ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH docx

Kháng thể là những protein hòa tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó Nguyên lý của phương pháp ELISA

Định nghĩa elisa

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA

(Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

Kháng nguyên – kháng thể

Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động

hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và

polysaccharide Chưa biết gắn trên bề mặt

Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin trong các protein máu Kháng thể là những protein hòa tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một kháng nguyên

và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó

Nguyên lý của phương pháp ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể

Thêm vào một cơ chất (substance) của enzyme

đó Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín

hiệu có thể xác định được.

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ

được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra

KT đặc hiệu cho KN chưa biết.

Đo OD

tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất

sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra.

Phương thức gắn đặc hiệu :

KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra

Phương thức cố đinh không đặc hiệu:

KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa

Kết quả

Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện

KN cần kiểm tra

Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary

antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học

(bioconjugation),

KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp

này.

Enzyme sử dụng trong phương pháp elisa

Enzyme ở đây được sử dụng để xác định hỗn hợp kháng

nguyên – kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch Ta

có thể sử dụng máy so màu quang điện, huỳnh quang để xác định phản ứng

Enzyme alkaline phosphate

Enzyme này được sử dụng trong phản ứng miễn dịch

Người ta thường sử dụng enzyme này với hoạt tính

2500UI/mg, ở nhiệt độ 37oC

Để xác định hoạt tính alkaline phosphate có thể sử dụng

máy huỳnh quang với 4 – methylumbeliferyphosphate làm

cơ chất

galactosidase

ß-Người ta thường sử dụng enzyme này có hoạt tính riêng lớn hơn 250UI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl- ß-galactosidase, ở

37oC

Hoạt tính của ß-galactosidase được đo bằng máy quang điện với 4-methylumbelliferyl- ß-galactosidase Ngoài ra ta có thể

sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ß-galactosidase

Horseral peroxidase

Enzyme này chứa hai đến ba nhóm hoạt động amine trong

phân tử và chứa 12-14.5% carbohydrate Xác định hoạt tính enzyme này bằng máy quang điện cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-sulfonate] (ABTS) và peroxidase có hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25oC

Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là tetramethyl benzidine

3,3’;5,5’-Thiết bị sử dụng

Khay nhựa 96 giếng

Thiết bị sử dụng

Máy đọc elisa (máy quang phổ có các bước sóng khác nhau

Thiết bị sử dụng

Micropipette

Micropipette tips

Thiết bị sử dụng

Máy rửa khay nhựaMicropipette multi tips

Ưu điểm phương pháp elisa

+Dễ thực hiện

+ Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu

+ Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE

Nhược điểm

+ Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h)

+ Thiết bị mắc tiền

ELISA TRỰC TiẾP

Cố định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng

Thêm kháng thể có gắn enzyme

“Rửa”

“Rửa”

Bước “blockin”

Thêm cơ chất Ghi nhận sự thay đổi

( màu, huỳnh quang, OD…)

1 Elisa trực tiếp

Phát hiện trực tiếp : KN virus, axit nucleic

hoặcVirus.

Áp dụng:

- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra

từ mẹ nhiễm HIV.

- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai

đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT

không rõ ràng.

- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích

nghiên cứu khác

2.Elisa gián tiếp

Cố định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng

Thêm kháng thể thứ cấp

“Rửa”

“Rửa”

Bước “blockin”

Thêm cơ chất Ghi nhận sự thay đổi

( màu, huỳnh quang, OD…)

2 Elisa gián tiếp

Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn

Enzym Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế

3 Sandwich Elisa

Cố định các kháng nguyên, kháng thể chưa biết

Ghi nhận kết quả

KT dùng để phát hiện gắn với enzyme được thêm vào

Thêm cơ chất Thêm mẫu cần xác định KN ( hoặc KT )THAO TÁC

3 Sandwich Elisa: không sử dụng kháng thể thứ

cấp

ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng

nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin

người gắn enzym Như vậy hình thành 1 Sandwich của

phức hợp KN_KT_KN_Enzym Sự thay đổi này làm tăng

độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym

3 Sandwich Elisa: sử dụng kháng thể thứ cấp

• Độ nhạy cao.

Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác

là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với

kháng thể kháng HIV có gắn Enzym Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với

KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải

thử

Ứng dụng của phương pháp elisa

-Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh

- Kiểm tra sự có mặt của KN

-Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm

-Xác định sự có mặt của dược phẩm

-Xác định hoạt tính một số hợp chất sinh học

-Xét nghiệm HIV

AIDS(Acquired Immuno-Deficiency Syndrome)

là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

gây ra bởi HIV (Human Immuno-Deficiency virus)

AIDS xảy ra do sự tấn công HIV vào tế bào của

hệ miễn dịch Trước hết là T-CD4 làm suy

giảm số lượng và rối loạn chức năng của tế bào này dẫn dến hàng loạt rối loạn khác của

hệ miễn dịch, gây ra suy giảm miễn dịch

nghiêm trọng, tạo điều kiện cho nhiễm trùng

cơ hội phát triển, cuối cùng là tử vong

Xét nghiệm HIV

Lấy máu

Rửa giải các thành phần khác trong huyết thanh.Nếu

huyết thanh có kháng thể HIV sẽ được giữ lại

vào các đĩa mà kháng nguyên HIV được cố định Huyết thanh của một người được pha loãng ra 400 lần

So sánh con số này với kết quả mẫu huyết thanh

của người bình thường

Một kháng thể thứ cấp đặc hiệu với kháng thể HIV

được thêm vào đĩa

Enzyme:Horseral peroxidase

Cơ chất: TMB

thay đổi màu sắc: “đầu tiên màu vàng

độ hấp thu quang: bước sống 450nm

Xét nghiệm HIV

Nhược điểm: C ơ thể đã nhiễm HIV  kháng thể ítXN âm tính giả XN lại 3 -6 tháng