CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ pps

Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như hấp phụ, phân bố khối lượng hay phân chia, trao đổi ion, hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính chất lý hoá của các phân tử như kí

CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ

Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động Pha tĩnh có thể là một chất rắn, cũng có thể là một chất lỏng được giữ trên một chất rắn hay một gel Pha tĩnh có thể được nhồi vào một cột, hoặc trải thành một lớp, hay phân tán thành một lớp phim v.v Pha động có thể là chất khí, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (còn được gọi là chất lỏng siêu tới hạn) Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như hấp phụ, phân bố khối lượng (hay phân chia), trao đổi ion, hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính chất lý hoá của các phân tử như kích thước, khối lượng, thể tích, v.v…

Phụ lục này chỉ đề cập tới các định nghĩa và phép tính các thông số thông thường trong các kỹ thuật sắc ký, các yêu cầu thường được áp dụng cho tính phù hợp của hệ thống sắc ký Nguyên lý, thiết bị và phương pháp tách được trình bày trong các phương pháp thử chung:

- Phương pháp sắc ký giấy (Phụ lục 5.1)

- Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2)

- Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3)

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

- Phương pháp sắc ký rây phân tử (Phụ lục 5.5)

Định nghĩa:

Các định nghĩa sau đây được dùng trong các chuyên luận để tính toán các thông số

Một số thiết bị có phần mềm của nhà sản xuất dùng để tính toán một vài thông số như tỷ

số tín hiệu trên nhiễu Trong trường hợp này, người sử dụng có trách nhiệm đảm bảo rằng các phương pháp dùng trong phần mềm đó phù hợp với yêu cầu của dược điển này; nếu không, phải điều chỉnh cho phù hợp

Sắc đồ

Sắc đồ là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thay đổi của đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách Một sắc đồ lý tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền

Các thông số chỉ sự lưu giữ

Thời gian lưu và thể tích lưu

Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời gian lưu

tR Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic Từ thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu VR dựa trên công thức:

 (tốc độ dòng) là lưu lượng của dòng pha động

Hệ số phân bố khối lượng

Hệ số phân bố Dm còn được gọi là thừa số dung lượng k’ hay thừa số lưu giữ k được định nghĩa và tính theo công thức sau:

M

S C M

S m

V

VKQ

Q'k

Trong đó:

QS và QM lần lượt là lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động,

VS và VM lần lượt là thể tích pha tĩnh và pha động,

KC là hệ số phân bố cân bằng, còn gọi là hằng số phân bố

Hệ số phân bố khối lượng của một chất có thể xác định từ sắc đồ theo công thức:

M

M R m

t

tt'k

Trong sắc ký trên gel, đặc tính rửa giải của một chất có thể biểu thị dưới dạng hệ

số phân bố Ko và được tính theo công thức:

o t

o R o

tt

ttK

t (thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến

đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất có thể tiếp cận đầy đủ các lỗ xốp của pha tĩnh

Thừa số chậm

Thừa số chậm RF (còn được gọi là hệ số di chuyển Rf), được dùng trong sắc ký trên mặt phẳng (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) đó là tỷ số giữa khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký và khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi

b là quãng đường di chuyển của chất tan,

a là quãng đường di chuyển của tuyến dung môi

Các thông số vế sắc ký

Pic sắc ký

Pic của một chất có thể được xác định bởi diện tích pic (A), hay chiều cao pic (h), và chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (wh) hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic ở điểm uốn (wi) Với các pic dạng Gauss (hình 5.8.1) ta có hệ thức:

wh = 1,18 wi

d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở 1/20 chiều cao của pic

Khi As = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng)

Hình 5.8.2

Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến

Tuỳ theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính được theo công thức dưới đây:

1 R 2 R S

ww

tt18,1R

t và tR2 là thời gian lưu, hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến

đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh nhau,

1

w và w 2là chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng

Độ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền Công thức cho ở trên có thể không đúng khi các pic không được tách trên đường nền

Trong sắc ký trên mặt phẳng, thay cho thời gian lưu, người ta sử dụng quãng đường dịch chuyển và độ phân giải được tính theo công thức

 

2 1

1 F 2 F S

ww

RRa18,1R

w và w 2 = chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng

a = quãng đường dịch chuyển của dung môi

Công thức này chỉ áp dụng cho trường hợp sắc đồ các vết sắc ký trên mặt phẳng đã được quét và chuyển sang dạng các pic sắc ký

Tỷ số đỉnh-hõm

Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số của tính phù hợp của

hệ thống trong phép thử các tạp chất liên quan khi hai pic không được tách đến đến đường nền (xem hình 5.8.3)

trong đó:

Hp = chiều cao của đỉnh pic nhỏ so với đường nền ngoại suy

Hv = chiều cao của đáy hõm tách hai pic lớn và nhỏ

Hình 5.8.3

Độ lưu giữ tỷ đối

Độ lưu giữ tỷ đối (r), còn gọi là thừa số chọn lọc (α), có thể ước lượng theo công thức sau:

t

t 

Trong đó:

tR2 là thời gian lưu của pic chất được quan tâm

tR1 là thời gian lưu của chất đối chiếu (thường là pic của chất cần thử)

Độ chụm của kết quả định lượng

Tỷ số tín hiệu trên nhiễu

Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) ảnh hưởng đến độ chụm (precision) của kết quả định lượng và có thể tính theo công thức:

h = khoảng dao động của nhiễu đường nền trên sắc đồ thu được sau khi tiêm một mẫu trắng, khoảng dao động này được xác định trên một quãng đường bằng 20 lần chiều rộng của pic ở nửa chiều cao của pic trên sắc đồ thu được khi tiêm dung dịch chất đối chiếu đã định và nếu có thể thì khoảng đường này phân bố đều hai bên vị trí của pic của chất nghiên cứu

Độ lặp lại

Độ lặp lại của đáp ứng được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn tương đối % (RSD%) của của một dãy liên tiếp các kết quả phép tiêm và đo rồi tính theo công thức:

1n

yyy

100

%

RSD

2 i

%, 90 max

t

nKBRSD





Trong đó:

K là hằng số (0,349), tính được từ biểu thức

6

t2

6,0

K  90%,n1 trong đó

2

6,0

là

RSD yêu cầu cho B = 1,0, sau 6 lần tiêm

B là giới hạn trên trong xác định của chuyên luận riêng trừ đi 100 phần trăm,

n là số dung dịch đối chiếu (3 ≤ n ≤ 6)

Các phép thử tính phù hợp của hệ thống là phần không thể thiếu của một phương pháp

và được dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp Hiệu lực biểu kiến, tỷ

số phân bố khối lượng, độ lưu giữ tỷ đối và hệ số đối xứng là những thông số thường được dùng để đánh giá hiệu năng của cột Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến đặc tính sắc

ký bao gồm thành phần pha động, sức ion, nhiệt độ và pH biểu kiến của pha động, lưu lượng, chiều dài cột, nhiệt độ và áp suất, và các đặc tính của pha tĩnh, mức biến đổi hoá học như độ xốp (cỡ lỗ), cỡ hạt, kiểu các hạt, diện tích bề mặt riêng, và trong trường hợp pha đảo là mức độ biến đổi hoá học (được biểu diễn dưới dạng mức độ khoá đầu (end-capping) hay tải lượng carbon, v.v )

Các bộ phận cấu thành của máy phải có khả năng đáp ứng yêu cầu về độ chụm khi tiến hành phép thử hay định lượng

Nếu không có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận thì hệ thống phải đạt các yêu cầu sau đây:

- Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 -1,5, trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận Yêu cầu này được áp dụng rộng rãi cho các phép thử và định lượng trong các chuyên luận

- Độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm lặp lại của dung dịch đối chiếu không được vượt quá các trị giá cho trong bảng 5.8.1 Yêu cầu này chỉ áp dụng cho các phép định lượng và không áp dụng cho phép thử tạp chất liên quan Giới hạn phát hiện pic (ứng với tỷ số tín hiệu trên nhiễu là 3) là nhỏ hơn giới hạn có thể bỏ qua của các tạp chất liên quan Giới hạn định lượng của pic (ứng với tỷ số tín hiệu trên nhiễu là 10) thì nhỏ hơn hoặc bằng giới hạn có thể bỏ qua của các tạp chất liên quan

Bảng 5.8.1 Yêu cầu về độ lặp lại

Số lần tiêm

B (%) Độ lệch chuẩn tối đa được phép

cho các lần tiêm lặp là 2,0% Yêu cầu này chỉ áp dụng cho các phép định lượng

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký

Để thoả mãn các tiêu chí trong yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống, mà không làm thay đổi cơ bản phương pháp, có thể điều chỉnh các thông số sắc ký trong phạm vi nêu trong bảng cho dưới đây để tham khảo Các điều kiện sắc ký đã được thẩm định trong quá trình xây dựng chuyên luận Các phép thử tính phù hợp của hệ thống được đưa vào

để đảm bảo yêu cầu về tách cho phép thử hay phép định lượng đạt chất lượng mong muốn Tuy nhiên, vì pha tĩnh chỉ được mô tả một cách chung chung, và trên thị trường lại có nhiều loại pha tĩnh có những đặc tính sắc ký khác nhau, nên có thể cần điều chỉnh một số điều kiện sắc ký để đạt các yêu cầu của tính phù hợp của hệ thống Đặc biệt trong phương pháp sắc ký pha đảo, việc thay đổi các thông số sắc ký không phải lúc nào

cũng cho kết quả tách thoả đáng Trong trường hợp này, có thể phải thay cột khác cùng loại, ví dụ một cột silicagel gắn C18 khác mà có thể cho kết quả mong muốn

Với các thông số quan trọng, việc điều chỉnh được xác định rõ ràng trong chuyên luận

để đảm bảo tính phù hợp của hệ thống

Nên tránh điều chỉnh nhiều thứ một lúc vì có thể gây tác động tích luỹ trên hiệu năng của hệ thống

Sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy

Thành phần pha động: lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh 30% nồng

độ tương đối hay  % nồng độ tuyệt đối tuỳ theo cái nào lớn hơn Ví dụ với dung môi 2thành phần nhỏ cỡ 10% của pha động thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là nồng độ trong khoảng 7-13% trong khi thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa là nồng độ trong khoảng 8-12%; như vậy khoảng theo nồng độ tương đối lớn hơn; nếu thành phần dung môi nhỏ

là 5% thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là trong khoảng 3,5-6,5% và thay đổi 2% nồng

độ tuyệt đối nghĩa là trong khoảng 3-7%, trong trường hợp này khoảng theo nồng độ tuyệt đối lớn hơn Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối

pH của thành phần nước trong pha động: chỉ điều chỉnh thay đổi  0,2 đơn vị pH trừ

khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận, hay thay đổi  1 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất trung tính

Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: được thay đổi  10%

Thể tích mẫu chấm sắc ký điều chỉnh trong khoảng 10-20% của thể tích quy định nếu

sử dụng bản mỏng cỡ hạt nhỏ (2-10 µm)

Khoảng dịch chuyển của tuyến dung môi không được dưới 50mm và với bản mỏng

hiệu năng cao thì không được dưới 30 mm

Sắc ký lỏng

Thành phần pha động lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh 30% nồng

độ tương đối hay  % nồng độ tuyệt đối tuỳ theo trị số nào lớn hơn (Xem ví dụ ở 2trên) Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối

Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: Được thay đổi  10%

Bước sóng detector không được điều chỉnh

Pha tĩnh:

Chiều dài cột:  70%

Đường kính trong của cột:  25%

Cỡ hạt: Giảm tối đa 50% và không được phép tăng

Lưu lượng pha động:  50% Khi trong chuyên luận cho thời gian lưu của pic chính, thì

được giảm lưu lượng dung môi nếu trong chuyên luận sử dụng số đĩa lý thuyết biểu kiến trong phần đánh giá chất lượng

Nhiệt độ  10%, tối đa là 60oC

Thể tích tiêm có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định

là thoả đáng

Rửa giải gradient Cấu hình của thiết bị dùng có thể thay đổi đáng kể độ phân giải, thời

gian lưu và thời gian lưu tỷ đối đã nêu trong phương pháp Nếu điều này xảy ra thì có thể do thể tích dung môi cư trú (dwell volume) quá lớn Thể tích dung môi cư trú là thể tích giữa điểm hai dung môi rửa giải gặp nhau và điểm đầu cột

Sắc ký khí

Pha tĩnh:

Chiều dài cột:  70%

Đường kính trong của cột:  25%

Cỡ hạt: giảm tối đa 50% và không được phép tăng

Bề dày lớp phim: giảm 50% đến tăng 100%

Lưu lượng pha động:  50%

Nhiệt độ  10%

Thể tích tiêm có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định

là thoả đáng

Định lượng

Đáp ứng detector: Độ nhạy của detector là tín hiệu đầu ra khi một đơn vị nồng độ hay

một đơn vị khối lượng trong pha động đi vào detector Hệ số đáp ứng tương đối của

detector, thường được gọi là hệ số đáp ứng, biểu thị độ nhạy của một detector đối với một chất chuẩn Hệ số hiệu chỉnh là nghịch đảo của hệ số đáp ứng

Phương pháp chuẩn ngoại Nồng độ các thành phần cần phân tích được xác định bằng

cách so sánh (các) đáp ứng pic của dung dịch thử với đáp ứng pic của chất đối chiếu

Phương pháp chuẩn nội Chất chuẩn nội phải là một chất có thể tách khỏi chất khảo sát

Thêm cùng lượng chuẩn nội vào dung dịch thử và dung dịch chất đối chiếu Chất chuẩn nội không được có phản ứng với khảo sát, phải bền và không chứa tạp có thời gian lưu tương tự thời gian lưu chất khảo sát Nồng độ chất khảo sát được xác định dựa vào việc

so sánh tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chuẩn nội trong dung dịch thử với tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chuẩn nội trong dung dịch chất đối chiếu

Quy trình chuẩn hoá, còn gọi là phương pháp chuẩn hoá Hàm lượng phần trăm của

một hay nhiều thành phần trong chất thử được tính bằng cách xác định diện tích một pic hay nhiều pic dưới dạng % của tổng diện tích tất cả các pic trừ các pic của dung môi hay

Quy trình hiệu chuẩn, còn gọi là phương pháp đường chuẩn Xác định mối quan hệ

giữa tín hiệu đo được hay đánh giá được (y) và lượng (nồng độ, khối lượng, vv.) của chất (x) rồi tính hàm hiệu chuẩn (phương trình đường chuẩn) Tính kết quả phân tích từ tín hiệu của chất phân tích (được đo hay được đánh giá) theo phương pháp hàm số ngược

Trong các chuyên luận thường cho các phương pháp định lượng khác nhau như phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, quy trình chuẩn hoá (phương pháp đường chuẩn) nhưng ít khi dùng quy trình chuẩn hoá (phương pháp chuẩn hoá) Trong các phép thử tạp chất liên quan, người ta dùng hoặc phương pháp chuẩn ngoại với một dung dịch đối chiếu, hoặc dùng quy trình chuẩn hoá Tuy vậy trong cả hai phương pháp chuẩn ngoại và chuẩn hoá, nếu phải pha loãng một dung dịch chất thử để so sánh thì hệ

số đáp ứng của các tạp chất liên quan phải xấp xỉ đáp ứng của bản thân chất phân tích (hệ số đáp ứng 0,8-1,2), nếu không thì phải dùng hệ số hiệu chỉnh

Khi trong chuyên luận có quy định phép thử các tạp chất liên quan là tổng các tạp chất hay khi phải định lượng một tạp chất thì điều quan trọng là phải chọn một ngưỡng thích hợp và các điều kiện thích hợp cho việc lấy tích phân các diện tích pic Trong các phép

thử như vậy thì ngưỡng bỏ qua (nghĩa là các diện tích pic dưới ngưỡng này không được

tính đến) thường là 0,05% Như thế, ngưỡng đặt cho hệ thống thu thập dữ liệu ít nhất phải là nửa ngưỡng bỏ qua Việc lấy tích phân các diện tích pic của các tạp không được tách hoàn toàn khỏi pic chính nên được thực hiện theo phương pháp ngoại suy từ hõm tới hõm (vạch tiếp tuyến) Các pic của dung môi hoà tan mẫu cũng được bỏ qua