Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CÁ CHẠCH (MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) ĐƯỢC CHUYỂN GEN HORMONE SINH TRƯỞNG NGƯỜI" docx

73 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CÁ CHẠCH (MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) ĐƯỢC CHUYỂN GEN HORMONE SINH TR ƯỞNG NGƯỜI Tr n Qu c Dung Tr ng i h c S ph m, i h c Hu TÓM TẮT Tr ng và tinh trùng c a cá ch ch (Misgurnus anguillicaudatus) c thành th c hoá b ng cách tiêm não thu th cá chép. Phôi cá ch ch giai o n m t t bào thu nh n t s th tinh nhân t o c s d ng vi tiêm. Màng chorion c a tr ng th tinh c lo i b b ng enzyme tripsin tr c khi tiêm gen hormone sinh tr ng ng i (hGH). Tr ng sau khi tiêm c chuy n vào trong dung d ch Holtfreter bão hoà 100% không khí 27 - 28ºC. S mô t quá trình phát tri n c a phôi cá ch ch c chuy n gen hGH ch y u d a vào s quan sát các c i m hình thái và sinh lý c a phôi d i kính hi n vi. K t qu nghiên c u ã xác nh c m t s giai o n phát tri n c a phôi cá ch ch c chuy n gen hGH l n l t di n ra nh sau: tr ng ch a th tinh, tr ng m t t bào, tr ng hai t bào, tr ng b n t bào, tr ng tám t bào, tr ng 32 t bào, tr ng nhi u t bào, th i k u phôi v , th i k gi a phôi v , th i k cu i phôi v , th i k phôi th n kinh, th i k b c m t, th i k m m uôi, th i k vây uôi, th i k c hi u ng, th i k tim p và th i k n . T khoá: gen hormone sinh tr ng ng i, Misgurnus anguillicaudatus, s phát tri n phôi, th tinh nhân t o, vi tiêm. 1. M ở đầu M ục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền c ủa cây trồng, vật nuôi nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp. Trong công tác c ải tạo giống cổ truyền, chủ yếu sử dụng phương pháp lai và chọn lọc để c ải tạo nguồn gen của sinh vật. Tuy nhiên, do quá trình lai tạo tự nhiên, con lai thu được qua lai t ạo và chọn lọc vẫn còn mang luôn cả các gen không mong muốn do tổ hợp hai b ộ nhiễm sắc thể đơn bội của giao tử đực và giao tử cái. Một hạn chế nữa là việc lai tạo t ự nhiên chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong loài. Lai xa, lai khác loài gặp nhiều khó kh ăn, con lai thường bất thụ do sai khác nhau về bộ nhiễm sắc thể cả về số lượng l ẫn hình thái giữa bố và mẹ, do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh học giữa các loài không phù h ợp với nhau. Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực DNA tái tổ h ợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên. Nó 74 cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào động vật, thực vật để tạo ra những giống v ật nuôi, cây trồng mới kể cả việc đưa gen từ giống này sang giống khác, đưa gen của loài này vào loài khác [1]. Bằng kỹ thuật tiên tiến nêu trên của công nghệ sinh học hiện đại, vào năm 1982 Palmiter và c ộng sự đã chuyển được gen hormone sinh trưởng của chuột cống vào chuột nh ắt, tạo ra được chuột nhắt “khổng lồ”. Từ đó đến nay, hàng loạt động vật chuyển gen đã được tạo ra như thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá mang những tính trạng ưu việt như t ăng trưởng nhanh, có khả năng chống chịu bệnh Bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) ng ười ta đã chuyển các gen định hướng vào phôi cá giai đoạn một tế bào và đã tạo ra hàng loạt cá chuyển gen (cá giếc, cá chép, cá vàng, cá medaka, cá h ồi…) [9, 10]. Để làm chủ kỹ thuật tạo cá chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành nghiên c ứu đưa gen hormone sinh trưởng người (hGH) vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) [1, 2, 3, 4, 5, 6] b ằng phương pháp vi tiêm. Phôi cá chạch chuyển gen hGH sau đó được quan sát sự phát triển cho đến khi nở. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. V ật liệu nghiên cứu Phôi cá ch ạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone sinh tr ưởng người giai đoạn một tế bào. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Tr ứng và tinh dịch cá chạch được chủ động thu nhận sau khi cá bố mẹ được thúc chín b ằng tiêm não thuỷ thể cá chép và tiến hành thụ tinh nhân tạo [7]. Phôi giai đoạn m ột tế bào được đồng loạt tạo ra và được khử màng chorion bằng enzyme tripsin (Hình 1). Vi tiêm được tiến hành trên máy vi thao tác Olympus (Narishige, Nhật Bản) qua các b ước: chuyển phôi một tế bào vào buồng tiêm, gen hGH được nạp vào kim tiêm, lắp kim tiêm và kim gi ữ vào máy vi thao tác, giữ phôi vào đầu kim giữ bằng bằng lực hút c ủa syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và bộ phận vi thao tác để đưa đầu kim tiêm vào vị trí đĩa phôi, vặn nhẹ syringe để chuyển gen vào phôi. Vi tiêm gen hormone sinh tr ưởng người vào các phôi trần giai đoạn một tế bào. Sau khi vi tiêm gen hormone sinh tr ưởng người, phôi được cho vào trong dung dịch Holtfreter (NaCl 3,5%; KCl 0,05%; CaCl 2 0,1%; NaHCO 3 0,2%) là dung dịch đẳng trương với phôi trần, bão hoà 100% không khí, t ạo điều kiện cho phôi phát triển thuận lợi, vì phôi trần rất dễ bị v ỡ khi ấp ở môi trường nước do tác dụng nhược trương. Phôi trần rất dễ bị tấn công bởi các tác nhân gây b ệnh từ môi trường bên ngoài nên môi trường đưa phôi vào phải được vô trùng. S ự phát triển của phôi được mô tả chủ yếu dựa vào sự quan sát các đặc điểm hình thái và sinh lý d ưới kính hiển soi ngược Olympus, ở 27 - 28 0 C. 75 3. Kết quả và thảo luận a) Tr ng ch a kh màng chorion b) Tr ng ã kh màng chorion Hình 1. Tr ng cá ch ch giai o n m t t bào c ch p d i kính hi n vi ( phóng i 40x) Sự phát triển của phôi cá chạch vi tiêm gen hormone sinh trưởng người được quan sát, mô t ả thành một số giai đoạn. Trước hết là giai đoạn trứng chưa thụ tinh (Hình 2.1). Đặc điểm của giai đoạn này là trứng trương nước, to ra, noãn chất phân bố đồng đều. Trứng tiếp tục trương nước. 15 phút sau thụ tinh, phôi chuyển sang giai đoạn trứng m ột tế bào (Hình 2.2). Vào lúc này quan sát thấy đĩa phôi phồng lên dạng thấu kính lồi, noãn ch ất tập trung về một đầu, đĩa phôi bắt đầu lồi lên, độ thấu quang của trứng tăng lên. S ự phân cắt lần thứ nhất xảy ra vào lúc 30 phút sau thụ tinh, chia đĩa phôi thành hai t ế bào có kích thước như nhau. Đây là giai đoạn trứng hai tế bào (Hình 2.3). Sau giai đoạn trứng hai tế bào là giai đoạn trứng bốn tế bào: vào thời điểm sau thụ tinh khoảng 50 phút, x ảy ra sự phân cắt lần thứ hai của phôi tạo thành trứng bốn tế bào (Hình 2.4). S ự phân cắt lần thứ ba của phôi diễn ra vào lúc 60 phút sau thụ tinh hình thành trứng tám t ế bào (Hình 2.5). Đến 1 giờ 10 phút kể từ lúc thụ tinh, phôi phân cắt lần thứ năm t ạo thành trứng 32 tế bào (Hình 2.6). Sự phân cắt tiếp tục xảy ra nhiều lần tạo thành phôi nhi ều tế bào (1 giờ 15 phút sau thụ tinh). Đặc điểm nổi bật của giai đoạn này là kích th ước tế bào ngày càng nhỏ so với các giai đoạn trước đó. Phôi nang hình thành được quan sát thấy vào lúc 3 giờ 40 phút sau thụ tinh, với số tế bào phân chia nhiều không th ể đếm được (Hình 2.7). Tiếp đến là thời kỳ phôi vị với ba giai đoạn: thời kỳ đầu phôi vị, giữa phôi vị và cuối phôi vị. Thời kỳ đầu phôi vị (4 giờ sau thụ tinh) với đĩa phôi trùm xu ống 1/2 khối noãn hoàng, xuất hiện vòng phôi (Hình 2.8). 4 giờ 40 phút sau th ụ tinh, phôi phát triển chuyển sang thời kỳ giữa phôi vị, đĩa phôi trùm xuống 2/3 kh ối noãn hoàng, xuất hiện phôi thuẫn (Hình 2.9). Thời kỳ cuối phôi vị, 5 giờ 35 phút sau th ụ tinh. Lúc này đĩa phôi trùm xuống 4/5 khối noãn hoàng (Hình 2.10). Đến 7 giờ 30 phút sau th ụ tinh, quan sát thấy ở phía lưng phôi thai có tấm thần kinh nổi lên. Giai đoạn này được gọi là thời kỳ phôi thần kinh (Hình 2.11). Sau thời kỳ phôi thần kinh là th ời kỳ bọc mắt, quan sát được vào lúc 11 giờ 15 phút sau thụ tinh. Dễ dàng phát hiện th ấy sự xuất hiện của một tổ chức mới là bọc mắt. Sau đó, mầm đuôi của phôi hình Màng chorion 76 thành, có thể thấy rõ các đốt thân, 12 giờ 10 phút sau thụ tinh (Hình 2.13). Tiếp theo th ời kỳ mầm đuôi là thời kỳ vây đuôi (13 giờ 55 phút sau thụ tinh). Đặc điểm của giai đoạn này là vây đuôi xuất hiện, thân kéo dài (Hình 2.14). Đến 15 giờ 5 phút sau thụ tinh, quan sát phôi ở giai đoạn này thấy cơ bắt đầu co duỗi, đuôi dài thêm (thời kỳ cơ hiệu ứng). Thời kỳ tim đập, 18 giờ 25 phút sau thụ tinh, tim bắt đầu co bóp, rung động một cách t ương ứng, phôi thể kéo dài (Hình 2.15, 2.16). 24 giờ sau thụ tinh, cá con vừa mới n ở. S ự phát triển của phôi cá chạch được chuyển gen hGH nhìn chung là giống với phôi cá ch ạch đối chứng không được chuyển gen. Thời gian ấp nở của cả hai loại phôi đều là 24 tiếng [3]. So sánh với kết quả nghiên cứu của Melvin Weisbart (1993) [8] trên cá pupfish (Cyprinodon macularius), m ột loài cá sống chủ yếu ở nước lợ, phân bố ở phía Nam Sanora, Mexico và d ọc theo bờ biển Salton ở California, Mỹ thì quá trình phát tri ển phôi trải qua các giai đoạn: trứng chưa thụ tinh, trứng một tế bào (15 phút sau th ụ tinh), trứng hai tế bào (55 phút sau thụ tinh), trứng bốn tế bào (1 giờ 25 phút sau thụ tinh), tr ứng tám tế bào (1 giờ 50 phút sau thụ tinh)… và thời gian ấp nở là 108 giờ sau th ụ tinh. Như vậy, thời gian để đạt các giai đoạn phát triển khác nhau cũng như thời gian ấp nở của phôi cá cá chạch là ngắn hơn nhiều so với cá pupfish. 4. Kết luận K ết quả nghiên cứu đã xác định được một số giai đoạn phát triển của phôi cá ch ạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone sinh trưởng người lần l ượt diễn ra như sau: trứng chưa thụ tinh, trứng một tế bào, trứng hai tế bào, trứng bốn t ế bào, trứng tám tế bào, trứng 32 tế bào, trứng nhiều tế bào, thời kỳ phôi nang, thời kỳ đầu phôi vị, thời kỳ giữa phôi vị, thời kỳ cuối phôi vị, thời kỳ phôi thần kinh, thời kỳ b ọc mắt, thời kỳ mầm đuôi, thời kỳ vây đuôi, thời kỳ cơ hiệu ứng, thời kỳ tim đập và th ời kỳ nở. 77 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 2.7 Hình 2.8 Hình 2.9 Hình 2.10 Hình 2.11 Hình 2.12 a phôi T m th n kinh B c m t Vòng phôi 78 Hình 2.13 Hình 2.14 Hình 2.15 Hình 2.16 Hình 2. M t s giai o n phát tri n c a phôi cá ch ch (Misgurnus anguillicaudatus) c chuy n gen hormone sinh tr ng ng i TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tr n Qu c Dung, Nghiên c u chuy n gen hormone sinh tr ng ng i vào cá ch ch (Misgurnus anguillicaudatus) b ng vi tiêm, Lu n án Ti n s Sinh h c, Tr ng i h c S ph m Hà N i, 2001. 2. Tr n Qu c Dung, Quy n ình Thi, Nguy n Th Di u Thuý, Nguy n V n C ng, ng H u Lanh, Tinh s ch và ánh giá s b gen hormone sinh tr ng ng i chuy n vào cá vàng và cá ch ch, T p chí Di truy n h c và ng d ng S 2, (1999), 39-44. 3. Tr n Qu c Dung, V V n Di n, Nguy n Kim , Quy n ình Thi, Nguy n Th Di u Thuý, Nguy n V n C ng, ng H u Lanh, T o cá ch ch mang gen hormone sinh tr ng ng i, T p chí Sinh h c 21(3), (1999), 24-28. 4. Nguy n V n C ng, V V n Di n, Nguy n Kim , Nguy n Th Di u Thuý, Quy n ình Thi, Tr n Qu c Dung, T o cá chuy n gen hormone sinh tr ng ng i. Báo cáo khoa h c. K y u H i ngh Công ngh sinh h c toàn qu c 9-10/12/1999, NXB Khoa h c và K thu t, Hà N i, (1999), 1429-1437. Vây uôi M m uôi 79 5. Nguy n Kim , Nguy n V n C ng, Nguy n Th Di u Thuý, Tr n Qu c Dung, K t qu nghiên c u kh màng chorion c a phôi giai o n m t t bào chu n b cho k thu t vi tiêm vào cá ch ch Misgurnus anguillicaudatus. K y u Vi n Công ngh sinh h c, Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa h c và K thu t, Hà N i, (1997), 267-272. 6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth hormone (MThGH) gene microinjection. Proceedings, Third Asian Symposium of Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12, (1997), 108-114. 7. Chung Lân, Lý H u Qu ng, Tr ng Tùng ào, L u Gia Chi u, Tr n Ph n X ng (Ng i d ch: D ng Tu n, Nguy n Kim , Tr n Nguy t Thu, Tr n Nh t Anh), Sinh v t h c và sinh s n nhân t o các loài cá nuôi, NXB Khoa h c và K thu t, Hà N i, 1969. 8. Melvin Weisbart, Egg development: from gametes to embryonic development and hatching, Transgenic Fish, World Scientific, (1993), 1-26. 9. Patrick J. Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to Biotechnological Applications, Published by Singer, The Neitherlands, 2007. 10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: method and mechanism, Transgenic Fish, World Scientific, (1993), 93-119. INVESTIGATION OF THE DEVELOPMENT OF LOACH EMBRYO (MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) TRANSFERRED HUMAN GROWTH HORMONE GENE Tran Quoc Dung College of Pedagogy, Hue University SUMMARY Eggs and spermatozoa of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were stimulated to mature by injection of carp pituitary. The embryos at one-cell stage obtained by artificial fertilization were used for microinjection. Before microinjection, the chorion membranes of the fertilized eggs were eliminated by tripsin. After microinjected with human growth hormone gene (hGH), the eggs were incubated in Holtfreter solution with 100% air saturation at 27 - 28ºC. The description of embryonic development of the loach transferred hGH gene was based on morphological and physiological features that can be readily observed under the inverted microscope in the living embryo. The results show that the embryonic development of the loach includes the following stages: unfertilized ovum, one-celled egg, two-celled egg, four-celled egg, thirty two-celled egg, multiple-celled egg, balstula, early gastrula, intermediate gastrula, late 80 gastrula, formation auditory placodes, formation of optic vesicles, development of dermal fin rays in the caudal fin, effected muscle, heart beat and hatching. Key words: embryonic development, human growth hormone gene, microinjection, Misgurnus anguillicaudatus. . 73 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CÁ CHẠCH (MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) ĐƯỢC CHUYỂN GEN HORMONE SINH TR ƯỞNG NGƯỜI Tr n Qu. chuyển gen hGH sau đó được quan sát sự phát triển cho đến khi nở. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. V ật liệu nghiên cứu Phôi cá ch ạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone. đã chuyển các gen định hướng vào phôi cá giai đoạn một tế bào và đã tạo ra hàng loạt cá chuyển gen (cá giếc, cá chép, cá vàng, cá medaka, cá h ồi…) [9, 10]. Để làm chủ kỹ thuật tạo cá chuyển