CNSHDV: Nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân

Các kĩ thuật nhân bản vô tính reproductive cloningNhân bản phôi động vật cloning hiện nay dùng một trong 3 kỹ thuật sau: - Phân tách các tế bào blastomere blastomere separation, - Chia

NHÂN BẢN BẰNG KỸ THUẬT

CHUYỂN NHÂN TẾ BÀO

Thực hiện: LÊ THỊ ĐÀO

Giáo viên hướng dẫn: TRẦN QUỐC DUNG

2 Các kĩ thuật cơ bản nhân bản vô tính

2.1 Nhân bản phôi bằng phân tách các tế bào blastomere

2.2 Nhân bản phôi bằng chia cắt phôi túi (blastocyst division)

2.3 Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào (Nuclear Transplanation) 2.4 Một số kĩ thuật chuyển nhân được dùng phổ biến

3 Thành tựu của công nghệ nhân bản vô tính ở động vật

4 Một số khiếm khuyết ở động vật nhân bản vô tính

5 Ứng dụng của nhân bản vô tính ở động vật

6 Vấn đề đạo lí sinh học

tế bào bị tổn thương trong các cơ thể trưởng thành, mang lại cho nhân loại hy vọng chữa được nhiều bệnh mãn tính và nan giải mà hiện nay chưa có biện pháp điều trị hiệu quả

Nhân bản (cloning) vô tính không phải là cuộc “cách mạng” trong kỹ thuật sinh học, bất ngờ đến mức choáng váng “Cloning” là một từ đã trở nên quen thuộc từ lâu Song với sự ra đời cừu Dolly bằng kỹ thuật chuyển nhân đã làm cả thế giới hoang mang, lo sợ rằng các nhà Sinh học sẽ cướp đi quyền tạo hoá để tiến tới cả clone người Nhiều ý kiến, nhiều cuộc tranh luận và đã có nhiều thí nghiệm tạo dòng vô tính trên động vật Khả năng tạo ra một đứa trẻ nhân bản là hoàn toàn có thể xảy ra Con người cần phải chuẩn bị cho những thay đổi lớn lao

1 Khái niệm

Nhân bản (cloning) là tạo ra “bản sao” của một tế bào hoặc một sinh vật Các “bản sao” được tạo ra bằng kỹ thuật cloning được gọi là các clone Dòng (clone) dùng để chỉ những phân tử DNA, những tế bào, những cơ thể hoàn chỉnh

có cùng một cấu trúc di truyền

Nhân bản người và động vật có thể xảy ra trong tự nhiên hoặc nhân tạo Đây là một hình thức sinh sản đặc biệt mà kết quả là tạo ra các cơ thể giống hệt nhau về gen Nhân bản xảy

ra trong tự nhiên (các trường hợp sinh đôi cùng trứng) còn

2 Các kĩ thuật nhân bản vô tính (reproductive cloning)

Nhân bản phôi động vật (cloning) hiện nay dùng một trong 3 kỹ thuật sau:

- Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation),

- Chia cắt phôi túi (blastocyst division)

- Kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)

Đầu tiên trứng và tinh trùng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi Phôi này được nuôi cấy cho phát triển đến giai đoạn 2 hoặc 4 tế bào, có thể lên 8 tế bào (blastomere) Đến giai đoạn này người ta tách bỏ màng bọc phôi và chuyển phôi vào một môi trường đặc biệt làm cho các blastomere tách rời nhau ra Mỗi blastomere này sau đó được nuôi cấy riêng biệt cho phép hình thành nên một phôi

Phương pháp này có thể tạo ra tối đa là 4 phôi bản sao giống hệt phôi ban đầu về mặt di truyền Mỗi phôi mới được tạo

ra bằng phương pháp này sau đó có thể đem cấy vào tử cung một “mẹ nuôi” cho phép phôi phát triển thành thai nhi trong quá trình mang thai của “mẹ nuôi” Trong kỹ thuật này, các cá thể

Tóm tắt quy trình:

 Tạo phôi: Chọn phôi ở giai đoạn sớm 2 – 4 hay 8 tế bào.

 Tách rời các tế bào: giai đoạn này các tế bào liên kết yếu nên dùng enzyme tripsin hoặc lắc nhẹ trong môi trường ổn nhiệt

và không có ion Ca2+, Mg2+.

 Đóng gói tế bào phôi: mỗi tế bào phôi được bọc trong màng zona.

 Nuôi cấy phôi in vitro đến giai đoạn plastocyst và cấy truyền vào mẹ nhận phôi đã gây đồng pha.

 Đến nay, kĩ thuật này đã áp dụng thành công ở chuột nhà, chuột cống, bò, thỏ, cừu, lợn, khỉ Rhesus Việc tăng số lượng phôi nhằm mục đích nhân nhanh những loài có giá trị về mặt

di truyền, giúp cho việc xác định giới tính phôi, giúp cho các vấn đề nghiên cứu cơ bản và ứng dụng

Đầu tiên trứng và tinh trùng cũng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi Nhưng khác với kỹ thuật phân tách blastomere, phôi này được nuôi cấy cho phân chia tới khi tạo thành blastocyst Lúc này người ta chia cắt blastocyst đó thành 2 phần và cấy nửa đó vào tử cung của một

“mẹ nuôi” Qua quá trình mang thai tự nhiên, hai nửa blastocyst này phát triển thành hai cá thể sinh đôi giống hệt nhau Cũng như các “bản sao” được tạo ra bằng kỹ thuật phân tách blastomere, các “bản sao” được tạo ra trong kỹ thuật chia cắt blastocyst cũng mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai bố-mẹ

Kĩ thuật này chỉ nên chọn những phôi được xác định chắc chắn là phát triển bình thường Chọn giai đoạn phôi dâu già hoặc phôi nang sớm, khi khối tế bào đủ lớn và chưa biệt hóa sẽ cho kết quả tách phôi cao hơn

 Quan điểm 1: Chỉ cần cắt nhân (mầm phôi), sau đó cấy nửa

phôi vào màng zona trước khi nuôi cấy Dùng lưỡi dao cắt màng zona, mở rộng vết cắt, hút nhân phôi ra ngoài Cố định nhân phôi và cắt làm hai phần, hút một nửa nhân phôi trở lại vào màng vừa cắt, còn nửa kia được đưa vào một màng zona của trứng khác đã tách

 Quan điểm 2: Sau khi tách phôi, đem phôi đi cấy ngay, không

cần đưa vào màng zona

* Yêu cầu của hai phương pháp: mỗi nửa phôi phải có ít nhất 40 - 45% khối tế bào còn nguyên vẹn Sau khi cắt, phôi được nuôi cấy trong môi trường mới 2 - 3 giờ trước khi cấy hoặc bảo quản đông lạnh.

2.2 Nhân bản phôi bằng chia cắt phôi túi (blastocyst division)

Để nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân cần có hai tế bào, một tế bào trứng và một tế bào cho nhân Qua thực nghiệm thấy trứng chưa thụ tinh phù hợp nhất cho kỹ thuật này vì nó dễ dàng dung nạp nhân cho hơn

Tế bào trứng phải được loại bỏ nhân, quá trình này làm mất hầu hết thông tin di truyền của trứng Bằng các kỹ thuật khác nhau, tế bào thân được đưa

về giai đoạn G0 (pha không hoạt động) khi đó hoạt động sinh học của tế bào thân được “tắt” nhưng tế bào không chết Ở trạng thái này nhân tế bào thân

đã sẵn sàn được trứng chấp nhận Đặt nhân tế bào cho vào trong tế bào trứng đã loại nhân Sau đó tế bào trứng được kích thích phát triển thành phôi trên in vitro và được đưa vào tử cung “mẹ nuôi” cho phát triển thành thai Nếu tất cả các khâu trong quá trình này được thực hiện một cách chính xác, một bản sao của động vật cho nhân sẽ ra đời

“mẹ” Nhiều “bản sao” có thể được tạo ra bằng cách chuyển các nhân giống nhau vào các trứng lấy từ một cơ thể cho duy nhất

- Nếu các nhân tế bào thân và trứng lấy từ các cá thể khác nhau, chúng sẽ không hoàn toàn giống cơ thể cho nhân vì các “bản sao” sẽ khác ở một số gen ty thể

2.3 Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)

2.3.2 Chuẩn bị tế bào cho nhân

Tế bào cho nhân có thể lấy từ nhiều nguồn với mức độ biệt hóa khác nhau: tế bào tuyến vú, tế bào mô cơ, tế bào đuôi, tế bào gốc biểu mô,

tế bào gan, tế bào cumulus, tế bào thần kinh vỏ não, tế bào mô tinh hoàn,

tế bào máu …

Tế bào cho nhân được nuôi cấy in vitro trước khi chuyển nhân Sự phù hợp giữa chu kì tế bào cho nhân và trạng thái nguyên sinh chất của trứng có ảnh hưởng lớn đến sự thành công trong chuyển nhân

2.3.3 Chuyển nhân

Phương pháp thông thường để chuyển nhân của tế bào cho vào trứng là dung hợp màng hai tế bào trên dưới sự hỗ trợ của kích thích xung điện, xử lí hóa chất hoặc dùng virus Sendai

- Để tiến hành dung hợp bằng xung điện, cặp trứng và tế bào được đặt trong môi trường nhược trương nhẹ, nồng độ ion thấp giữa hai điện cực song song Phát xung điện một chiều với điện áp cao sẽ làm vỡ cấu trúc phospholipide trên màng, tạo những lỗ hổng Trong quá trình hàn gắn, các màng sẽ dung hợp với nhau Có thể vi tiêm tế bào cho nhân dưới màng zona, cạnh màng của cytoplast rồi dung hợp chúng bằng xung điện Bằng cách này thông tin di truyền từ tế bào cho sẽ đi vào cytoplast Nếu kết hợp dung hợp bằng xung điện và virus sendai đã bị bất hoạt thì hiệu quả chuyển nhân cao hơn

- Người ta có thể dùng phương pháp vi viêm để đưa nhân tế bào nhân (đã được bóc màng) vào cytoplast mà không cần tạo lỗ trước

- Một kĩ thuật mới: sử dụng tế bào cho còn nguyên vẹn không tách riêng nhân tiêm thẳng vào trứng đã loại nhân Quy trình này đã thành công trong tạo dòng lợn

2.3 Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)

2.3.4 Hoạt hóa phôi

Kích thích để “hợp tử” tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst (dùng shock điện hoặc dùng môi trường có chứa chất cytochalasin B) Phôi một tế bào hình thành được hoạt hóa bằng các tín hiệu hóa học hay xung điện để khởi động quá trình phát triển tiếp theo Các tín hiệu hóa học thường dùng trong tạo dòng động vật như: ionomycin, ethanol, thimerosal, calci iophore …

Ở ngựa, sử dụng calci inophare kết hợp với cyclo heximide để hoạt hóa trứng chuyển phôi đạt tỉ lệ 29% Có thể dùng dịch chiết tinh trùng

để hoạt hóa trứng đạt tỉ lệ cao, dịch chiết tinh trùng khác loài cũng có tác dụng kích hoạt trứng

2.3.5 Nuôi và cấy phôi

Khối blastocyst này có thể được:

- Nuôi cấy nhằm để lấy tế bào gốc, qua đó có thể tạo ra các clone

tế bào gốc phôi mang gen giống với cơ thể cho tế bào thân (Mục đích nhân bản trị liệu)

- Hoặc đem cấy vào tử cung của một “mẹ nuôi” để cho phát triển thành bào thai, qua đó có thể tạo nên một “bản sao” giống hệt cơ thể cho nhân tế bào thân (Mục đích nhân bản vô tính động vật/người)

2.3 Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)

hút bỏ nhân Cả phôi thụ tinh nhân tạo và phôi được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân đều là các tế bào gốc toàn năng, có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khác với nhân bản bằng kỹ thuật phân tách blastomere và phân chia blastocyst, các động vật được nhân bản bằng

kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân chỉ mang vật liệu di truyền của một bố hoặc mẹ

2.4.1 Kĩ thuật tạo dòng vô tính Roslin

Đây là kĩ thuật tạo ra cừu Dolly tại viện Roslin (Scotland).

2.4 Một số kĩ thuật chuyển nhân được dùng phổ biến

Trong kĩ thuật này, Wilmut đã làm đồng bộ hóa chu kì của tế bào (synchronizing cell cycles) cho nhân và tế bào trứng bằng cách “bỏ đói” tế bào, tức là nuôi cả hai loại tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu không cho tế bào phát triển Việc này làm cho các tế bào “đóng khóa” tất cả các gen hoạt động và đi vào trạng thái nghỉ G0 (gap zero) Kĩ thuật này dùng xung điện

để dung hợp tế bào, đồng thời hoạt hóa sự phát triển của phôi

Loại bỏ nhân của tế bào trứng chưa thụ tinh lấy từ một cừu “mẹ nuôi”, đặt tế bào trứng này sát vách tế bào cho (đã đưa về pha G0) Sau khi rút nhân trứng

từ 1 đến 8 tiếng, cho một dòng điện chạy qua hai tế bào này, shock có tác dụng hòa tế bào trứng (đã bỏ nhân) và tế bào cho nhân với nhau, đồng thời khởi động tế bào mới tạo thành phát triển thành phôi Nếu phôi đó sống, nó được cho phát triển trong khoảng 6 ngày và cuối cùng được đặt vào tử cung

3.4.2 Kĩ thuật tạo dòng Honolulu

Kĩ thuật này do hai người đứng đầu nhóm nghiên cứu Honolulu (đại học

Hawaii) thực hiện và thành công rực rỡ với hơn 50 con chuột giống nhau về di truyền được tạo dòng hoàn hảo Trong kĩ thuật này sử dụng tế bào cumulus (tế bào bao xung quanh trứng) làm tế bào cho nhân Các tế bào này đang ở pha nghỉ nên không cần giai đoạn bỏ đói tế bào Nhân tế bào cumulus được chuyển bằng cách vi tiêm vào vỏ trứng nên ít gây tổn thương trứng hơn dùng xung điện Sau khi tiêm nhân, tế bào trứng được nuôi cấy trung gian tối thiểu 1 giờ giúp tế bào trứng chọn lọc nhân phù hợp và chấp nhận nhân mới Sau 5 giờ tiếp theo trứng được chuyển vào môi trường mới có chất kích hoạt phát triển như trong thụ tinh tự nhiên Chuột, lợn và bê vô tính cũng được tạo bằng

kĩ thuật này

Kỹ thuật Honolulu thành công nhất với các tế bào gò trứng (cumulus cell), vì lý do này các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sử dụng tế bào này Kỹ thuật Honolulu được cho là ưu việt hơn kỹ thuật Roslin và đã được ứng dụng rộng rãi để nhân bản vô tính các động vật khác

2.4 Một số kĩ thuật chuyển nhân được dùng phổ biến

-Dùng ngay, không nuôi cấy ngoài cơ thể

- Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận

bằng shock điện - Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận bằng tiêm trực tiếp

- Đồng thời với nhận nhân trứng được

dòng điện hoạt hóa luôn - Trứng sau nhận nhân (thụ tinh) được để yên 5-6 giờ để cho phép chấp nhận

nhân mới và có thời gian tái lập trình nhân tế bào

- Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển

thành phôi bằng shock điện. - Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển thành phôi bằng ủ trong môi trường hóa

học có chứa cytochalasin B

2.4.4 Kĩ thuật tạo dòng Handmade

Phương pháp này, màng zona được tách ra sau khi trứng trưởng thành và trước khi loại nhân Đầu tiên những tế bào trứng được

xẻ làm đôi, phần chứa nhân bị loại bỏ, hai nửa không có nhân được gắn lại với nhau cùng với vật liệu di truyền của tế bào cho nhân làm thành một trứng mới Kĩ thuật này không cần sử dụng hệ thống vi thao tác để loại nhân và dung hợp tế bào, vì vậy các tác giả gọi kĩ thuật này là Handmade (làm bằng tay)

2.4 Một số kĩ thuật chuyển nhân được dùng phổ biến

một cuộc tranh luận khi công bố nghiên cứu của mình trong lĩnh vực thụ tinh invitro Bắt đầu với 17 phôi người ở trạng thái 2 – 8 tế bào, hai người đã dùng kĩ thuật tách phôi để nhân tổng số phôi lên thành 48

- Năm 1995, Ian Wilmut và cộng sự đã tạo ra cừu Dolly bằng công nghệ chuyển nhân

và sau đó là hai con cừu đầu tiên có mang gen người đặt tên là Polly và Molly (1997)

- Năm 2001, với kĩ thuật chuyển nhân, những phôi người đầu tiên đã được tạo dòng (ở

giai đoạn 6 tế bào) bởi công ty Advanced cell Technology.

- Năm 2004, một con chuột được tạo dòng bằng nhân của tế bào thần kinh khứu giác Tháng 4/2004: Một nhóm nghiên cứu người Nhật Bản thông báo sự ra đời của một con chuột nhắt không cần bố mà chỉ cần các trứng từ chuột mẹ

- Tháng 6/2004: Các nhà nghiên cứu của một bệnh viện đa khoa Chicago tách 12 dòng

tế bào gốc của các phôi người có chứa các bất thường về gen Phát hiện này đã thúc

- Tháng 9/2004: Một phụ nữ người Bỉ cho ra đời một em bé sau khi được tiến hành tự ghép mô trứng được trữ lạnh từ trước Đây là thực nghiệm đầu tiên thuộc loại này.

- Tháng 5/2005: Nhóm nghiên cứu người Hàn Quốc của tiến sỹ Hwang Woo-suk khẳng định đã sử dụng các phôi người bắt nguồn từ sinh sản vô tính để tạo ra các tế bào gốc theo nhu cầu của các bệnh nhân bị các loại bệnh khác nhau.

- Tháng 8/2005: Các nhà nghiên cứu người Hàn Quốc khẳng định đã tạo ra được chó - sinh sản vô tính đầu tiên.

- Tháng 2/2007: Các nhà khoa học Mỹ đã lần đầu tiên nhân bản vô tính thành công chuột từ tế bào gốc trưởng thành lấy từ da của loài gặm nhấm này Tỉ lệ nhân bản thành công từ phương pháp này là 5,4% cao hơn các phương pháp khác Các nhà khoa học Italia đã nhân bản thành công một nhóm lợn nhỏ, những con lợn này giúp họ nghiên cứu việc cấy ghép tạng lợn cho người

3 Thành tựu của công nghệ nhân bản vô tính ở động vật

nghiệm và năm 1999: đã thành công trong lĩnh vực nhân bản Viện Công nghệ sinh học công bố đã nhân bản được giống lợn mini hoang dã sạch dòng, chưa bị ảnh hưởng bởi các chương trình lai tạo như các giống lợn Mẹo, lợn Sóc, lợn Bản Tế bào sinh dưỡng của các giống lợn này được bảo quản trong ngân hàng lạnh, có thể khai thác sử dụng trong các nghiên cứu thụ tinh trong ống nghiệm và nhân bản vô tính với mục đích bảo

vệ đa dạng sinh học Các nhà khoa học cũng cho biết, họ còn thực hiện nghiên cứu nhân bản vô tính trên các loài khỉ đuôi dài và khỉ vàng Kết quả, họ đã tạo được khỉ có thai do cấy phôi nhân bản vô tính, mặc dù thai này chỉ phát triển đến tháng thứ 3.

Việt Nam nhân bản được phôi nang sao la: Trong khi các nhà khoa học tại Viện INRA Jouy-en-Josas, Pháp thông báo nhân bản phôi sao la 6 ngày tuổi, thì tại Việt Nam, nhóm các cộng sự khoa học thuộc Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học, cũng đang nuôi phôi nhân bản 7-12 ngày tuổi từ các tế bào sao la trữ lạnh Tuy các phôi nang này dừng phân chia sau 10 - 12 ngày tuổi vì chưa có tử cung phù hợp để nuôi tiếp, nhưng kết quả đã chứng tỏ thành công bước đầu trong công nghệ nhân bản