Kỹ thuật tách sắc ký

1 5.8. CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ Các k ỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân bố vào hai pha: m ột pha tĩnh v à một pha động. Pha tĩnh có thể là một chất rắn, cũng có thể là một chất lỏng đư ợc giữ tr ên một chất r ắn hay một gel. Pha tĩnh có thể đ ư ợc nhồi vào một cột, hoặc trải thành một lớp, hay phân tán thành m ột lớp phim v.v Pha động có thể là chất khí, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (còn được gọi là chất lỏng siêu tới hạn). Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như hấp ph ụ, phân bố khối lượng (hay phân chia), trao đổi ion, hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính chất lý hoá c ủa các phân tử nh ư kích thước, khối lượng, thể tích, v.v… Ph ụ lục n ày ch ỉ đề cập tới các định nghĩa v à phép tính các th ông s ố thông th ường trong các k ỹ thuật s ắc ký, các yêu c ầu thường được áp dụng cho tính phù hợp của hệ thống sắc ký. Nguyên lý, thiết bị và phương pháp tách đư ợc trình bày trong các phương pháp thử chung: - Phương pháp s ắc ký giấy (Phụ lục 5.1) - Phương pháp s ắc ký khí (Phụ lục 5.2) - Phương pháp s ắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) - Phương pháp s ắc ký lớp mỏng ( Ph ụ lục 5 .4) - Phương pháp s ắc ký rây phân t ử (Ph ụ lục 5 .5) Đ ịnh nghĩa : Các đ ịnh nghĩa sau đây đ ược dùng trong các chuyên luận để tính toán các thông s ố. M ột s ố thiết bị có phần mềm của nhà sản xuất dùng để tính toán một vài thông số như tỷ số tín hiệu trên nhi ễu. Trong trường hợp này, người sử dụng có trách nhiệm đảm bảo rằng các phương pháp dùng trong ph ần mềm đó phù hợp với yêu c ầu của dược điển này; nếu không, phải điều chỉnh cho phù hợp. S ắc đồ Sắc đồ là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thay đổi của đáp ứng của detector (hay nồng đ ộ của chất hay một đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ của chất) theo thời gi an, th ể tích hay kho ảng cách. Một sắc đồ lý tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền. Các thông s ố chỉ sự l ưu giữ Th ời gian l ưu và thể tích lưu Trong s ắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời gian lưu t R. Th ời gian lưu đư ợc xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic. Từ thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu V R d ựa trên công thức: RR tV  Trong đó: R t (th ời gian lưu ) là kho ảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đ ến đư ờng thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic c ủa chất ,  (t ốc độ dòng) là lưu lư ợng của dòng pha động. H ệ số phân bố khối l ượng H ệ số phân bố D m còn đư ợc gọi là thừa số dung lượ ng k’ hay th ừa số l ưu giữ k được định nghĩa và tính theo công thức sau: M S C M S m V V K Q Q 'kD  Trong đó: Q S và Q M lần l ư ợt là lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động , V S và V M lần lượt là thể tích pha tĩnh và pha động , K C là h ệ số phân bố cân bằng, còn gọi là hằng số phân bố. H ệ số phân bố khối lượng của một chất có thể xác định từ sắc đồ theo công thức: 2 M MR m t tt 'kD   Trong đó: t R (th ời gian l ưu hay th ể tích l ưu), là khoảng c ách trên đư ờng nền từ điểm ti êm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất . M t (th ời gian chết hay thể tích rỗng), là kho ảng cách tr ên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đư ờng thẳng đ ứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ. H ệ số phân bố Trong s ắc ký tr ên gel, đặc tính rửa giải của một chất có thể biểu thị dưới dạng hệ số phân bố K o và đư ợc tính theo công thức: ot oR o tt tt K    trong đó: t R (th ời gian lưu hay thể tích lưu), là kho ảng cách tr ên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đ ứng kẻ từ đỉnh pic của chất. o t (th ời gian chết hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đ ứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu gi ữ. t t (th ời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường n ền từ điểm ti êm mẫu đến đư ờng th ẳng đ ứng kẻ từ đỉnh pic của chất có thể tiếp cận đầy đủ các lỗ xốp của pha tĩnh. Th ừa số chậm Th ừa số chậm R F (còn được gọi là h ệ s ố di chuyển R f ), đư ợc dùng trong sắc ký trên mặt phẳng (s ắc ký l ớp mỏng , s ắc ký giấy) đó là t ỷ số giữa khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký và kho ảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi. a b R F  Trong đó: b là quãng đường di chuyển của chất tan, a là quãng đư ờng di chuyển của tuyến dung môi. Các thông s ố vế sắc ký Pic s ắc ký Pic c ủa một chất có thể được xác định bởi diện tích pic (A), hay chiều cao pic (h), và chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (w h ) ho ặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic ở điểm uốn (w i ). V ới các pic dạng Gauss (hình 5.8.1) ta có h ệ thức: w h = 1,18 w i 3 Hình 5.8.1 Hệ số đối xứng H ệ số đối xứng (A s ) (hay h ệ số kéo đuôi) c ủa một pic Hình 5.8.2 đư ợc tính theo công thức: d2 w A 05,0 S  Trong đó: w 0,05 là chi ều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic, d là kho ảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đế n c ạnh phía tr ư ớc của pic ở 1/20 chi ều cao của pic. Khi A s = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng) Hình 5.8.2 Hi ệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến 4 Tu ỳ theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đ ẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết bi ểu kiến (N), có thể tính đ ược theo công thức dưới đây: 2 h R w t 54,5N          trong đó: R t là th ời gian lưu hay th ể tích lưu hay kho ảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc k ẻ qua đỉnh pic tương ứng với chất, h w là chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic tính theo cùng đơn vị đo R t (thời gian, thể tích hay kho ảng cách). S ố đĩa lý thuyết biểu kiến thay đổi theo chất, theo cột cũng nh ư theo thời gian lưu. Các thông s ố v ề sự tách s ắc ký Đ ộ phân giải Đ ộ phân giải (R S ) gi ữa hai pic của hai chất được tính theo công thức:   2h1h 1R2R S ww tt18,1 R    Trong đó: 1R t và 2R t là th ời gian l ưu, hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua hai đ ỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh nhau, 1h w và 2h w là chi ều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng. Đ ộ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền. Công thức cho ở trên có thể không đúng khi các pic không đư ợc tách tr ên đường nền. Trong s ắc ký tr ên m ặt phẳng, thay cho thời gian lưu, người ta sử dụng quãng đường dịch chuy ển và độ phân giải được tính theo công thức   2h1h 1F2F S ww RRa18,1 R    Trong đó: 1F R và 2F R là = các th ừa số chậm (hay hệ số l ưu giữ) của hai chất, 1h w và 2h w = chi ều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic t ương ứng. a = quãng đường dịch chuyển của dung môi Công thức này chỉ áp dụng cho trường hợp sắc đồ các vết sắc ký trên mặt phẳng đã được quét và chuyển sang d ạng các pic sắc ký. T ỷ số đỉnh -hõm Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số của tính phù hợp của hệ thống trong phép th ử các tạp chất liên quan khi hai pic không đư ợc tách đến đến đường nền (xem hình 5.8.3). v p H H v/p  trong đó: H p = chi ều cao của đỉnh pic nhỏ so với đường nền ngoại suy H v = chi ều cao của đáy hõm tách hai pic lớn và nhỏ. 5 Hình 5.8.3 Độ lưu giữ tỷ đối Đ ộ lưu giữ tỷ đối (r), còn g ọi là thừa số chọn lọc (α), có th ể ước lượng theo công thức sau: M1R M2R tt tt r    Trong đó: t R2 là th ời gian lưu của pic chất được quan tâm t R1 là th ời gian lưu c ủa chất đối chiếu (thường là pic của chất cần th ử ) M t = thời gian chết (hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường th ẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ. Đ ộ l ưu giữ tỷ đối c hưa hi ệu chính (r G ) đư ợc tính theo công thức: 1R 2R G t t r  Tr ừ khi có hướng dẫn khác, các trị giá độ lưu giữ tỷ đối cho trong các chuyên luận là độ lưu giữ tỷ đối chưa hi ệu chính. Trong s ắc ký tr ên mặt phẳng, các th ừa số chậm ( h ệ số di chuyển ) R f2 và R f1 đư ợc d ùng thay cho các thời gian lưu t R2 và t R1 . Đ ộ chụm của kết quả định lượng T ỷ số tín hiệu trên nhiễu T ỷ số tín hiệu tr ên nhiễu (S/N) ảnh hưởng đến độ chụm (precision) của kết quả định lượng và có th ể tính theo công thức: h H2 N/S  trong đó: 6 H = chi ều cao của pic (Hình 5.8.4) ứng với chất khảo sát trên sắc đồ thu được với dung dịch chất đối chi ếu đã định, chiều cao này được đo từ đỉnh pic đến đường nền ngoại suy trên một khoảng bằng 20 lần chi ều rộng của pic ở nửa chiều cao c ủa pic, h = kho ảng dao động của nhiễu đ ường nền trên sắc đồ thu được sau khi tiêm một mẫu trắng, khoảng dao đ ộng này được xác định trên một quãng đường bằng 20 lần chiều rộng của pic ở nửa chiều cao của pic trên sắc đồ thu được khi tiêm dung dịch chất đố i chiếu đã định và nếu có thể thì khoảng đường này phân b ố đều hai bên vị trí của pic của chất nghiên cứu. Hình 5.8.4 Đ ộ lặp lại Đ ộ lặp lại của đáp ứng được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn tương đối % (RSD%) của của một dãy liên ti ế p các k ết quả phép ti êm và đo rồi tính theo công thức: 1n yy y 100 %RSD 2 i             Trong đó: y i là các giá tr ị cá thể dưới dạng diện tích pic hay chiều cao pic hay tỷ số các diện tích trong phương pháp chu ẩn hoá,  y là trung bình c ủa các giá tr ị cá thể, n là s ố các giá trị cá thể. V ới một dãy lần tiêm dung dịch đ ối chiếu , cho nh ững giới hạn xác định, giá trị cực đại của độ lệch chuẩn tương đối (RSD max ) có thể tính được theo công thức sau: 1n%,90 max t nKB RSD   Trong đó: K là h ằng số (0,349), tính được từ biểu thức 6 t 2 6,0 K 1n%,90   trong đó 2 6,0 là RSD yêu c ầu cho B = 1,0, sau 6 l ần tiêm. B là gi ới hạn trên trong xác định của chuyên luận riêng trừ đi 100 ph ần trăm, 7 n là s ố dung dịch đối chiếu (3 ≤ n ≤ 6) 1n%,90 t  là t trong b ảng Student với mức xác su ất 90 % (hai chi ều) và n -1 b ậc tự do. Tính phù h ợp của hệ thống Các phép thử tính phù hợp của hệ thống là phần không thể thiếu của một phương pháp và được dùng để đ ảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp. Hiệu lực biểu kiến, tỷ số phân bố khối lượng, độ lưu giữ t ỷ đối và hệ số đối xứng là những thông số thường được dùng để đánh giá hiệu năng của cột. Các yếu tố có th ể ảnh hưởng đến đặc tín h s ắc ký bao gồm thành phần pha động, sức ion, nhiệt độ và pH biểu kiến c ủa pha động, l ưu lượng, chiều dài cột, nhiệt độ và áp suất, và các đặc tính của pha tĩnh, mức biến đổi hoá h ọc như độ xốp (cỡ lỗ), cỡ hạt, kiểu các hạt, diện tích bề mặt riêng, và tro ng trư ờng hợp pha đảo là mức độ biến đổi hoá học (được biểu diễn dưới dạng mức độ khoá đầu (end -capping) hay tải lượng carbon, v.v ) Các b ộ phận cấu th ành của máy phải có khả năng đáp ứng yêu cầu về đ ộ chụm khi ti ến h ành phép thử hay đ ịnh l ượng. N ếu không có ch ỉ dẫn gì khác trong chuyên luận thì hệ thố ng ph ải đạt các yêu cầu sau đây: - H ệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 -1,5, tr ừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận. Yêu c ầu này được áp dụng rộng rãi cho các phép thử và định lượng trong cá c chuyên lu ận. - Đ ộ lệch chuẩn tối đa đ ược phép cho các lần tiêm lặp lại của dung dịch đối chiếu không được vượt quá các tr ị giá cho trong bảng 5.8.1. Yêu c ầu này chỉ áp dụng cho các phép định lượng và không áp dụng cho phép th ử tạp chất liên quan. Giới hạ n phát hi ện pic (ứng với tỷ số tín hiệu trên nhiễu là 3) là nhỏ hơn gi ới hạn có thể bỏ qua của các tạp chất liên quan. Giới hạn định lượng của pic (ứng với tỷ số tín hi ệu tr ên nhiễu là 10) thì nhỏ hơn hoặc bằng giới hạn có thể bỏ qua của các tạp chất liên quan. B ảng 5.8.1. Yêu c ầu về độ lặp lại S ố lần ti êm 3 4 5 6 B (%) Đ ộ lệch chuẩn tối đa được phép 2,0 0,41 0,59 0,73 0,85 2,5 0,52 0,74 0,92 1,06 3,0 0,63 0,89 1,10 1,27 Yêu c ầu về tính phù hợp của hệ thống cho các chuyên luận không có trong Dược đi ển Vi ệt Nam: Tr ừ khi có ch ỉ dẫn riêng trong chuyên luận, độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm l ặp là 2,0%. Yêu c ầu n ày chỉ áp dụng cho các phép định lượng. Đi ều chỉnh các điều kiện sắc ký Đ ể thoả mãn các tiêu chí trong yêu cầu về tính phù hợp c ủa hệ thống, mà không làm thay đổi cơ bản phương pháp, có thể điều chỉnh các thông số sắc ký trong phạm vi nêu trong bảng cho dưới đây để tham kh ảo. Các điều kiện sắc ký đã được thẩm định trong quá trình xây dựng chuyên luận. Các phép thử tính phù h ợp củ a h ệ thống đ ược đưa vào để đảm bảo yêu cầu về tách cho phép thử hay phép định lượng đạt ch ất l ượng mong muốn. Tuy nhiên, vì pha tĩnh chỉ được mô tả một cách chung chung, và trên thị trường l ại có nhiều loại pha tĩnh có những đặc tính sắc ký khác nhau, nên có th ể cần điều chỉnh một số điều ki ện sắc ký để đạt các yêu cầu của tính phù hợp của hệ thống. Đặc biệt trong phương pháp sắc ký pha đ ảo, việc thay đổi các thông số sắc ký không phải lúc nào cũng cho kết quả tách thoả đáng. Trong trư ờng hợp n ày, có thể p h ải thay cột khác c ùng loại, ví dụ một cột silicagel gắn C18 khác mà có thể cho k ết quả mong muốn. 8 V ới các thông số quan trọng, việc điều chỉnh được xác định rõ ràng trong chuyên luận để đảm bảo tính phù h ợp của hệ thống. Nên tránh đi ều chỉnh nhiều thứ một lúc vì có th ể gây tác động tích luỹ tr ên hiệu năng của hệ thống. S ắc ký lớp mỏng v à sắc ký giấy Thành ph ần pha động : lư ợng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh %30 n ồng độ tương đối hay 2 % nồng độ tuyệt đối tuỳ theo cái nào lớn hơn. Ví dụ với dung môi thành phần nhỏ cỡ 10% của pha đ ộng thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là nồng độ trong khoảng 7 -13% trong khi thay đ ổi 2% nồng đ ộ tuyệt đối nghĩa là nồng độ trong khoảng 8 -12%; như v ậy khoảng theo nồng độ tương đối l ớn hơn; n ếu thành phần dung môi nhỏ là 5% thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là trong khoảng 3,5 -6,5% và thay đ ổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa l à trong khoảng 3 -7%, trong trư ờng hợp n ày khoảng theo nồng độ tuyệt đ ối lớn hơn. Không thành phần dung môi nào đượ c thay đ ổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối. pH c ủa thành phần nước trong pha động : ch ỉ điều chỉnh thay đổi  0,2 đơn v ị pH trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận, hay thay đổi  1 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất trung tính. N ồng độ muối trong thành ph ần đệm của pha động: được thay đổi  10% Th ể tích mẫu chấm sắc ký đi ều chỉnh trong khoảng 10 -20% c ủa thể tích quy định nếu sử dụng bản m ỏng cỡ hạt nhỏ (2 -10 μm). Kho ảng dịch chuyển c ủa tuyến dung môi không đư ợc dưới 50mm và với bản mỏng hiệu năng cao thì không được dưới 30 mm. S ắc ký lỏng Thành ph ần pha động lư ợng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh %30 n ồng độ tương đối hay 2 % n ồng độ tuyệt đố i tu ỳ theo tr ị số nào l ớn hơn. (Xem ví dụ ở trên). Không thành phần dung môi nào đư ợc thay đổi l ớn hơn 10% n ồng độ tuyệt đối. Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: Được thay đổi  10%. Bư ớc sóng detector không đư ợc điều ch ỉnh. Pha t ĩnh: Chi ều dài cột:  70% Đư ờng kính trong của cột:  25% Cỡ hạt: Gi ảm tối đa 50% v à không được phép tăng. Lưu lư ợng pha động:  50%. Khi trong chuyên lu ận cho thời gian lưu của pi c chính, thì ph ải thay đổi lưu lư ợng dung môi nếu đã thay đổi đường kính trong của cột. Không được giảm lưu lượng dung môi n ếu trong chuy ên luận sử dụng số đĩa lý thuyết biểu kiến trong phần đánh giá chất lượng. Nhi ệt độ  10%, t ối đ a là 60 o C. Th ể tích tiêm có th ể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định là thoả đáng. R ửa giải gradient C ấu h ình của thiết bị dùng có thể thay đổi đáng kể độ phân giải, thời gian lưu và thời gian lưu t ỷ đối đ ã nêu trong phương pháp. N ếu điều n ày xảy ra thì có thể do thể tích dung môi cư trú (dwell volume) quá l ớn. Thể tích dung môi cư trú là thể tích giữa điểm hai dung môi rửa giải gặp nhau và điểm đầu cột. S ắc ký khí Pha t ĩnh : Chi ều dài cột:  70% Đư ờng kính trong c ủa cột:  25% Cỡ hạt: gi ảm tối đa 50% v à không được phép tăng Bề d ày lớp phim: gi ảm 50% đến tăng 100%. 9 Lưu lư ợng pha động:  50%. Nhi ệt độ  10% Th ể tích tiêm có th ể giảm nế u gi ới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định là thoả đáng. Đ ịnh lượng Đáp ứng detector : Đ ộ nhạy của detector là tín hiệu đầu ra khi một đơn vị nồng độ hay một đơn vị khối lư ợng trong pha động đi v ào detector. Hệ số đáp ứng tương đối của det ector, thư ờng đ ược gọi là h ệ số đáp ứng , bi ểu thị độ nhạy của một detector đối với một chất chuẩn. H ệ số hiệu chỉnh là ngh ịch đảo của h ệ số đáp ứng. Phương pháp chu ẩn ngoại. N ồng độ các thành phần cần phân tích được xác định bằng cách so sánh (các) đáp ứ ng pic c ủa dung dịch thử với đáp ứng pic của chất đối chiếu. Phương pháp chu ẩn nội. Ch ất chuẩn nội phải l à một chất có thể tách khỏi chất khảo sát. Thêm cùng lư ợng chuẩn nội vào dung dịch thử và dung dịch chất đối chiếu. Chất chuẩn nội không được có phản ứng với khảo sát, phải bền và không chứa tạp có thời gian lưu tương tự thời gian lưu chất khảo sát. N ồng độ chất khảo sát được xác định dựa vào việc so sánh tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa ch ất khảo sát v à chuẩn nội trong dung d ịch thử với tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chu ẩn nội trong dung dịch chất đối chiếu. Quy trình chu ẩn hoá, còn g ọi là phương pháp chuẩn hoá . Hàm lư ợng phần trăm của một hay nhiều thành ph ần trong chất thử được tính bằng cách xác định diện tí ch m ột pic hay nhiều pic dưới dạng % c ủa tổng diện tích tất cả các pic trừ các pic của dung môi hay thuốc thử và các pic ở dưới mức có thể bỏ qua. Quy trình hi ệu chuẩn, còn g ọi là phương pháp đường chuẩn . Xác đ ịnh mối quan hệ giữa tín hiệu đo đư ợc hay đán h giá đư ợc (y) và lượng (nồng độ, khối lượng , vv.) c ủa chất (x) rồi tính hàm hiệu chu ẩn (phương tr ình đường chuẩn). Tính kết quả phân tích từ tín hiệu của chất phân tích (được đo hay được đánh giá) theo phương pháp hàm s ố ng ược. Trong các chuyên lu ận th ườ ng cho các phương pháp đ ịnh l ượng khác nhau như phương pháp chuẩn ngo ại, phương pháp chuẩn nội, quy trình chuẩn hoá (phương pháp đường chuẩn) nhưng ít khi dùng quy trình chu ẩn hoá (phương pháp chuẩn hoá). Trong các phép thử tạp chất liên quan, người ta d ùng ho ặc phương pháp chu ẩn ngoại với m ột dung dịch đối chiếu, hoặc dùng quy trình chuẩn hoá. Tuy vậy trong c ả hai ph ương pháp chuẩn ngoại và chuẩn hoá, nếu phải pha loãng một dung dịch chất thử để so sánh thì hệ số đáp ứng của các tạp chất liên quan phải x ấp xỉ đáp ứng của bản thân chất phân tích (hệ số đáp ứng 0,8-1,2), n ếu không thì phải dùng hệ số hiệu chỉnh. Khi trong chuyên lu ận có quy định phép thử các tạp chất liên quan là tổng các tạp chất hay khi phải định lư ợng một tạp chất thì điều quan trọng là ph ải chọn một ngưỡng thích hợp và các điều kiện thích hợp cho vi ệc lấy tích phân các diện tích pic. Trong các phép thử nh ư vậy thì ngư ỡng bỏ qua (ngh ĩa l à các di ện tích pic dưới ngưỡng này không được tính đến) thường là 0,05%. Như thế, ngưỡng đặt cho hệ th ống thu thập dữ liệu ít nhất phải là nửa ngưỡng bỏ qua. Việc lấy tích phân các diện tích pic của các tạp không đư ợc tách hoàn toàn khỏi pic chính nên được thực hiện theo phương pháp ngoại suy từ hõm tới hõm (v ạch tiếp tuyến). Các pic của dung môi ho à tan m ẫu cũng đ ược bỏ qua. . chất liên quan. B ảng 5. 8. 1. Yêu c ầu về độ lặp lại S ố lần ti êm 3 4 5 6 B (%) Đ ộ lệch chuẩn tối đa được phép 2,0 0,41 0 ,59 0,73 0, 85 2 ,5 0 ,52 0,74 0,92 1,06 3,0 0,63 0 ,89 1,10 1,27 Yêu c ầu. Gauss (hình 5. 8. 1) ta có h ệ thức: w h = 1, 18 w i 3 Hình 5. 8. 1 Hệ số đối xứng H ệ số đối xứng (A s ) (hay h ệ số kéo đuôi) c ủa một pic Hình 5. 8. 2 đư ợc tính theo công thức: d2 w A 05, 0 S  Trong. lục 5. 1) - Phương pháp s ắc ký khí (Phụ lục 5. 2) - Phương pháp s ắc ký lỏng (Phụ lục 5. 3) - Phương pháp s ắc ký lớp mỏng ( Ph ụ lục 5 .4) - Phương pháp s ắc ký rây phân t ử (Ph ụ lục 5 .5) Đ ịnh