignant Cells of Hodgkin’s Disease, Lymphosarcoma and Acute Leukemia in Vivo. The Journal of Hematology 29: p1- 21 19. Tran Thi Le Minh, 2006. Etude de la croissance et la mise en place de la methode de dosage des alcaloides indolique chez le. Laboratoire d’Agronomie et Environnement. Thèse, 20 pages. 20. Tikhomiroff C., Jolicoeur M., 2002. Screening of Catharanthus roseus secondary metabolites by high – performance liquid chromatography. Journal of Chromatography: p87 – 93. 21. Zenk, Eds. Barz, W., Reinhard, E., M.H., 1977. Plant Tissue Culture and Its Bio-technological Application, p. 27. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 60 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 22. http://www.ykhoanet.com/SKDS/YHOCCOTRUYEN/57-33.html 23. http://www.vietroselle.com/content/sp/caythuoc_details_view=12.php 24. http://www.ykhoanet.com/yhoccotruyen/29_261.htm 25. http://www.yhcotruyentw.org.vn/tintuc_chitiet.php?tintuc_id=32&lang= 26. http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e07.htm Masanaru Misawa, Plant tissue culture: an alternative for production of useful metabolite. Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome,1994. 27. www.uic.edu/pharmacy/courses/phar331/PHAR331.00.doc Dr. A. D. Kinghorn, PHAR331 - Fundamentals of Drug Action I- Lectures on Natural Products 28. http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2002/jjones/Content/vincristine.htm Molecular structure of Vinblastine and vincristine 29. http://www.cancerquest.org/index.cfm?page=522# Vinblastine, Cancerquest, Emory University 30. http://netcenter.com.vn/if/I_Detail.aspx?I=11&C=2&P=34253 31. http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn/default.aspx?param=147EaWQ9M jY0NDAmZ3JvdXBpZD0yOSZraW5kPSZrZXl3b3JkPQ==&page=4 32. http://www.abbs.info/fulltxt/eng/34060703.htm Wang Miao * , LI Qiu-Rong,Transient Expression of strictosidine Synthase in Tobaco leaves by Vacumm infiltration. Institute of Applied Ecology, the Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China. 33. http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=CARO14 Classification: Catharanthus roseus (L.) G. Don PHỤ LỤC 1 Thành phần môi trƣờng MS ( Murashige và Skoog, 1962) Agar 7,5 g/l pH môi trƣờng ( trước khi hấp) 5,8 Nguyên tố Nồng độ (mg/l) Nguyên tố đa lƣợng CaCl 2 332,02 KNO 3 1900,00 KH 2 PO 4 170,00 NH 4 NO 3 1650,00 MgSO 4 .7H 2 O 180,54 Nguyên tố vi lƣợng CoCl 2 .6H 2 O 0,025 CuSO 4 .5H 2 O 0,025 H 3 BO 3 6,20 KI 0,83 MnSO 4 .H 2 O 16,90 Na 2 MoO 4 .H 2 O 0,25 ZnSO 4 .H 2 O 8,60 Vitamine & aminoacid Glycine 2,00 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10 FeNaEDTA 36,70 PHỤ LỤC 2 1.Kết quả thống kê chiều cao cây Trƣờng xuân hoa in vitro 7 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 16.66667 1 16.666667 .893 .3590 Within groups 970.14815 52 18.656695 Total (corrected) 986.81481 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for 7NGAY.DAITHAN by 7NGAY.NT Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 1 27 27.407407 .8256212 .8312573 26.227656 28.587159 2 27 26.296296 .8368555 .8312573 25.116545 27.476048 Total 54 26.851852 .5877877 .5877877 26.017642 27.686062 Multiple range analysis for 7NGAY.DAITHAN by 7NGAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 2 27 26.296296 X 1 27 27.407407 X contrast difference limits 1 - 2 1.11111 2.35950 * denotes a statistically significant difference. 14 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 121.5000 1 121.50000 2.875 .0960 Within groups 2197.9259 52 42.26781 Total (corrected) 2319.4259 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC14NGAY.DAITHAN by DC14NGAY.NT Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 1 27 40.037037 1.1391523 1.2511892 38.261303 41.812771 2 27 37.037037 1.3539869 1.2511892 35.261303 38.812771 Total 54 38.537037 .8847243 .8847243 37.281403 39.792671 Multiple range analysis for DC14NGAY.DAITHAN by DC14NGAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 2 27 37.037037 X 1 27 40.037037 X contrast difference limits 1 - 2 3.00000 3.55147 * denotes a statistically significant difference. 21 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 3.6296 1 3.629630 .128 .7257 Within groups 1474.0741 52 28.347578 Total (corrected) 1477.7037 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC21DAY.DAITHAN by DC21DAY.NT Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 1 27 45.185185 .9168213 1.0246513 43.730962 46.639409 2 27 44.666667 1.1221672 1.0246513 43.212443 46.120890 Total 54 44.925926 .7245379 .7245379 43.897635 45.954217 Multiple range analysis for DC21DAY.DAITHAN by DC21DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 2 27 44.666667 X 1 27 45.185185 X contrast difference limits 1 - 2 0.51852 2.90845 * denotes a statistically significant difference. 28 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups .0185 1 .018519 .000 .9841 Within groups 2332.0741 52 44.847578 Total (corrected) 2332.0926 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC28DAY.DAITHAN by DC28DAY.NT Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 1 27 47.111111 1.3891453 1.2888062 45.281989 48.940233 2 27 47.148148 1.1799654 1.2888062 45.319026 48.977270 Total 54 47.129630 .9113236 .9113236 45.836245 48.423014 Multiple range analysis for DC28DAY.DAITHAN by DC28DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 1 27 47.111111 X 2 27 47.148148 X contrast difference limits 1 - 2 -0.03704 3.65824 * denotes a statistically significant difference. 35 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 29.6296 1 29.629630 .725 .4075 Within groups 2125.4074 52 40.873219 Total (corrected) 2155.0370 53 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for DC35DAY.DAITHAN by DC35DAY.NT Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 1 27 49.666667 1.3888034 1.2303751 47.920472 51.412861 2 27 51.148148 1.0482705 1.2303751 49.401954 52.894342 Total 54 50.407407 .8700066 .8700066 49.172662 51.642153 Multiple range analysis for DC35DAY.DAITHAN by DC35DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 1 27 49.666667 X 2 27 51.148148 X contrast difference limits 1 - 2 -1.48148 3.49239 * denotes a statistically significant difference. 2. Kết quả thống kê số rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro 14 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 12.518519 1 12.518519 44.161 .0000 Within groups 14.740741 52 .283476 Total (corrected) 27.259259 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR14DAY.SORE by SR14DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 1 27 2.2222222 X 2 27 3.1851852 X contrast difference limits 1 - 2 -0.96296 0.29084 * * denotes a statistically significant difference. 21 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 20.166667 1 20.166667 16.734 .0001 Within groups 62.666667 52 1.205128 Total (corrected) 82.833333 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR21DAY.SORE by SR21DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 1 27 3.0000000 X 2 27 4.2222222 X contrast difference limits 1 - 2 -1.22222 0.59968 * * denotes a statistically significant difference 28 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 25.351852 1 25.351852 47.332 .0000 Within groups 27.851852 52 .535613 Total (corrected) 53.203704 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR28DAY.SORE by SR28DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 1 27 4.7407407 X 2 27 6.1111111 X contrast difference limits 1 - 2 -1.37037 0.39979 * denotes a statistically significant difference 35 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 71.185185 1 71.185185 105.873 .0000 Within groups 34.962963 52 .672365 Total (corrected) 106.14815 53 0 missing value(s) have been excluded. Multiple range analysis for SR35DAY.sore by SR35DAY.NT Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 2 27 6.0370370 X 1 27 8.3333333 X contrast difference limits 1 - 2 2.29630 0.44793 * * denotes a statistically significant difference. 3. Kết quả thống kê chiều dài rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro 14 ngày Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 389.35185 1 389.35185 1333.293 .0000 Within groups 15.18519 52 .29202 Total (corrected) 404.53704 53 0 missing value(s) have been excluded. . catharanthine và vindoline. 57 Việc nuôi cấy cây in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng bước đầu thể hiện khả năng tăng sinh tổng hợp alkaloid ở cây Trường xuân hoa. . (internal) (pooled s) intervals for mean 1 27 27.407407 .82 56212 .83 12573 26.227656 28. 587 159 2 27 26.296296 .83 685 55 .83 12573 25.116545 27.4760 48 Total 54 26 .85 185 2 . 587 787 7 . 587 787 7. alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng bằng thuốc thử Wagner: Có sự hiện diện của alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa. Lượng alkaloid khác nhau