Acid oxalic được định lượng bằng một trong các phương pháp sau đây: chuẩn độ bằng dung dịch KMnO; chuẩn; hoặc phương pháp tạo màu bằng cách chuyển hóa acid oxalic thành acid glycolic rồi
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SU PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
KHOA HOA HOC
soilics
KHOA LUAN TOT NGHIEP
Dé tai:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HAM LƯỢNG
ACID OXALIC TRONG MỘT SO LOẠI Mi AN LIEN
BANG PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO
Giang viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Ngoc Hung
Sinh viên thực hiện: Lê Phạm Phương Nam
Trang 2XÁC NHẠN
Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp đã được chính sửa đúng với yêu cầu của Hội
đồng bao vệ khóa luận tốt nghiệp khoa Hóa học năm 2015
Chủ tịch hội đồng
(ro
Đỗ Văn Hué
Trang 3LỜI CÁM ƠNLời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới giáo viên hướng dẫn của em,thay Nguyễn Ngọc Hưng Cám ơn thay đã tạo điều kiện cho em được phát huy tôi đa khanẵng tư duy nghiên cứu của mình Nhờ sự chỉ bao tận tinh của thay ma em có thé giải quyết
được các van dé khó khăn và kịp thời sửa chữa những sai sót của mình Và hơn nữa, qua
đẻ tài nghiên cứu này, em đã được học thêm nhiều tri thức mới, giúp cho kiến thức chuyên
môn của em được củng cô va hoan thiện hơn
Em cũng xin gửi lời cảm ơn rất nhiễu tới các thầy cô khác trong tổ bộ môn Phân tích
Cảm ơn các thay cô đã giúp đỡ, hỗ trợ dé em có thẻ hoàn thành dé tai nghiên cửu nay,
Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình va các anh, chị, bạn trong khoa Hóa
đã truyền đạt kinh nghiệm và luôn ủng hộ, động viên tinh than em trong những lúc khó
khăn.
Một lần nữa xin cám ơn tat cả mọi người Kính chúc thay cô, tat cá bạn bẻ va gia đình
thật nhiều sức khỏe, luôn thành công trong công việc va cuộc sống.
Trân trọng.
Trang 4Mẫu mi Gấu Đỏ tôm chua cay
Chiểu cao peak
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu mi Wai Wai
Trang i
Trang 5Thông tin về các mẫu mi ăn liền khảo Sat o cccsecsssecsosseesssenseovenssnvesnnen 24
Sự phụ thuộc của thời gian lưu va điện tích peak sắc ký vào thành phan pha OIE 1641G21G00510000000001102200G0000300/20S83101(0GXA010i1á04G-xG6I4&6 27
Sự phụ thuộc của diện tích peak sắc ky vào nông độ acid oxalic 33
Độ lặp lại vẻ thời gian lưu của hệ thống HPLC với mẫu acid oxalic 35
Độ lap lại vẻ điện tích peak của hệ thong HPLC với mẫu acid oxalic 35
Ảnh hưởng của nồng độ HCI lên diện tích peak 555 - 36
Ảnh hưởng của thé tích HCI 3M lên diện tích peak 37 Ảnh hưởng của thời gian lắc mẫu lên diện tích peak - 38 Kết quả phân tích 5 mẫu mi ăn liễn (0525525202201 42
Trang ii
Trang 6DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNHHình 1.1 So đồ hệ thống HPLC, -222 2222 S2 +ECSzZcExecvsprvrzercrvrrrrs 10Hinh 1.2 So do thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải -c HHình l.3 Qua trình tách sắc ký của các chất 22222221 2222222222202202 1 HH
HìnhI4 Thồigianluutroqg HP ccc 2222602020006 13
Hình 1.5 Giản đồ vẻ sự tach hai peak sắc ky A vả B gi0/6)6464210/00262004(n6 15
Hinh 3.1 Sac ky đồ của acid oxalic khảo sat trong pha động - 2 27Hình 32 Sic ky đỗ của acid oxalic với nông độ HCI trong dung dich chuẩn 29
Hinh 33 Sắc ký đổ của acid oxalic với tốc độ pha động thay đôi - 32
Hình 34 Sac ky đồ của acid oxalic nông độ 0,108 ppm va mẫu tring 32Hinh 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của điện tích peak vào nòng độ acid oxalic 34
BA S47 NHÍ ceavessevsdedaseeeeaeseeeeoddvaeesseaaseseedreseseeoi 39
Hình37 Sắc ky đồ mẫu GT 6-2262 22252221 2213 2212 2121218120215 2221 c2 39Hình3§ Sắc ký đồ mẫu GC 2 40Hình 39 Sắc ký đồ mẫu BM 2-2-2212 9102312222112211 11 21511210212 2e tre 4I
Trang til
Trang 7Lẻ Phạm Phương Nam Khoa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC
8 5) | ".ườngg ro ra tr rrrtngty ae eggizzaosecossmsl 3
CH{NNGTI,, TH (QUÁ bu okeededdeidueueikearnoaeeenoecseooroi 4
lì: dkerdtoxalig? sop ics en a ee 4
ee 41.1.2 Tính chất vật lý và hóa hOC eccscssesseessseessnesesnesssseeesnnerssnassnennnnennncenns 4
| | | a s ẽ 1 1 1 4
1.2 Cac loại thực pham chứa acid oxalicl? 2s 222222222222722222727ZeZvvx re 5
1.3 Cae phương pháp phân tích acid oxalic 5 Soi 5
1.4 Cơ sở lý thuyết sắc ký lòng hiệu năng cao (HPLCJf!, 2-sccss 7
l4›š: (GIANG oi GcGU62GGG0XGi01562102cGAGGi(0ci36A22A546 7
VAD HB thang HPEC:sss2 t6 uácgiicticEicttcciecoNiiocsdiouel 7
1.4.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột - 525-552-5222 10
LAA C&đã lượng GB tGf6: «o.ese<ecoce-iecoiie-eeoiessseedoie 12
2.2.3 Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu mì ăn liễn 23
2.2.4 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả - 552-55s se, 25
CHƯỚNG) KÊTOUÁ-—-THÀO LUẬN: du cèaobỹneeoooecoeioeeeecroo 26
3Ì, Káosátđdiều ViệntDỀWN:¿222(02 222/002 62%2/622003620áu0 26
Trang 8Lẻ Pham Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp
3.1.1 Chọa cột và the tích vòng mẫu o ~ -<esgssee=eeee/ 26
3.1.2 Khao sát thành phan pha động 22-55 2502101300213212 c0 26
50 lụ, ĐẠO 4 ví ni co yee” ;[ ÍNENNNNRRaaAa 28
AEM dif: 7n Nm- 29
3.2 Xây dựng phương pháp định lượng - 5-52 S55 Sx se scererrre 31
3.2.1 Khảo sát LOD và LOQ của thiết bị 222255650 c5c<sc<ce 31322- Weleda: Me barodings tua len hth ois siesta ceca aaa neal 32
3.2.3 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 5265552555002 34
3.3 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu mì ăn liễn 2222 ©ccscccszccre 36
3.3.1 Khảo sát nỗng độ HCI cain sử dụng . -©225¿222222222222522 36332 KilosttffAtkbHCÍ<::cáccoacneeecekeotieEeaesiieesespoe 37
344 Khảø t0 1giài pH HẦU caxeoaesssssioie=eeoeenenoecess=eee 37
3.4 Định lượng acid oxalic trong một số mẫu mì ăn liễn 38CHƯƠNG4 KET LUẬN - DE NGHỊ, 5 5226611 43
Bilis, THIỆN G¡:ui20000002222010AGG00i14k204000806646Gx04661230ái40,2404L 43
À3: ĐỀ HH NsoicnceeoceceiaiieeditoodibibibkegdGiliasssititbseesasel 44
TÀI KIEU THẤM KHAO waa isc tea ce coe 45LYE Cc ARN aR ONE NER Se CO OO one reseed eee Te Seem Nr en 47
Trang 2
Trang 9Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
MO DAUAcid oxalic, với công thức phan tử là H:C:Oa, là một acid tương đối mạnh khá quenthuộc với chúng ta Trong công nghiệp vả cuộc sông, acid oxalic thường được sử dụng đểtẩy tring vai, làm sạch gỗ thé, loại bỏ gi sắt, Ngoài ra, acid nay còn được những người
nudi ong dùng dé diệt sâu bọ ký sinh trên thân ong!*),
Ngoài những công dụng vừa được nêu, acid oxalic lại có nhiều tác hại đối với sức khỏe con người Acid oxalic khi tiếp xúc với da và mắt sẽ gây hiện tượng rit, sung tay va
đau, nặng hơn có thể gây viêm mảng giác mạc Bên cạnh đó, nếu bị hắp thụ vào cơ thẻ, acid
oxalic sẽ gây nhiều ảnh hưởng không tốt đôi với hệ hô hap, gây nên các triệu chứng như ho
khan, khó thở, sưng phủ thanh quản Đặc biệt, acid oxalic làm kết tủa calcium trong máu
dưới dang calcium oxalate, là một trong những nguyên nhân chính gây nên bệnh sói thận.
Ở liêu cao, acid oxalic (muối oxalate) có kha năng gây ra ngộ độc cấp tính, có thẻ dẫn đến
tử vong với ham lượng 4-5gÍ*! Vào tháng 12/2013, Hội Y tế công cộng TP HCM đã đưa
ra kết luận: Hơn 20% mẫu thực phẩm tươi, 100% mẫu mi ăn liên chứa acid oxalic, với hàm
lượng tir 10 - 3000 ppm, gây nên sự lo ngại cho một bộ phận lớn người tiêu dùng!'®),
Hiện nay, trên thé giới đã cỏ không ít công trình nghiên cứu về xác định ham lượng acid oxalic trong các loại thực phẩm Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình
nghiên cứu ve lĩnh vực này Từ yêu cau thực tế đó, chúng tôi thực hiện dé tài “Nghién cứu
quy trình xác định hàm lượng acid oxalic trong một số loại mi ăn lién bằng phương phápsắc ký lỏng hiệu năng cao”
Trang 3
Trang 10Lẻ Pham Phương Nam Khóa luân tốt nghiệp
CHƯƠNG 1 TONG QUAN
1.1 Acid oxalic
1.1.1 Cấu tạo
Tên chung quốc tế: Acid Oxalic _
Công thức phan tử: C2H2O,.
Khoi lượng mol: M = 90,035 g/mol, 2
1.1.2 Tinh chat vật lý và hóa học
Tỷ trọng: 1,9 g/cm’.
Nhiệt độ phân hủy: 189,5°C
Độ tan trong nước: 14,2 g/100 mL nước
Acid oxalic là một chat không mùi, ton tại dưới đạng tình thê dang mau tring Nó tan
tot trong nude, ethanol, diethyl ether; không tan được trong benzene va ether dau hỏa.
Acid oxalic la một acid khá mạnh, nó phan ly 2 nac theo các cân bằng dưới đây:
H2C:04 HC:O¿ + H'; pKa: = 1,27
HO.0,s = C03 + H'; pK,2 = 4,27
1.1.3 Độc tính
Acid oxalic là một chất độc Hệ thống GHS đã đánh giá nó ở mức “Nguy hiểm” Khi
tiếp xúc với da và mắt, nó gây bỏng, rat, trường hợp nặng hơn có thé bị viêm màng giác
mạc hoặc bị mù Khi hap thụ vào cơ thé người với liều lượng thắp, acid oxalic cỏ thể gây
nhức đầu, nôn mitra, rồi loạn tim mach, làm giảm nhịp tim, hạ huyết dp Ở liều cao, acid
oxalic va muối oxalate có kha năng gây ra ngộ độc cắp tính, có thé dẫn đến tử vong vớihàm lượng 4-5g Liều ngộ độc (LDso) của acid oxalic nguyên chất được ước khoảng 378mg/kg thé trọng (khoáng 22,68 g/người 60 kg) Sự kết hợp của acid oxalic với calcium tạo
ra calcium oxalate, có thể gây kết tủa lắng đọng tạo thành sỏi ở các cơ quan tiết niệu, gan
mật, tụy
Trang 4
Trang 11Lẻ Pham Phương Nam Khóa luận tot nghiệp
1.2 Các loại thực phẩm chứa acid oxalic!!?!
Acid oxalic phân bỏ rộng rãi trong nhiều loại lương thực, thực phẩm dưới dang muối
oxalate tan trong nước của potassium, sodium va muối amonium oxalate; hoặc dưới dạng
calcium oxalate it tan Tùy theo hàm lượng oxalate, người ta chia thực phẩm thành 4 loại:
- Thực phẩm chứa acid oxalic với hàm lượng rất cao: các loại cám hạnh nhân, hạt mè
nguyên khô, rau đền, khế, cú cai đường, rau bina,
- Thực phâm chứa acid oxalic với hàm lượng cao: hạt điều, đậu phộng, khoai tây chiên
miếng, khoai lang, măng,
- Thực phẩm chứa acid oxalic ở mức trung bình: hạt đẻ, bơ đậu phông hạt óc chó, cà rot, khoai tây chiên cong, sốt cả chua,
- Thực phẩm chứa acid oxalic ở mức thấp: cơm dừa, hạt hướng dương, khoai tây nau
chin, bông cải xanh, bắp, dưa chuột,
1.3 Các phương pháp phân tích acid oxalic
Trước khi các phương pháp hiện đại như sắc ký, điện di mao quan, phd biến, acid
oxalic trong rau củ thường được xác định bằng phương pháp sau: tách acid oxalic tử thực
vật bằng HCI hoặc Na;CO; rồi chiết bằng ether vả kết tủa dưới dạng muối calcium oxalate,
sau đó hòa tan kết tủa bằng acid sulfuric loãng để được dung dịch acid oxalic Acid oxalic
được định lượng bằng một trong các phương pháp sau đây: chuẩn độ bằng dung dịch
KMnO; chuẩn; hoặc phương pháp tạo màu bằng cách chuyển hóa acid oxalic thành acid
glycolic rồi tạo dan xuất với 2,7-dihydroxynaphtalene-3,6-disulfonic acidt2lI9),
Năm 1981, tác gid Bo Libert đã xây dựng quy trình xác định ham lượng acid oxalic
trong cây đại hoàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, Diéu kién nghién
cứu: cột pha dao Cs (kích thước hạt: 10 xm); pha động là dung dich chứa 0,5% KH;PO; va
0,005M tetrabutyl amonium hydrogensulfate, đệm ở pH=2 bing acid H:PO¿; tốc độ dong:
2 mL/phút; detector UV-VIS với bước sóng là 220 nmi!Ì,
Năm 1985, dé xác định ham lượng các acid hữu cơ (bao gồm acid oxalic) trong khoai
tây, tác giả David H Picha sử dụng phương pháp sắc ký trao đôi cation, detector UV-VIS
Trang 5
Trang 12Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
đặt ở bước sóng 3 = 214 nm, pha động là dung dịch H:SO: 0,0008 N, Kết quả thu được
hàm lượng acid oxalic khá nhò (< 0,002%)!").
Sau đó, năm 1986, tac giả W Jeffrey Hurst và các cộng sự đã phân tích hàm lượng
acid oxalic trong hạt cocoa cũng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: sử
dung cột pha dao C¡s ở 24°C, detector điện hóa được cải dat ở 1,25V với AgCl là cực oxi
hóa, pha động la hồn hợp MeOH : nước theo tỷ lệ 1:1 chứa 1 mL dung dịch 25%
hexadecyltrimethylamonium chloride và 7,5g KH2POs, tốc độ pha động 2 mL/phut; với
khoảng tuyến tính của acid oxalic từ 0,5 ppm đến 50 ppmí'?Ì,
Năm 1996, Michael Trevakis vả cộng sự đã nghiên cửu quy trình định lượng acid
oxalic bằng phương pháp điện di mao quản, lấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
làm phương pháp đói chiếu Ca 2 phương pháp đều được sử dụng dé phan tích ham lượng
acid oxalic trong một số loại rau củ như đại hoàng, cà rốt, cú cải đường, ”!
Năm 2002, bằng cách ghép 2 cột loại trừ ion trong hệ thông sắc ký lỏng, tac giả Maria
Jesus Nozal cùng với các cộng sự đã xác định hàm lượng acid oxalic trong mật ong, với
pha động là dung dich H:PO¿ 1%, tốc độ dòng | mL/phút, nhiệt độ cột từ 40°C, detector
UV-VIS diode array Kết qua cho thay LOD và LOQ của acid oxalic lần lượt là 0,05 ppm
và 0,18 ppm; khoảng tuyến tinh rộng, từ 0,2 đến 500 ppm),
Violeta Nour và các cộng sự vào nam 2010 đã nghiên cứu quá trình phân tích
các acid hữu cơ có trong nước ép cam bằng phương pháp RP - HPLC Các tác giả
đã sử dung pha động lả dung dịch đệm của KH;PO: và H:PO, ở pH=2,8 với bước
sóng của detector diode array là 254 nm (đối với acid ascobic) và 214 nm (cho các
acid còn lại, bao gồm ca acid oxalic) và tốc độ pha động là 0,7 mL/phút Kết quả cho
thấy, thời gian lưu của acid oxalic là 4,122 phút và giới hạn phát hiện của nó là 0,1
mg/L!"*).
Trước đó, năm 2008, tac gia Miluscia Arnetoli cùng các cộng sự đã định lượng
acid oxalic cùng một số acid hữu cơ khác trong họ thực vật Silene paradoxa, sử dung
phương pháp HPLC, cot RP - 18, với pha động la dung dịch đệm pH = 2,5 của
KHI:PO; 125 mM và H;PO,, tốc độ 2 mÌ phút; detector UV-VIS được đặt ở bước
Trang 6
Trang 13Lẻ Pham Phương Nam Khóa luận tot nghiệp
sóng À = 210 nm; giới hạn phat hiện là 0.0106 mmol/L và sai số là S,3 % cho acid
oxalic!”Ỷ,
1.4 Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)!""!
1.4.1 Giới thiệu
Sắc ky là qua trình tách dựa trên sự phân bồ liên tục của các cấu tử chất phân tích lên
hai pha: một pha đứng yên, có khả nang hap thu chat phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lả pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với
pha tĩnh, chúng đi chuyên với tốc độ khác nhau va tách ra khỏi nhau
Sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc ký Kỹ thuật
phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc ký lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) va sắc ký lỏng
hiệu nang cao (HPLC),
Trong nhóm HPLC, tùy theo ban chất của quá trình sắc ký của pha tinh trong cột tách
ma người ta chia thành:
- Sắc ký phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau
- Sắc ky hap phụ pha thường (NP-HPLC)
- Sắc ky hap phụ pha đảo (RP-HPLC)
- Sắc ký trao đôi ion (IEX-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)
- Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)
1.4.2 Hệ thống HPLC
1.4.2.1 Bình đựng dung môi:
Hệ dung môi giải ly cột được rút ra từ các bình chứa dung môi Bình được làm bằng
chất liệu tro, thường là bang thủy tinh Binh luôn có nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào
trong binh Trong bình có một ông dan dung môi tir bình vào hệ thống sắc ký, ở đầu có gắn
ống lọc bang kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng dé giữ ống luôn ở dưới mặt
thoáng của chat lỏng.
Các hệ thống HPLC ngày nay thường cỏ 4 đường dung môi vao đầu bơm cao áp, cho
phép chúng ta sử dụng từ 1 đến 4 dung môi trong cùng một lẫn rửa giải theo tỷ lệ mong
Trang 7
Trang 14Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tot nghiệp
muốn Dung môi sử dụng cho HPLC có thẻ là nước, dung dịch đệm (pha trong nước),
metanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên.
Lưu ý:
- Tat cả dung môi sử dung cho HPLC đều phải là dung môi có độ tinh khiết cao, đạt
tiều chuẩn HPLC, không có lin bụi bắn Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khư không khí va có ghi rõ trên nhãn là dung môi dùng cho HPLC hay dung môi tinh
khiết phân tích.
- Tất cả hóa chat dùng dé pha mẫu và pha hệ đệm phải lả hóa chat tinh khiết phân tích.
1.4.2.2 Bộ khử khí:
Mục dich của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ con sót lại trong dung môi pha
động Nếu trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót lại bọt khí thi một số hiện
tượng sau đây sé xảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lay không đúng sẽ làm cho thời gian lưu
của peak thay đổi.
- Trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thé loại trừ hết được thi có thé bơm sẽ không hút được dung môi Khi đó, máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Trong bắt cứ trường hợp nào nêu trên cũng déu cho kết qua phân tích sai.
1.4.2.3 Bơm cao áp:
Mục đích để bơm pha động vao cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan
ra khỏi cột sắc ký Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 — 400 bar) để tạo ra được nhữngtốc độ nhất định của pha động qua cột tách phủ hợp cho quá trình sắc ký, phải có tốc độ
nằm trong vùng 0.5 - 3 mL/phit.
1.4.2.4 Van bơm mẫu:
Đề bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong
một quá trình sắc ký Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác định (20, 50
hay 100 uL) Van 6 chiều chỉ cỏ một vòng mẫu, nhưng van 10 chiều thi có 3 vòng mẫu.
Trang 8
Trang 15Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tot nghiệp
1.4.2.5 Cột tách:
Cột tách lả cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc kỷ Nó là một trong những yêu tô quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột tách có nhieu kích cỡ khác nhau, tủy thuộc vảo mức độ sắc ký Nói chung, cột tách phân tích thường có
kích thước chiều dải từ 10 - 25 cm, đường kính trong thưởng từ 2 - 5 mm
1.4.2.6 Bộ phận phát hiện chất phan tích:
Đây thường là các loại detector đựa theo các tính chat của chất phan tích Một số
detector thông dung như:
- Detector hap thụ quang phân tử vùng phổ UV-VIS.
- Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hap thụ nguyên tử (AAS).
~ Detector huỳnh quang phan tử.
~- Detector điện hóa (đo dong, cực phỏ, độ dẫn, điện lượng).
- Detector chiết suất
- Detector đo độ dẫn nhiệt (FID).
~ Detector diode phát quang vả diode mang.
- Detector phê khối lượng (GC-MS)
Tùy theo bản chất chất phân tích mả ta sẽ chọn detector phủ hợp để đạt được độ nhạy cao khi định tính cũng như định lượng chúng Trong các loại trên, detector hấp thụ quang phân tử vùng phô UV hay UV-VIS hiện nay được sử đụng phô biến nhất vì nó thích hợp
cho nhiều loại chất và không quá đắt
1.4.2.7 Bộ phận hiến thị kết quả:
Bộ phận hiển thị kết quả có nhiễu loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy
tự ghi (recorder) dé ghi tín hiệu đo đưới dạng các peak của các chat, rồi đến bộ tích phan
kể (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo dé xử lý kết quả và in kết quả
Đó là 5 bộ phận chính can thiết tối thiểu phải có của một hệ thong máy HPLC Những
hệ thong máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại ngày nay còn có thêm:
~ Bộ chương trình gradient dung môi (pha động).
- Bộ bom mẫu tự động va pha loãng mẫu.
Trang 9
Trang 16Lé Phạm Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp
- Bộ gia nhiệt và ôn định nhiệt cho cột tách sắc ký.
- Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC vả xử
lý kết quả tách, in kết quả tách,
Column
Detector
1.4.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Trong quá trình sắc ký, các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong
khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ đi chuyển trung bình của mỗi chất tan khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Khi ở trong pha động, phân tử chất tan địch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử
chất tan bị giữ lại Như vậy, sẽ cỏ một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột
sắc ký Vi vậy, trong quá trình sắc kỷ, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất ít bị lưu giữ.
Quyết định hiệu qua của sự tách sắc ký ở day là tổng các mối tương tác:
- Giữa chất phân tích va pha tinh (F:).
- Giữa chất phân tích và pha động (F2).
- Giữa pha tĩnh va pha động (E›).
Trang 10
Trang 17Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
Hình 1.2 Sơ đô thể hiện sự anh hưởng của các lực rửa giải
Tổng 3 tương tác nay sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước Đối với
mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F¡, F2, Fs Trong đó, F; và F2 giữa vai trò
quyết định, còn Fs là yếu tố ảnh hưởng không lớn, Ở đây, F\ là lực giữ chat phân tích trên
cột, F› là lực kéo chất phân tích ra khỏi cột của pha động Như vậy, với các chất khác nhau
thi F: và F2 khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác
nhau vả tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới).
Trang 11
Trang 18Lẻ Pham Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
1.4.4 Các đại lượng đặc trưng
1.4.4.1 Thời gian lưu:
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký, sẽ bị lưu giữ
ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Thời gian lưu là thời gian tính
từ lúc bắt dau bơm mẫu vảo cột cho tới khi peak dat giá trị cực đại Như vậy, néu gọi tai là
thời gian lưu tong cộng của chat tan ¡ thi ta luôn có:
tạ, = (to + tri ) (1.1)
Trong đó:
© tạ là thời gian không lưu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha động).
© tụ lả thời gian lưu giữ thực của chất tan | ở trong cột sắc ký (thời gian lưu hiệu
chinh).
Nếu to = Ø thi ta sẽ cỏ tạ, = tụ Trường hợp nảy chỉ có khi tạ, rất nhỏ (thường là khi
tạ, nhỏ hơn 4 phút).
Giá trị ti của một chất trong quá trình sắc ký là phụ thuộc vao nhiều yếu tố như:
- Ban chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước hạt, độ xốp, cấu trúc xốp.
- Bản chất, thành phân, tốc độ pha động
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chat tan, các nhóm thé
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào cả pH của pha động nồng độ chất tạo
phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc
ký.
Giá trị thời gian lưu t'ạ¡ có ý nghĩa rat lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký Vì nó cho
ta biết các chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trongcác điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn Đồng thời dé cũng là đại lượng để chúng
ta phát hiện định tỉnh một chất
Trang 12
Trang 19Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tổt nghiệp
(t)a
Hình 1.4 Thời gian lưu trong HPLC
1.4.4.2 Hệ số phân bố
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phan bố của chất tan giữa pha
động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc ký Sự phân bố này được đặc trưng bởimột đại lượng gọi là hệ số phân bế K; của chất ¡ Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng
độ của chất tan | trong pha tĩnh vả pha động và nó được tính theo công thức sau:
Trong đó, C,„ và C_ là nồng độ chất tan | trong pha tinh va pha động
Hệ số Kj cho ta biết khả năng phân bố của chất I như thế nào trong mỗi pha (pha động
Trang 20Lẻ Pham Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp
k, = K,.— (1.4)
1.4.4.4 Hệ số tach a
Hệ số tach ứ (hay còn gọi 1a thời gian lưu tương đối giữa hai chat A va B) là đại lượng
đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sic ky Nó phụ thuộc vào hệ số phân bỏ
va là tỷ số cúa hệ số phân bé của hai chất.
Pin ni (1.5)
K, &, tạ,
Điều kiện cần thiết để hai chat A và B tách khỏi nhau là a £ 1
1.4.4.5 Độ phân giải R
Độ phân giải nói lên mức độ tách các cầu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký Hai
cầu tứ A vả B được tách khỏi nhau cảng triệt dé khi độ phân giải cảng cao Độ phân giải
được tỉnh theo công thức sau:
t„ ~=í
Nếu R cảng lớn thì hai chất A vả B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có
; một đoạn đường nên nằm ngang theo trục hoành của biểu dé sắc ký Song nếu đoạn đường
nên này dai quá thì cũng không cần thiết Vì như thé ta tốn nhiều dung môi (pha động) để
rửa giải các chất hơn Do đó giá trị R chỉ vừa đủ dé tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là
tốt Nghĩa là chi cần hai peak vừa tách ra khỏi han nhau dứt khoát la được.
R„=2
Trang 14
Trang 21Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
R
detector’s res
time
(a) (b) (c)
Hình 1.5 Giản đồ về sự tách hai peak sắc kỷ A và B
(a) Tôi thiểu dé có sự tách
(b) Đủ dé hai chất tách khỏi nhau.
(c) Hai chất tách xa han nhau
1.4.S Các bước tiến hành sắc ký
1.4.5.1 Chuan bị dụng cy và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để đảm bảo máy hoạt động tốt, chokết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, năng lượngđèn UV, đúng theo yêu cầu thông số máy do của nha sản xuất đặt ra
Đặc biệt, cột sắc ký phải được kiểm tra vé số dia lý thuyết theo định kỳ hay khi có
nghỉ ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký
Ví dụ: Sắc ky pha thường NP-HPLC: rửa bằng methanol, không rửa bằng nước
Sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động cỏ các loại muối thì phải rửabằng hỗn hợp ACN (hoặc methanol) vả nước, tỷ lệ 50:50 để sạch hết các chất còn đọng lại
trong cột, đồng thời bảo vệ cột không bị mốc khi dé lâu
1.4.5.2 Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho sắc ky là loại tinh khiết dành cho HPLC Các hóa chat can
dùng khác phải là loại tinh khiết dang cho phan tích Pha dung môi chính xác theo đúng ty
Trang 15
Trang 22Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
lệ đã nêu, dé ôn định dung môi đúng thời gian theo chuyền luận đã yêu cau Lọc dung môi
qua mang lọc 0,2 - 0,45 pm.
1.4.5.3 Chuan bj mau do HPLC
Mẫu thir: xử ly mẫu theo quy trình đúng với các nguyên tắc sau:
- Dung môi hòa tan chất phân tích phải hòa tan trong pha động trong nhiều trường
hợp ding dung môi pha động dé hòa tan mẫu.
- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách
lọc hoặc chiết.
- Phải lọc va ly tâm, lọc mẫu qua mang lọc 0,2 - 0,45 ym.
- Nong độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khá năng tách của cột, tránh gay
nghẽn cột.
Mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thir trong cùng dung môi, riêng
về nòng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, Ngoài ra, có thé dùng nồng độ
khác, nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính của từng thành phản
1.4.5.4 Cách vận hành thiết bị
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau, tùy thuộc vào hằng sản xuất, phần mém điềukhiển hệ thống HPLC Tuy vậy, cách vận hành phải luôn tuân theo nguyên tắc sau:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn
trước khi cho vào cột.
- Dat đầy đủ các điều kiện sắc ký như: cấu hình máy, tỷ lệ các dung môi pha động,bước sóng, thành phan mẫu, các thông số của quá trình sắc ky yêu cầu
Trang 16
Trang 23Lé Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
CHUONG 2 THUC NGHIỆM
Bảng 2.2 Danh mục các loại hóa chất khác dùng trong dé tai nghiên cứu
Ri sin at [Tide hun | Hân ưng nguyên trang)
Trang 24Lê Phạm Phương Nam Khéa luận tót nghiệp
Trang 25Lê Phạm Phương Nam Khoa luận tỏt nghiệp
Giây lọc 045 | Membrane Filter
UV/VIS Perkin Elmer 101N7062504
May loc nude
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thẻ thay đổi được thẻ tích
bom mẫu vảo cột Tuy nhiên yếu tố nay cũng góp phan lam chân peak sắc kỷ bị giản ra
Trang 19
Trưởng Đại-Học Su-Pham
| THU VIỆN `
| TP HỒ-CHÍ-MINH |
Trang 26Lé Phạm Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp
Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vảo cột quá lớn thì hiện tượng giãn peak xảy ra
cảng lớn gây ra sự chen lắn peak trong quá trình tách
Lượng mẫu được xác định bằng thẻ tích vòng chứa mẫu ma ta lựa chọn Với thẻ tíchmẫu nhỏ hơn thé tích mẫu tới hạn Vp thì khi bơm mẫu vảo cột tách chiều cao hay điện tíchcủa peak sé tăng tuyến tính Đến giới hạn V„¡¿ = Vo mà tiếp tục tăng thé tích mẫu thì chiều
cao peak sắc ký cũng không tăng nữa và lúc đó peak sắc ký sé tù, giãn chân và không sắc
nét Vì vậy việc lựa chọn thẻ tích vòng mẫu cũng rat quan trong.
Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thé tích cảng nhỏ càng tốt
dé tạo nên peak có độ sắc nét cao, tránh giãn peak Trong phân tích HPLC người ta thường
sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 pL, trong đó vòng mẫu 20 pL thường hay được
sử dụng nhất Trong dé tài nghiên cứu này dé phan tích ham lượng acid oxalic chúng tôilựa chọn van bơm mẫu 6 chiều va thé tích vòng mẫu là 20 pL
2.2.1.2 Chọn cột
Acid oxalic là một chất hữu cơ phân cực, vi vậy chúng ta có nhiều lựa chọn cho loại
cột phân tích Dựa theo một số tải liệu tham khảo, cùng với điều kiện có sẵn của phòng thí
nghiệm, chủng tôi quyết định chọn loại cột pha dao RP - HPLC Hiện nay trên thị trường
cỏ nhiều hãng sản xuất cột pha đảo Cs và Cis, Hiện nay, phòng thí nghiệm chúng tôi
_ được trang bị cột ZORBAX Eclipse XDB-C18 của hãng Agilent Vì vậy, chúng tôi sử dụng
cột ZORBAX Eclipse XDB-C18, với kích thước hạt 5 ym; kích thước cột 250 x 4,6 mm cho phép định lượng này.
2.2.1.3 Khảo sát thành phần pha động
Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải
các chất mẫu ra khỏi cột Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho
quá trình sắc ký Khi tỷ lệ thành phan pha động thay đôi thi lực rửa giải của dung môi phađộng thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thayđổi hệ số lưu của chat phân tích đó
Trang 20
Trang 27Lê Pham Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
2.2.1.4 Khảo sát anh hưởng của HCI
Trong thực phẩm, acid oxalic cỏ thé tôn tại ở cả dạng phân tử (acid oxalic) hoặc dạng mudi oxalate Vì vậy, dé dam bảo chiết hoàn toản lượng acid oxalic trong mẫu thực phẩm
phân tích, ta phải sử dụng một acid mạnh như HCI, H:SO¿, Trong dé tài nghiên cửu này,
chúng tỏi chọn su dung acid chlorhydric, vi vậy việc khảo sát ảnh hướng của HCI lên peak
sắc ký là một điều tất yếu
Nông độ của HCI có anh hưởng trực tiếp đến pH của dung dịch mẫu, quyết định dạng tôn tại chỉnh của acid oxalic (H›C›zO¿, HC:Ox hay C¿O¿È") Nông độ HC! quá nhỏ sẽ dẫn
đến các dang của acid oxalic sẽ tồn tại song song, có thé gây hiện tượng tách peak, dẫn đến
sai số lớn Mặt khác, nếu nông độ HCI quá lớn, dẫn đến pH quá nhỏ, ngoài khả năng chịu đựng cột sẽ làm hỏng cột gây sai số phân tích Dé khảo sát ảnh hưởng của HCl, ta tiền hành chạy sắc ký với các điều kiện sau:
Tốc độ pha động là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn lên quá trình sắc ky vi
nó ảnh hưởng lên quá trình thiết lặp cân bằng giữa pha tĩnh và pha động của chất tan Tốc
độ dòng quá nhỏ sé gây hiện tượng giãn peak, tốn nhiều thời gian rửa giải và dung môi.Tuy nhiên, nếu tốc độ dòng qua lớn sẽ làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi
nhau hoan toản, gây ra hiện tượng chong chéo peak lên nhau Vì vậy, can phải khảo sát để
tim ra tốc độ dòng phủ hợp với hệ phân tích.
Trang 21
Trang 28Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
Đề khảo sat ảnh hưởng của tốc độ pha động tiến hanh khảo sat sự thay đôi chiều caopic sắc ky theo bước sóng của detector với điều kiện chạy sắc ký:
-Detector: UV-VIS, bước sóng 220 nm,
-Pha động: pha động đã khảo sat ở 2.2 | 3.
Tổng kết các điều kiện đã khảo sat suy ra điều kiện tối ưu dé phân tích ham lượng
acid oxalic.
2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng acid oxalic trong mì ăn liền
2.2.2.1 Xác định LOD và LOQ
Trong một quy trình phân tích bắt ky, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ) là 2 thông số quan trọng
Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn chotin hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nén
Giới hạn định lượng được xem như nồng độ thắp nhất của chất phân tích ma hệ thống
phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu
trắng hay tín hiệu nền Thông thường, LOQ được tính như sau:
Dé xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành pha loãng từ 5 - 7 lần mẫu chuẩnchứa acid oxalic nông độ 0.9 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng sau đó tiêm vao thiết bị
HPLC và phí lại kết quả Sắc ky đồ nào thé hiện chiều cao peak gap 3 lần đường nền thi
nông độ mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị.
Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ = 10/3 LOD (2.1)
Trang 22
Trang 29Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tót nghiệp
2.2.2.2 Xác định khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phản tích Một chất chỉ
có thé định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nông độ của chatphân tích nằm trong khoảng tuyén tính
Dé khảo sát khoảng tuyến tinh giữa nồng độ của acid oxalic vả điện tích peak sắc ký,
ta lan lượt pha các dung địch chuẩn có nồng độ tang dân trong dung môi pha động Sau đó
tiêm vao hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.2.1, ghi giá trị diện
tích peak va ding phan mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng phương trình hỏi quy mỗi
quan hệ giữa nông độ C vả điện tích peak Speak.
2.2.2.3 Khao sát độ lặp lại của phép do
Một phương pháp phân tích tốt, ngoài yêu cầu vẻ độ đúng của phương pháp, người tacòn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sat
bang cách tiêm lặp 7 lần cùng một mẫu chuẩn acid oxalic (có nông độ nằm trong khoảngtuyến tính) vào hệ thống sắc ký với diéu kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.2.1 Kết quả
được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tụ.
2.2.3 Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu mì ăn liền
2.2.3.1 Xử lý mẫu
Mẫu mi an liền được tiến hành khảo sat theo quy trình sau:
- Nghién mịn mẫu mi ăn liền bằng chén sứ, trộn déu, sau đó cân chính xác 0,500 g
mẫu va ghi lại kết quả cân
- Cho 0,5 (g) vào bình tam giác có chứa 10mL dung dich HCI 3M Lắc trong 20 phút.Lọc tách phần cặn không tan và phần dung dịch
- Rửa phan cặn không tan bằng 10mL nước siêu sạch, thu cả 2 phan dịch lọc Dung
dịch thu được có mau nâu nhạt.
- Lọc phan dich lọc thu được bằng mang lọc 0,45 ym, thu lay phản dich lọc màu vàng
nhạt sau cùng.
Trang 23
Trang 30Lễ Pham Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp
- Cho toàn bộ phan dịch lọc thu được vào bình định mức 50 mL, định mức bang nước
siêu sạch.
- Hút 5 mL dung dich mẫu vừa pha loãng cho vào bình định mức 25 mL, định mức
bằng nước siêu sạch.
- Tiến hành tiêm lặp 3 lần các dung địch mẫu sau khi pha loãng vào hệ thong HPLC
và ghi lại kết quả Dựa vao phương trình hỏi quy tỉnh nông độ của chất phân tích.
2.2.3.2 Phân tích định lượng mẫu mì ăn liền
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại mi ăn liên, va hau hết các loại mì ăn liền đều
cỏ chứa acid oxalic trong thanh phản Trong dé tải nghiên cứu này chúng tôi tiền hành khảosát ham lượng acid oxalic trong $ mẫu mi ãn lién như trong bảng 2 4 sau đây:
ng: 2.4 Thông tin về các mẫu mì ăn liền khảo sat
Nhãn hiệu mi ăn lien Nha san xuat
Hao Hao tém chua cay cay VINA ACECOOK 20/8/2015 |
Công ty cô phan thực
Gấu Đỏ tôm chua cay gưyep F
chua cay UNIBEN
: Thai Preserved Food
Mi chay Wai Wai ;
Factory (Thai Lan)
Ap dụng quy trình xử lý mau ở mục 2.2.3.1, lây phan dung dich lọc cudi cùng, cho
vào bình định mức SØmL, định mức đến vạch bằng nước siêu sạch Hút chính xác 5 mL dung dich mẫu vừa pha, cho vào bình định mức 25mL, định mức đến vạch bằng nước siêu
sạch
Tién hành tiêm lặp 3 lần các mẫu HH, GT, GC, BM va WW vao hệ thông HPLC vaghi lại kết quả Dựa vào phương trình hỏi quy tính néng độ của chất phân tích
Trang 24
Trang 31Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp
2.2.4 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một diéu kiện sắc ky đã chọn, thời gian lưu của chất
là đại lượng đẻ định tính (phát hiện) Còn chiêu cao vả điện tích peak sắc ký có liên quanchặt chẽ đến nòng độ của chất Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, chúng ta
có mối quan hệ tuyến tính như sau:
H, = ki C= fC) (2.2)
S, =k: C= g(C) (2.3)
Trong do:
H va S; lần lượt là chiều cao và điện tích peak sắc ky của cấu tử i
C, là néng độ của cầu tứ i với thời gian lưu ti
ki, k› là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũngnhư bản chất pha tĩnh
Dựa vào (2.2) va (2.3), ta có thé xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp
đường chuẩn hoặc thêm chuẩn
Các sé liệu thực nghiệm được xứ lý bằng phương pháp thống kê toán học với các đặc