Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu trích ly các hợp chất sinh học từ trái nhàu bằng enzyme có tiền xử lý sóng siêu âm

Ngoài ra, các chỉ tiêu màu sắc, khối lượng, Brix, và pH củatrái nhàu cũng thay đổi đáng ké sau thời gian bao quản.Qua nghiên cứu và khảo sát điều kiện trích ly các hợp chất sinh học tron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

+ % % % % % % Xứ X% kớc

NGUYEN HO NGỌC DIEM

NGHIEN CUU TRICH LY CAC HOP CHAT SINH HOC

TU TRAI NHAU BANG ENZYME CO TIEN XU LY

SÓNG SIÊU AM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Thành phó Hồ Chí Minh, Tháng 11/2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

% % %%% % % % % % %% %É% %%%%%%X

NGUYEN HO NGỌC DIEM

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY CÁC HỢP CHAT SINH HOC

TỪ TRAI NHAU BANG ENZYME CÓ TIEN XU LÝ

PGS TS KHA CHAN TUYEN

Thành phó Hồ Chi Minh, Thang 11/2022

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY CÁC HỢP CHÁT SINH HỌC

TỪ TRÁI NHÀU BANG ENZYME CÓ TIEN XỬ LÝ

Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh

TS NGUYEN HUYNH BACH SƠN LONGTrường Dai học Công nghệ cao Đồng An

PGS.TS PHAN TAI HUAN

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Quá trình công tác: từ năm 2017-2022 công tác tại Hội Doanh nghiệp Hàng

Việt Nam Chất lượng cao Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 10 năm 2019 theo học Cao học ngành Công nghệ thực phẩm tạitrường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: 40/13, đường 27, Phường Son Ky, Quận Tân Phú, Thànhphố Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0938 024 363

Email: ngocdiemnh94(@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bồ trong luận văn này là trung thực và là một phầntrong nghiên cứu do PGS TS Kha Chan Tuyền, giảng viên khoa Công nghệ thựcphẩm va Hóa học làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn được phép công bố

với sự đông ý của chủ nhiệm đê tải.

Học viên ký tên

Nguyễn Hồ Ngọc Diễm

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Kha Chấn Tuyền, những người đã tận tìnhchỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện dé tài, xin gởi đến Thầy lòng kính trọng và sự biết

ơn sâu sắc nhất

Trong suốt quá trình học tập tại Khoa Công Nghệ Hoá học và Thực Phẩm,tôi đã nhận được sự dạy dỗ tận tình của các Thầy Cô trong Khoa, Thay Cô đã giúptôi có được những kiến thức quý báu không những trong việc thực hiện đề tài màcòn trong cuộc sống sau này Tôi vô cùng biết ơn vì những kiến thức và những điềutốt đẹp mà Thầy Cô đã dạy

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè của tôi, những người đã luôn độngviên, chia sẻ những khó khăn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua Tôi thật sự

biêt ơn các bạn.

thiện với môi trường Chính vì những lí do đó, đề tài “Nghiên cứu trích ly các hợp

chất sinh học từ trái nhàu bằng enzyme có tiền xử lý sóng siêu âm” được thực hiện

từ tháng 12 năm 2020 đến tháng 06 năm 2022 tại phòng thí nghiệm của Khoa CôngNghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

Đầu tiên, trái nhàu được khảo sát để chọn ra độ chín thích hợp nhằm thuđược hàm lượng các hoạt chất sinh học là cao nhất Tại các độ chín khác nhau sauthu hoạch (chín 1/3 trái, chín 2/3 trái và chín hoàn toàn), trái được lay mẫu phantích hàm lượng các hợp chất sinh học (flavonoid, polyphenol, triterpenoid và axítascorbic) Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng các hợp chất sinh học đạt đượccao nhất khi trái nhàu đạt độ chín hoàn toàn, xu hướng tăng dần khi chuyên từ giaiđoạn xanh sang màu trắng cứng và giảm dần khi quả càng chín Từ kết quả nghiêncứu trên cho thấy chọn trái nhàu có độ chín hoàn toàn (trái cứng, màu trắng ngà, thuhoạch khoảng 110 -115 ngày kế từ khi ra hoa) cho hàm lượng các hoạt chất sinh họcđạt gia tri cao nhất.

Khi đã chọn ra được độ chín thích hợp dé thu hoạch, tiếp tục thí nghiệm khảosát thời gian bảo quản trái từ ngày đầu tiên đến hết ngày thứ 7 (cho đến khi trái

hỏng) Theo quan sát từ thí nghiệm trước, khi qua giai đoạn chín hoàn toàn, trái

nhàu sẽ trở nên nhũn, biên đôi về màu sắc, trạng thái cũng như hàm lượng các hoạt

chat sinh học sẽ bị giảm đáng kể trong thời gian rất ngắn (1-2 ngày) Vì thé, dé đánhgiá sự thay đổi về hàm lượng các chất dinh dưỡng trái nhàu được thu hoạch ở độchín 2/3 trái Trái nhàu được lấy mẫu phân tích hàm lượng các hợp chất sinh học(flavonoid, polyphenol, triterpenoid và axit ascorbic) và các chỉ tiêu hoá lý (mausắc, độ âm, khối lượng qua) Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy, trái nhàu nên thuhoạch ở thời điểm trái chín 2/3 bề mặt và bảo quản trong thời gian khoảng 3 ngàyhoặc thu hoạch khi trái chín hoàn toàn (màu trắng ngà) để có hàm lượng các hợpchất sinh học cao nhất Ngoài ra, các chỉ tiêu màu sắc, khối lượng, Brix, và pH củatrái nhàu cũng thay đổi đáng ké sau thời gian bao quản.

Qua nghiên cứu và khảo sát điều kiện trích ly các hợp chất sinh học trong tráinhàu bằng enzyme sau khi tiền xử lí siêu âm được ghi nhận là tỉ lệ nước/ bột nhàu16/1 (ml/g), điều kiện xử lí siêu âm được có định 6 50°C trong 10 phút với tần số 37kHz, điều kiện trích ly tôi ưu là nồng độ enzyme 1%, nhiệt độ ủ 60°C và thời gian ủ

51 phút Với điều kiện tối ưu này, hàm lượng TPC, TFC, TSC và vitamin C caonhất trong dịch trích (tính theo vck) lần lượt là 13,29 + 0,31 mg GAE/g, 8,40 + 0,08

mg QE/g, 63,19 + 1,66 mg AE/ g, và 1,16 + 0,15 mg AA/ g Dé đánh giá hiệu quacủa phương pháp trích ly bằng enzyme có tiền xử lý siêu âm so sánh với phươngpháp trích ly bang dung môi ethanol, có thé thay rằng hiệu qua thu hồi các hợp chất

từ phương pháp nghiên cứu khi trích ly bang enzyme so với dung môi cồn đạt trên50% Qua đó có thê thấy, việc ứng dụng siêu âm - enzyme kết hợp trong trích lynguyên liệu thực vật nói chung và trái nhàu nói riêng cho thấy hiệu quả đáng ké.Phương pháp này có thé được cân nhắc là một giải pháp thay thé thân thiện với môitrường thay vì sử dụng dung môi hữu cơ độc hại, tốn kém

Noni fruit (Vorinda Citrifolia L.) is gaining more and more attention because of its health benefits Previous studies have found more than 200 bioactive

compounds in Noni including acids, alcohols, phenols, saccharides, anthraquinones,

carotenoids, esters, triterpenoids, flavonoids, glycosides, lactones, iridoids, ketones, lignans, nucleosides, triterpenides, sterols, and aromatic compounds Research on the extraction of these compounds for application as a natural source of antioxidants and antibacterial agents has great potential in the future Currently, the trend of extraction by "green" methods is increasing due to its advantages such as high extraction efficiency, short time, safety, non-toxicity, and environmental friendliness For these reasons, the "Research on the extraction of biological compounds from ultrasonic pre-treated noni fruit by enzymes" was conducted from December 2020 to June 2022 at the laboratory of the Faculty of Chemical

Engineering Science and Technology, Nong Lam University, Ho Chi Minh City.

First, noni fruit was surveyed to select the appropriate ripeness in order to

obtain the highest content of biologically active substances At different ripen stages after harvest (ripe 1/3 fruit, ripe 2/3 fruit, and fully ripe), the content of biological compounds (flavonoids, polyphenols, triterpenoids and ascorbic acid) was determined The results showed that the content of biological compounds was highest when noni fruit reached full maturity, tending to increase gradually from

green to hard white and to decrease as the fruit matured From the above results, the

fully ripe noni fruit (hard, ivory white fruit, harvested about 110 -115 days after flowering) was selected for further research due to the highest content of

biologically active substances.

After determining the appropriate ripeness, the fruits were stored and investigated at ambient temperature for up to 7 days As observed from the previous experiment, when the noni fruit was fully ripe, 1t became soft, and change in color,

appearance as well as the content of biologically active substances were

significantly reduced in a very short time (1-2 days) Therefore, to evaluate the change in the content of nutrients, noni fruit was harvested at 2/3 ripeness Noni fruits were sampled to analyze the content of biological compounds (flavonoids, polyphenols, triterpenoids, and ascorbic acid) and physicochemical parameters (color, moisture, fruit weight) The results indicated that noni fruit should be

harvested at the time of ripening 2/3 on the surface and stored for about 3 days, or

harvested when the fruit was fully ripe (ivory white) to obtain the highest content of biological compounds Similarly, other parameters such as color, weight, Brix, and

pH were also changed significantly during storage times.

For the extraction conditions of biological compounds from ultrasound

pre-treated noni fruit using enzymes, the ratio of water to noni powder of 16/1 (ml/g), the temperature of 50°C for 10 minutes, and the frequency of 37kHz were fixed The results showed that the optimal extraction conditions were found to be and

enzyme concentration of 1%, atemperature of 60°C, and an incubation time of 51

minutes Under those optimal conditions, the highest content of TPC, TFC, TSC and vitamin C in the extract (in dm) were 13.29 + 0.31 mg GAE/g; 8.40 + 0.08 mg

QE/g; 63.19 + 1.66 mg AE/g, and 1.16 + 0.15 mg AA/g, respectively To evaluate

the efficiency of the enzyme extraction method with ultrasonic pretreatment

compared with the extraction method with ethanol solvent, it can be found that the

efficiency of compounds recovered from the research method when extracted using

compared with alcohol solvent reached over 50% efficiency Thereby, it can be seen that the application of enzymes for extracting biological compounds in ultrasound pre-treated noni fruits is strongly recommended This method can be considered an

environmentally friendly alternative to the use of expensive and toxic organic

solvents.

XUẤT BẢN

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xuất bản trong tạp chí thuộc danh mụcHội đồng chức danh giáo sư nhà nước

Ho, T T H., Nguyen, D H.N., Nguyen, C T., & Kha, T (2022).

Aqueous Enzymatic Extraction Conditions of Bioactive Compounds from

Ultrasound Pretreated Noni (Morinda Citrifolia L.) Extract Journal of Technical Education Science, (70B), 102-115.

https://do1.org/10.54644/jte.70B.2022.1188

MỤC LỤC

Trang I0 1

Ly iGO a TH ciisssesensansnsigi 01811116 80)1810g 218933 g38q03104833038E0LE4S3ES3SGE8 G0 33 GiS8U/23962G16 00805 501288600E 1

IUNv-ui 0i 0 11

TO CA TTI cues orc cersers tiulbl TiricliGRRGGRERGNgìtdlbgi cas esa vacate aaa a decade snares aac 1V

SEE seen cnn cone eaten ceca ix

0101901 +2 xTĩaihudbdrrifrsfHETEssascasgantoeteiinoitogisogrG0.00/001GG040400gI00800G300/9E0G800g0600.0800g80 xiii

Danh GACH các ĐẤHỮceccsessssybi0E4143365355556033385gE093405308509945398.098sdbs3ildãggps4SS4380:483nG/480620u 06 XIV

Diath SACHA C HÌHÍH csiiEiiiekiiaiadkesaguasollnldoilidllkkesslecuiroaidddooeulHzuie XVI

790.06) .Ô 1Chương TÙNG OUAT seaagaqaaadrntditttoiGSiiotGG8GG 500G355010189/8000169.468tgagusu 41.1 Tổng quan về cây nhàu 2-22 22222EE2EE+2E22EE22E22EE22E22EE2232232221222222xe 41.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của gây TH neeneeeseensdeieennoeossstesossd 4lLI.2 Quá tình: th Hoạch: và Xứ LY tIẤU che 211 ck a8, ag0exessdEd 61.1.3 Thanh phần các hoạt chat sinh học trong trái nhàu - 22-2 2255252522 61.1.4 Một số nghiên cứu về công dụng của trái nhàu 22525525255252z5s2 91.2 Tổng quan về các phương pháp trích ly -¿2255z22+22++2z+zz+z£zzzxsr+z 121.2.1 Trích ly bằng phương pháp truyền thống 2 2¿222+2z+2Ez+EE+2zz+zzzex 13

1.2.2 Trích ly với sự hỗ trợ của enzyme + 5- 5s cs+secrrrerrrrrkerxrrerkerkee 151.2.3 Trích ly với sự hé trợ của sóng siêu âm : - ¿2+2 22+z22++xzzzxzxc+2 16

1.2.4 Trích ly kết hợp giữa enzyme và sóng siêu âm - 2-22-2272: 181.2.5 Một số phương pháp trích ly khác 2-22 2 2¿22z22s+2z222+z2zzzzzz>+2 191.3 Các nghiên cứu trên thé giới và Việt Nam có liên quan đến đề tài 201.3.1 Các nghiên cứu trên thé giới 2 2¿222+2++2E22EE2EE+2E22EE+2E222E22Ezz2zzrxez 20

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Na1m 2+ 22+ 22t ++E+E+EzEESrrrrrrrrrrrrrrrrrrrri 21

Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 232.1 Thời gian và địa điỂm - 2: 2-©2+222222222122122112212112212211211221211211 21 2E re 23Dds, NỘI UTTĐS0sx6sc05515315214826.01G38 nn 188g5g350104853008u/Gg HSLE HQ N8g2SLSSSSHBEIG-SEESSIAGIGG3L:1E8058E1-G3860 2008 232.3 Thiết bi và nguyên vật liệu sử dụng - 2: 222+2S22E22E22E22121212121 2 2e 23

2.5 2 IN SUVCN Vet MCU susssseebiaorsrntbiitibdldtgiesEbBi03051G3.5330A300151536810151G3130404GNQ1.BS4SS8398033/800068086 24

SS | EoaasuenetgiodiliEtvigiiodGriftQfitiStESGG0NNGigGồiNEfittitGiif0kiĐ8d8N000gguas 242.4, Phuong phap nghiễn CU Uisccessesnsessssesee sem aremenaeneenenseeeee ee 252.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ chín sau thu hoạch đến hàm lượng các hoạt

chất sinh học trong trái nhâu -.-2 2+cs< 2z cceczzze.errersrcrrrrrrrrcrxoe 252.4.2 Nghiên cứu điều kiện trích ly các hợp chat sinh học bang enzyme với tiền

BOUL LÝ STG ANN srcbszg:ies6ierioii065030GIS8S1028g0E8XE0009:gi4G/00/đI822Zi20AGiS9E3i00i202E8iGữ83G023201028B//đg2350 27 2.4.3 Phương pháp phần BÍGH;:z.sscssssscesssvssotsss5666313551563816358 6365566398856 69956 95011388853383E 33Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN °-2-s<©s<©cccsecssezse+s 363.1 Ảnh hưởng của độ chín thu hoạch đến hàm lượng các hoạt chất sinh học

tựiE trải TNA :seecnesaenaentaGiA06646150680 338 0xEh3iS4SEGS8SVGVESSSESISESSHGESSSIAHSSSSEEESHSESEEEISSER 363.2 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng các hoạt chất sinh học

trong trải HằU::::‹zessssscscccs555353522531186312151165006414555961455555804660960 01361000040186000403844818 383.3 Điều kiện trích ly các hợp chất sinh học bằng enzyme cĩ tiền xử lý siêu âm 403.3.1.Loai enzym thich hop cece 403.3.2 Anh hưởng của xử lý siêu âm đến hiệu quả trích ly . - 413.3.3 Ty Tế dung mỗi thich: HỢDieeseecaisseseossaessiibsdeSitbg4d0St23084030.2013595:2802x8:300000i8:3ãa02Mpsci 43 S34 LÍ lệ enzvin thích HỢIssssxoeesssssnssseksebokiotbrriieidiiisss1161012485556443390561359063860368836632 453.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ enzyme đến quá trình trích ly các hợp chất sinh

HOG WONG ALTA s:-sssz1i20x:55245429555138e184A56-395u80283/8-0g8<uy84ã0gE).0i32e16u0s.611.đ0856 4,Sg0.48a.3đ 47

3.3.6 Xác định tHời Pian thuỷ Phan sácccsicnseisssotisiesssslá5114466025534051335036335903 833880580 493-3-7, TÚi mạ húa điền kiện ih ÌY»xce-conusetsentsonkGiEGinnibsBicklugtenogkisd.t7L556)0000350)20013230 50

3.3.8 So sánh hiệu quả trích ly của phương pháp trích ly bằng dung môi nước

với sự hỗ trợ của siêu âm và enzyme so với phương pháp trích ly bang

CANO, sssssssczz51701140816604/1338L4AEREMG+S6E405130-00304L8G0GWSEME\iSGS38N8X⁄4LDSE98g2hGHG008u/3.G088 REE 603.4 Quy trình công nghệ trích ly trích ly các hợp chat sinh hoe - - 613.4.1 Quy trinh 0 vòi e2 0 613.4.2 Thuyết minh quy trình - 2¿+22++2+++£+++£E+2EE+2EE+22EE222+222222Ezzrrsrrrree 62KET LIAN YÃ: HỆ GED sa ggansieneeanoitienidtleotioigioogirgiifuG0iG003103089100100u83.ngiẺ 64TÁTIIỆU THỜ BA cence 67PHU LUG wossssessssscsssssvesessenecssnsscsaxssucsonesssseseveuesssesssassuseseunrecsuvessssssssensonsesssssveseacusseces 79

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

AA Ascorbic acid (Ham lượng axít ascorbic)

GAE Gallic acid equivalent

kl khối lượng

QE Quercetin equivalent

TFC total flavonoid content (Ham lượng flavomoid tông)

TPC total phenolic content (Ham lượng phenolic tổng)

TSC total saponin content (Ham lượng saponin triterpenoid tổng)Vek vật chất khô

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBảng 1.1 Trích ly các hợp chất sinh học trong trái nhàu từ các dung môi khác

Bang 2.1 Bồ trí thí nghiệm khảo sát độ chín và thời gian bảo quản 26Bang 2.2 Bồ trí thí nghiệm khảo sát loại ezyme sử dụng -2 2222-552 28Bảng 2.3 Bồ trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của xử lý siêu âm 29Bảng 2.4 Bồ trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ bột nhàu với dung môii 30Bảng 2.5 Bồ trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ ezyme bổ sung -22- 2-52 30Bang 2.6 Bồ trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thủy phân 22 25522 31Bang 2.7 Bồ trí thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân -2 - 31Bảng 2.8 Các yếu tố thí nghiệm va mức độ của chúng - 2-2252 32Bang 2.9 Bồ trí thí nghiệm tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích

ly các hoạt chat sinh hợc tử trái nhần - S.-EikLiomkv re 33Bảng 3 1 Ảnh hưởng của độ chín khi thu hoạch đến các hợp chất sinh học 37Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến các hợp chất sinh học trái

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến màu sắc và các chỉ tiêu hoá lý 39Bảng 3.4 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu quả trích các hợp chất sinh học

tföfð tiệt TẤT cnnnseesnsannnoseenndenidaninaiigitASEGHUUDSĐNEEE2H2DIDENGLSDĐ0G/000030800010 81 40Bảng 3.5 Ảnh hưởng của xử lý siêu âm đến trích ly các hoạt chất sinh học

{TONG tải HHẤU:szásczcxgx6106111095154155633E56358558 59538535 55BSSSXESNISSSHS3SBSSSS3821393803044Đ88858 42Bảng 3.6 Bồ trí thí nghiệm và kết quả của các chỉ tiêu theo dõi theo kiểu kết

OP (CÓ (afi (CCD) soaesieesoesisbtoosmizditiulteiinritilidofdbröaoilinGuslgt3Sgdaia51010081-50in migioiosl'SHgsig4801g 0 51Bảng 3.7 Dự đoán hệ số của phương trình bậc 2 với các hàm mục tiêu

Polyphenol tổng, Flavonoid, Saponin và vitamin C -: 52 53Bang 3.8 Kết quả thâm tra giữa mô hình và thí nghiệm thực tế . 59

Bảng 3.9 So sánh hàm lượng các chất trích ly thu được giữa phương pháp

nghiên cứu và phương pháp trích ly bang ethanol - 2-2252:

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hinh 1.1 Cay nhau va trate eee 4Hình 1.2 Năm giai đoạn phát triển khác nhau của trái nhàu -. - 5Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các flavonoid chính được xác định trong trái

(001 eee ae 8Hình 1.4 Sơ đồ quá trình ly giải tế bao do bọt xâm thực của sóng siêu âm 17

Hình 3.1 Độ chín của trái nhàu khi thu hoạch 55+ ++2++++<++se++zee+zss2 36

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước/ bột nhàu đến khả năng trích ly các hợp

chất sinh học trong trái nhàu 2-22 222222222E+2EE2EE2EE22E22EE22EzEzzrxeex 44Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến khả năng trích ly các hợp chất sinh

HOS HOME GAL TNA access: se Bii05106480308 80106 300013483354385E83SSGE49538:BEGRSSE3ESSS/ESSi53g28E003g3Ẻ 46Hình 3.4 Anh hưởng của nhiệt độ ủ enzyme đến kha năng trích ly các hợp chat

sinh hoe rong Trãi THIẾU sssssxses6:si546sg::44023:x40806455408405:3ỹSSẸcS09483E983/4038048303g4288 10838 48Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến khả năng trích ly các hợp

chất sinh học trong trái nhàu 2 5© 5+ ©©z+cx2+xEExcxerrxrrkerrerrseee 49Hình 3.6 Đồ thị 3D và đường đồng mức thé hiện sự tương tác của các yếu tố

đến hàm lượng polyphenol tổng -2- 2-2 +s+2E+2E£2E+2E+2E+2EZEZEzEzzxzzxeez 55Hình 3.7 Đồ thị 3D và đường đồng mức thé hiện sự tương tác của các yếu tố

đến hàm lượng flavonoid tỐng -2- 2 ©22222+22+2E+2EE2E+22E2EE2EErzxrzrxees 56Hình 3.8 Đồ thị 3D và đường đồng mức thê hiện sự tương tác của các yếu tố

đến hàm lượng saponin tổng 2-22 222222222E222E22E2E1223232221222222xee 57Hình 3.9 Đồ thi 3D và đường đồng mức thé hiện sự tương tác của các yếu tố

đến hàm lượng vitamin C -2-2222222++2E+2E+2EE22E+22E223222127322E221 22x 58Hình 3.10 Mô hình tối ưu điều kiện trích ly dich trai nhàu 25252552 59Hình 3.11 Quy trình công nghệ trích ly các hợp chat sinh học từ trái nhàu 62

ĐẶT VAN DE

Trước đây Việt Nam cũng như nhiều quốc gia khác trên thé giới nhưCampuchia, Philippin, Ấn độ đã biết sử dụng nhàu để làm thuốc chữa bệnh ungthư, nhiễm trùng, viêm khớp, tiểu đường, hen suyễn, tăng huyết áp và đau nhức(Whistler, 1992) Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy trái nhàu có chứa nhiều hop chatsinh học có lợi cho sức khoẻ con người Các nhóm hợp chất hoạt tính sinh họctrong nhàu đã được báo cáo, bao gồm axít, rượu, phenol, saccharide, anthraquinon,carotenoid, este, triterpenes, flavonoid, glycoside, lacton, iridoids, xeton, lignans,

nucleoside, sterol, (Abou Assi va ctv, 2017; Singh, 2012) Ngoài ra trai nhàu còn

chứa các chat có hoạt tinh chống oxy hoá cao, giúp ngăn chặn các gốc tu do trong

cơ thể con người Polyphenol, flavonoid, axít ascorbic được biết đến như nhữngchất chống oxy hóa mạnh mẽ Các polyphenol chính trong trái nhàu bao gồm

damnacanthal, scopoletin, morindone và alizarin, aucubin, nordamnacanthal, v.v.,

góp phan vào các hoạt động dược lý khác nhau (Chan-Blanco va ctv, 2006; J.-M.Kim va ctv, 2017) Vitamin cũng đã được báo cáo trong các nghiên cứu liên quan.

Lượng vitamin C có trong trái nhàu xay nhuyễn là khoảng 1,13 mg/g trái nhàu,

tương ứng với 250% nhu cầu vitamin C hàng ngày được khuyến nghị cho người lớn(West va ctv, 2011).

Theo truyền thống, nước ép trái nhàu được sản xuất bằng cách lên men trainhàu trong lọ hoặc thùng kín trong khoảng 10 ngày đến 2 tháng Nước ép lên mensau đó được thanh trùng và đóng chai (Camel, 2001) Bột trái nhàu được sản xuấtbằng cách làm khô toàn bộ trái cây hoặc cùi trong tủ sấy khô hoặc dưới ánh sángmặt trời Một số nghiên cứu đã báo cáo việc sử dụng các phương pháp xử lý nhiệt

dé chiet xuât các dịch trích từ trái nhau, ví dụ, đun sôi, khử nước và đóng hộp Tuy

nhiên, các hợp chất sinh học có lợi cho sức khỏe cũng sẽ mat đi rất nhiều trong quátrình chế biến.

Mặt khác, việc chiết xuất bằng dung môi tương đối tốn thời gian., do cần

phải loại bỏ dung môi bằng cách bay hơi Bước này kéo dài cũng có thể dẫn đếnphân hủy các hợp chất không ổn định, đặc biệt là khi cần gia nhiệt Một van đềkhác là nguy co hap phụ chất phân tích vào dung cụ thủy tinh có thé xảy ra ở giaiđoạn chiết hoặc bay hoi dung môi (Bressolle, 2005) Ngoài ra, hiện nay còn rất itnghiên cứu chuyên sâu về trích ly các hợp chất sinh học trong trái nhàu bằng cách

sử dụng phương pháp thân thiện môi trường như enzyme hay siêu âm nhằm nângcao năng suất và đảm bảo được chất lượng của các hợp chất sinh học trong dịchtrích.

Trên phương diện khác, Việt Nam là đất nước có nhiều điều kiện thuận lợicho trồng trọt và phát triển các loại nguyên liệu thực vật có hoạt tính sinh học cao,trong đó có thê kế đến là trái nhàu Tuy nhiên, trước đây, trái nhàu chỉ được dùngtươi, do đó sản lượng tiêu thụ không được nhiều Trong thời gian gần đây, phần lớntrái nhàu chỉ được thương mại như là nguyên liệu thô, chưa phản ánh được hết giátrị của nó, đặc biệt là các hợp chất sinh học Bên cạnh đó, việc thu mua trái nhàunguyên liệu 6 ạt trong một thời gian ngắn dẫn đến tinh trạng được mùa mất giá, gâythiệt hại nền kinh tế Do vậy, theo xu hướng phát triển thực phẩm dinh dưỡng ngàycàng tăng cao, nhu cầu nghiên cứu phát triển các nguyên liệu từ thực vật có hàmlượng các hoạt chất sinh học cao bằng các phương pháp thân thiện môi trường là rấtcần thiết và cấp bách Vì thế, đề tài “Nghiên cứu trích ly các hợp chất sinh học từtrái nhàu bằng enzyme có tiền xử lý sóng siêu âm” có ý nghĩa quan trọng nhằm:

(1) xây dựng quy trình công nghệ trích ly các hợp chất sinh học thân thiệnvới môi trường, là co sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo;

(2) mô hình tham khảo cho trích ly các hợp chất sinh học có giá trị cao từ cácloại nguyên liệu thực vật Việt Nam.

Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu trái nhàu được thu hoạch từ trang trại, đóng gói và vận chuyên

về Khoa Công nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định độ chín thu hoạch và thời gian bản quản thích hợp.

Xác định được điều kiện trích ly tối ưu các hợp chất sinh học trong trái nhàubằng công nghệ tiên tiến và thân thiện môi trường bang enzyme với tiền xử lý sóngsiêu âm để thu được các hợp chất sinh học có hàm lượng cao nhất

Các thí nghiệm bố trí trong dé tài nhằm giải quyết việc khai thác tối đa cáchợp chất sinh học có lợi cho sức khoẻ con người (như flavonoids, polyphenol,triterpenoid và axit ascorbic) từ nguồn nguyên liệu trái nhàu bằng enzyme với tiền

xử lý siêu âm.

Chương 1 TỎNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây nhàu

1.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây nhàu

Trái nhau (Hình 1.1) có tên khoa học là Morinda citrifolia L là một loài cây

ăn quả trong ho cà phê, Rubiaceae, thường được gọi là Noni, là cây bản dia của các

vùng nhiệt đới, có nguồn gốc ở Đông Nam Á (SC, 2001; Sang và ctv, 2001) Theonơi trồng trọt, nhàu còn được gọi là dâu tằm Ấn Độ hoặc “nuna” ở Ấn Độ (Chan-Blanco và ctv, 2006), Mengkudu ở Malaysia (Yahia, 2011) hoặc quả pho mát ở Úc(Ross, 2005) Tên phố biến nhất của nó, noni, được giới thiệu bởi những người nhập

cư Polynesia khi đến đảo Hawaii vào khoảng 2000 năm trước (Wang và ctv, 2002)

Hình 1.1 Cây nhàu và trái

Phạm vi bản dia của nó trải dài khắp Đông Nam Á và Australasia, và đượccác thủy thủ Polynesia phân bố đến Thái Bình Dương (Prance và Nesbitt, 2012) Ở

Việt Nam, trái nhàu mọc nhiêu ở những vùng âm thâp dọc theo bờ sông, bờ suôi, ao

hô hoặc mương rạch ở khắp các tỉnh miên Nam hoặc một sô tỉnh miên Trung

Đô cứng vừa phải cả s =8

Chiêu dài từ 8-14 cm Ore = = g

nhàu có chiều dài khoảng 5 đến 10 cm và chiều rộng từ 3 đến 6 em Theo Nelson,(2005) báo cáo một trái nhàu có chiều dai lên đến 14 cm và đường kính 8 em Bềngoài của nó có hình bầu dục và nhiều thịt, với nhiều hạt nhỏ hoặc "chéi" màu nâu

đỏ hợp nhất với bề mặt thô ráp cua trái Trai có màu xanh lục nhạt khi chưa chín vamàu trắng hơi vàng khi chín, mềm, có thịt ở bên trong, với cùi sền sệt màu trắng hơi

vàng tùy thuộc vào giai đoạn trưởng thành (Chan-Blanco và ctv, 2006) Năm giai

đoạn phát triển khác nhau của trái nhàu được trình bày ở Hình 1.2 Trái nhàucũng có vị đắng hoặc chát khi chín và có mùi ôi khét tương tự như axít butyric Hơnnữa, một trái nhàu có thé chứa tới 260 hạt (Motshakeri và Ghazali, 2015)

1.1.2 Quá trình thu hoạch và xử lý trái

Trái nhàu có thể được hái ở bất kỳ giai đoạn phát triển nảo, tùy thuộc vàophương pháp chế biến dự định Trái nhàu được thu hoạch bằng tay bằng cách hái

từng trái từ cành Chúng được đặt trong giỏ hoặc túi hoặc đặt trong thùng dé vận

chuyên đến cơ sở chế biến Trái nhàu không dé bi bam hoặc hư hỏng, và thườngkhông cần có hộp lót đệm đặc biệt hoặc các biện pháp phòng ngừa khác để ngăn tráinhàu bị hư hỏng đáng ké Trái nhàu xanh hoặc vàng chưa chín rất cứng và bên, do

đó có khả năng chống hư hỏng bề mặt và bam trong quá trình vận chuyền và xử lý.Trái nhàu ở giai đoạn phát triển này sẽ chín qua đêm hoặc vài ngày ở nhiệt độphòng và có thể được chế biến lấy nước trái cây ngay sau đó Hơn nữa, việc phơitrái nhàu dưới ánh nắng trực tiếp hoặc nhiệt độ âm ngay sau khi thu hoạch khôngphải là mối quan tâm đáng kê Vì vậy, trái nhàu không cần bảo quản lạnh sau khithu hoạch và thường không dé trong tu lanh (Yashaswini va ctv, 2014) Tuy nhién,theo Singh va ctv, (2007) báo cáo rằng trái cây có thời han sử dung từ 5 đến 7 ngày

ở nhiệt độ môi trường từ 25 đến 30°C và độ âm tương đối từ 70 đến 75%

1.1.3 Thành phần các hoạt chất sinh học trong trái nhàu

Nhàu có giá trị dinh đưỡng cao và gần 200 hợp chất phytochemical có đặctính hoạt tính sinh học đã được xác định và phân lập từ các bộ phận khác nhau củacây (Inada và ctv, 2017) Điều quan trọng là thành phần sinh hóa của các hợp chất

này khác nhau hoàn toàn không chỉ theo cấu trúc của thực vật mà còn liên quan đếnnơi xuất xứ và thời kỳ thu hoạch (Chan-Blanco và ctv, 2006; Deng và ctv, 2010).

Các báo cáo thử nghiệm về xác định thành phần dinh dưỡng của cây nhàucho thấy quả nhàu chín có khoảng 90% nước và 10% chất khô Chất khô chủ yếubao gồm các chất rắn hòa tan, trong đó 5% là đường khử (fructose va glucose) và1,3% là sucrose, phần còn lại của chất rắn hòa tan bao gồm protein và chất xơ(Motshakeri va Ghazali, 2015).

Theo Malik va ctv (2009), trong 100g mau bột trái cây bao gồm khoảng 71%carbohydrate, 36% chất xơ và 5,2% protein Các nhóm hợp chất hoạt tính sinh họckhác trong nhàu đã được báo cáo, bao gồm axit, rượu, phenol, saccharide,anthraquinon, carotenoid, este, triterpenes, flavonoid, glycoside, lacton, iridoids,

xeton, lignans, nucleoside, sterol, (Singh, 2012; Saminathan va ctv, 2013; Abou

Assi va ctv, 2017).

Polyphenol

Polyphenol được biết đến như một sản pham phụ của thực vật và chat chongoxy hóa, và các polyphenol chính trong trái nhàu bao gồm damnacanthal, scopoletin,morindone và alizarin, aucubin, nordamnacanthal, v.v., góp phần vào các hoạt động

dược lý khác nhau của trái nhàu (Chan-Blanco và ctv, 2006; J.-M Kim và ctv,

2017) Ngoài ra, Kim và ctv (2017) đã đo hàm lượng polyphenol bằng cách chiếtxuất trái nhàu được trồng ở sáu khu vực sản xuất, với kết quả dao động là 0,76 -1,67mg/ml Nghiên cứu của cũng cho thấy tong hàm lượng polyphenol trong các mẫunước ép trái nhàu dao động trong khoảng 0,36 đến 1,61 mg/mL từ khi trái chưa chinđến lúc trái chín hoàn toàn

Flavonoid

Theo Singh và Singh (2013) đã báo cáo sự khác biệt đáng kế của flavonoidtrong các bộ phận khác nhau cua cây nhàu Theo nghiên cứu, lượng flavonoid daođộng từ 190,0- 321,4 mg/100 g; lượng cao nhất được tìm thấy ở rễ và thấp nhất ở

quả chín.

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các flavonoid chính được xác định trong trái nhau

(Almeida và ctv, 2019)Theo Yang và ctv (2011) nhận thấy rằng tổng hàm lượng các hợp chấtphenolic, tiềm năng chống oxy hóa và hàm lượng axit ascorbic trong trái nhàu tăngkhi chuyển từ giai đoạn xanh sang màu trắng cứng (từ giai đoạn đầu tiên đến giaiđoạn thứ ba, Hình 1.2) và giảm dần khi quả càng chín Cụ thé, so với trái chín, tráinhàu trắng cứng có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn 1,2-2,2 lần, tong hàm lượngphenolic cao hơn 1,5 lần và hàm lượng axit ascorbic cao hơn 7,0 lần, trong khi tráinhàu xanh non có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn 1,1-1,5 lần, tổng số hàm lượngphenol cao hơn 1,3 lần và hàm lượng axit ascorbic cao hon 1,3 lần

Khoáng chất chiếm khoảng 8,4% chất khô của trái nhàu, và có thé thay đổitùy theo mức độ chín của trái, điều kiện trồng và sau thu hoạch (Chan-Blanco và ctv,

2006) Theo mô tả của Rybak và Ruzik (2013) cho thay dấu vết mangan, molypden,đồng và coban Theo West và ctv (2011) đã phát hiện kali là khoáng chất phong phúnhất trong quả nhàu, khoảng 214,34 mg/ 100 g Các khoáng chất khác như canxi,sắt, natri và selen cũng đã được xác định, và loại khoáng chất này cung cấp tới 26%liều khuyến cáo hàng ngày cho người lớn.

Vitamin cũng đã được báo cáo trong các nghiên cứu liên quan đến tráinhàu Vitamin C có nhiều nhất trong trái cây, dao động từ 24 đến 158 mg/ 100 gchất khô (Chan-Blanco và ctv, 2006) Lượng vitamin C có trong quả nhàu xaynhuyễn là khoảng 1,13 mg/g quả nhàu, tương ứng với 250% nhu cầu vitamin Chàng ngày được khuyến nghị cho người lớn (West và ctv, 2011)

1.1.4 Một số nghiên cứu về công dụng của trái nhàu

Trước đây nhân dân ta cũng như nhiều dân tộc khác trên thế giới nhưCampuchia, Philippin, An độ đã biết sử dụng một số bộ phận cây nhàu để làmthuốc Các bộ phận của cây nhàu được dùng làm thuốc là rễ, quả, lá và vỏ cây Nó

đã được báo cáo có nhiều lợi ích sức khỏe đối với bệnh ung thư, nhiễm trùng, viêmkhớp, tiêu đường, hen suyén, tăng huyết áp và đau nhức (Whistler, 1992)

Trong y học phố biến, việc sử dụng trái nhàu rộng rãi như một chất bổ sungthực phẩm trong điều trị một số loại ung thư (Torres và ctv, 2017) Trong bối cảnh

đó, các nghiên cứu khoa học về đặc tính chống ung thư của trái nhàu ngày càng tăng,đặc biệt là trong 30 năm trở lại đây Trong số các thành phần tự nhiên của nhàu,damnancanthal có thé thúc day việc kích hoạt các gen quy định quá trình chết trongcác dòng tế bào của người bị ung thư ruột kết (Nualsanit và ctv, 2012)

Nghiên cứu trên người đầu tiên được thực hiện bởi (Wong, 2004) ởHawaii Tác giả đã nghiên cứu lợi ích của việc sử dụng nước ép nhàu ở bệnh nhânung thư Bệnh nhân đã chọn dùng nước ép tự chế hàng ngày trong hai tháng Saumột tháng, bệnh nhân đã cải thiện đáng kể tình trạng lâm sang, ngừng điều trị sau

sáu tháng.

Nghiên cứu điển hình thứ hai được phát triển bởi (Issell va ctv, 2009) tạiTrung tâm Nghiên cứu Ung thư Hawaii Trong nghiên cứu này, một thử nghiệm lâm

sàng giai đoạn I đã được thực hiện dé xác định liều lượng tối đa cho phép của viênnang trái nhàu đông khô (500 mg/ viên) ở bệnh nhân ung thư Kết quả của các thửnghiệm lâm sàng đã chứng minh rằng điều trị chống lại ung thư thông qua việcuống viên nang nhàu chưa mang lại hiệu quả rõ ràng nào, chỉ giảm mệt mỏi và đau

cơ Tác giả đề xuất một số lượng lớn bệnh nhân điều trị lâm sảng và sử dụngnhàu như một loại thuốc chống ung thư

Hoạt động diệt khuẩn và diệt nắm

Một nghiên cứu cho thấy rằng việc chiết xuất các hợp chất phenolic từ trainhàu bằng các dung môi khác nhau (metanol, etyl axetat và hexan) có hoạt tínhkháng khuẩn chống lại một số lượng lớn các loài như Bacillus subtilis,Staphylococcus aureus, Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Escherichia coli, Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Salmonella paratyphi A, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, Chromobacterium violaceum va Enterobacter faecalis.Kết qua cho thấy khả năng sử dung chiết xuất từ qua nhàu trong điều trị các bệnhtruyền nhiễm và khối u (Jayaraman và ctv, 2008).

Tương tự, theo Babaji và ctv (2016) cũng phát hiện ra rằng chiết xuất của tráinhau với natri hypoclorit có hoạt tính kháng khuẩn chống lại Enterococcusfaecalis Kết qua chỉ ra rằng chiết xuất từ quả nhàu có tiềm năng sử dụng như mộtchat kháng khuẩn có nguồn gốc thảo dược

Về nắm, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhàu có chứa các thành phần sinh hóahòa tan trong nước ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất phụ trách về sự chuyênđổi hình thái của nam Candida albicans, do đó trái nhàu có giá trị điều trị tiềm năngchống lại nam Candida albicans (Sunder va ctv, 2012) Tương tự, Jainkittivong vàctv (2009) da chi ra rang chiét xuat đông khô của nước ép trái nhàu có tác dụng ứcchế sự phát triển của C albicans

Hoạt động chống oxy hóa

Trái nhàu có thé được sử dụng như một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên

có giá trị cao (Thoo va ctv, 2013a) Vi dụ, nước ép cua trái nhau Úc cho thấy hoạt

tính oxy hóa cao gấp 2,8 lần so với vitamin C và 1,4 lần so với pycnogenol, chất cómột số tác dụng chống oxy hóa (Atkinson, 1956).

Theo Zin và ctv (2006) đã chứng minh rằng chiết xuất thô từ rễ, lá và quả

nhàu được phân đoạn trong cột sắc ký với etanol làm dịch rửa giải cho thấy hoạttính chống oxy hóa cao trong ferric thiocyanate và trong các xét nghiệm axit

thiobarbituric, được coi là cao khi so sánh với hydroxytoluene butylate

(BHT) Nghiên cứu này cũng tiết lộ rang các hợp chất oxy hóa phenolic có trongtrái nhàu ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein mật độ thấp (LDL), có thể làm giảmnguy cơ ung thư và xơ vữa động mạch.

Trong một nghiên cứu khác, Gilani và ctv (2010) đã báo cáo rằng các đặctính chống oxy hóa có trong dịch chiết etanolic trong nước của lá, quả và rễcủa nhàu có liên quan đến tác dụng chống rối loạn lipid máu ở chuột công và chuộtnhất trên cả hai giới Kết qua cho thấy chiết xuất của ba bộ phận trong nhau làmgiảm mức độ chất béo trung tính, cholesterol toàn phần và cũng làm giảm mức LDL

và tăng mức độ lipoprotein mật độ cao.

Hoạt động tái tạo xương và điều trị đau khớp

Tác dụng của chiết xuất methanolic từ trái nhàu đối với chứng loãng xương

do cắt buồng trứng ở chuột bach tạng cái đã được đánh giá cao bởi (Shirwaikar vactv, 2011) Các kết quả dựa trên các dấu hiệu sinh cơ, sinh hóa và mô bệnh học chothấy chiết xuất từ trái nhàu thúc đây giảm mat xương, bằng chứng là giảm nồng độphosphatase kháng tartrat và hydroxyproline trong nước tiểu đồng thời tăng quátrình hình thành xương và do đó phục hồi quá trình khoáng hóa xương

Liên quan đến việc sử dụng nước ép nhàu dé điều trị các rối loạn liên quanđến đau khớp, có hai nghiên cứu lâm sàng đáng được đề cập Theo Akinbo và ctv(2006) đã so sánh hiệu quả của nước ép nhàu với các phương thức vật lý trị liệuđược lựa chọn trong điều trị đau và cứng cô ở bệnh nhân thoái hóa đốt song cổ Thửnghiệm lâm sàng kéo dài 4 tuần Kết quả cho thấy ba nhóm điều trị cho thấy cường

độ đau giảm đáng ké và cải thiện độ linh hoạt của cô

Một thành phần tích cực khác có trong trái nhàu gần đây được chứng nhận cóđặc tính hạ huyết áp là axit iridoide asperulosidico, theo Murata va ctv (2014), sựhién dién cua hoat tinh sinh hoc nay trong chiết xuất nước ethanolic của trái nhàu đãgóp phần vào việc ức chế sự kết tụ của hồng cầu do polybrene (hexadimetrine

bromide) và hoạt động thrombin được đánh giá trong mẫu máu của thỏ và chuột

đực Những hoạt tính sinh học được phát hiện này cho thấy trái nhàu là một loạithực phẩm có giá trị đinh đưỡng cao, có khả năng cải thiện lưu lượng máu, cũnggóp phan làm giảm huyết áp, rối loan lipid máu và tiểu đường

1.2 Tống quan về các phương pháp trích ly

Lựa chọn phương pháp trích ly và tiền xử lý nguyên liệu đóng vai trò rấtquan trọng trong quá trình chế biến các loại nguyên liệu thực vật, sao cho đảm bảođược hiệu quả trích ly các hợp chất cao nhất và đồng thời đảm bảo chất lượng củadịch trích Vì vậy, tôi ưu hóa việc trích ly là một trong những bước rất quan trọng

và cần thiết trong quá trình chế biến các chế phẩm từ trái nhàu Các phương pháptrích ly truyền thống sử dụng dung môi độc hại gây nên những vấn đề về sức khỏe

và môi trường, đồng thời cũng ảnh hưởng tới chất lượng dịch sau trích Điều quan

trọng là tìm ra một phương pháp trích ly thích hợp mà không sử dụng dung môi độchại hoặc chỉ dùng các dung môi cho phép sử dụng trong thực phẩm Nhiều nghiên

cứu đã chi ra rằng các hoạt chat sinh học có thé được trích ly bằng các phương pháp

như phương pháp trích với enzyme thủy phân và sóng siêu âm Các phương pháp

này có nhiều ưu điểm như thân thiện với môi trường và không sử dụng dung môi

độc hại.

1.2.1 Trích ly bằng phương pháp truyền thống

Việc lựa chọn dung môi dựa trên bản chất hóa học và tính phân cực của cáchợp chất chống oxy hóa được chiết xuất Hầu hết các phenol, flavanoid vàanthocyanins là chất chỗng oxy hóa hòa tan trong nước Các dung môi phân cực vàphân cực trung bình, chẳng hạn như nước, etanol, metanol, propanol, axeton và cáchỗn hợp nước của chúng, được sử dụng rộng rãi dé chiết xuất

Nghiên cứu của Nagalingam va ctv (2012) cũng khảo sát trên ba loại dung

môi là nước, etanol va methanol dé trích ly các hợp chất sinh học trong trái nhàucho thấy sự hiện diện của tất cả các hợp chất sinh học chính trong trái nhàu nhưphenol, saponin, steroid, terpenoids, carbohydrate và flavonoids, hiện diện với số

lượng chênh lệch khác nhau trong các loại dung môi khác nhau như Bảng 1.1.

Trong nghiên cứu của Muenmuang và cộng sự, ba loại dung môi (metanol,

etanol và hexan) được chon cho các thí nghiệm chiết xuất các hợp chất sinh họctrong trái nhàu Kết quả cho thấy metanol cho năng suất cao nhất, tiếp theo là etanol

và hexan Dung môi metanol và etanol có năng suất chiết xuất cao vì những dungmôi này có thê chiết cả hợp chất phân cực và không phân cực (Muenmuang và ctv,2017).

Dung môi và pH trích ly là 2 yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và độbền của các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa, đại diện là hai nhóm polyphenol

và flavonoid Kết quả thực nghiệm trích ly các hoạt chất sinh học trong tía tô bằngphương pháp ngâm chiết cho thấy dung môi thích hợp là ethanol (Thúy và ctv,2020).

Tuy nhiên, việc chiết xuất dung môi tương đối tốn thời gian Nó thường yêucầu loại bỏ dung môi bằng cách bay hơi Bước này kéo dài cũng có thể dẫn đếnphân hủy các hợp chất không ôn định, đặc biệt là khi cần gia nhiệt Mất mát cũng cóthê xảy ra ở giai đoạn phân giải lại Một vấn đề khác là nguy cơ hấp phụ chất phân

tích vào dung cụ thủy tinh có thé xảy ra ở giai đoạn chiết hoặc bay hơi dung môi(Bressolle, 2005).

Bảng 1.1 Trích ly các hợp chất sinh học trong trái nhàu từ các dung môi khác nhau

Loại dung môi trích lyCác hoạt chất sinh học

Nước Methanol Ethanol Steroids +sÈ ++ ++

thường kém hơn vì hiệu quả thấp, chỉ phí cao, sự xuống cấp của các hợp chất sinhhọc đo quá trình xử lý lâu dài và liên quan đến các rủi ro về sức khỏe.

1.2.2 Trích ly với sự hỗ trợ của enzyme

Chiết xuất thông thường có thé làm hỏng hoạt tính của các chất chống oxyhóa phenolic, có thể nhạy cảm với các dung môi cụ thể hoặc nhiệt độ cao Sử dụngenzyme trong quá trình trích ly các hợp chất sinh học từ các loại nguyên liệu thựcvật đã được nghiên cứu và cho thấy hiệu quả trích ly cải thiện đáng kể Việc ápdụng các enzyme thương mại chi phí thấp được sử dụng trong công nghiệp thựcphẩm dé phân hủy các thành phần chính của thành tế bào thực vật có thé cải thiệnhiệu suất chiết xuất của các hợp chất phenolic mà không cần sử dụng các điều kiệnbiến tính và do đó bảo toàn hoạt tính chống oxy hóa của chúng Các hợp chất sinhhọc trong mạng lưới tế bào thực vật được phân tán trong tế bào chất và một số hợpchất nằm ở mạng lưới polysaccharide và lignin bởi liên kết hydrogen hoặc liên kết

ky nước Điều này làm cho các dung môi rất khó khuyếch tán vào trong mạng lưới,làm cho hiệu suất trích ly thấp Nhiều công trình công bố cho thấy trích ly với sự hỗtrợ của enzyme có hiệu quả trong việc cắt các liên kết này, giải phóng các hợp chấtsinh học ra khỏi mạng lưới, dẫn đến tăng hiệu suất trích ly Sử dụng các enzyme đặc

hiệu như cellulase, a-amylase và pectinase trong quá trình trích ly đã nâng cao hiệu

quả trích ly bằng cách phá vỡ vách tế bào, thuỷ phân cấu trúc polysaccharide Déđạt được hiệu quả trong quá trình trích ly, các yếu tố quan trọng ảnh hưởng cầnđược nghiên cứu bao gồm: nồng độ enzyme sử dụng, kích thước nguyên liệu, tỉ lệ

cơ chất so với nước và thời gian thuỷ phân

Trích ly các hợp chất sinh học với sự hỗ trợ của enzyme được biết là phươngpháp thân thiện với môi trường bởi vì dung môi sử dụng chủ yếu là nước thay vì cácdung môi độc hại (Puri và ctv, 2012) Ví dụ, sử dụng enzyme trong trích ly hàmlượng polyphenol từ bã nho trong quá trình sản xuất rượu đã được báo cáo là rất

hiệu quả bởi tác giả (Meyer và ctv, 1998) Đồng thời, nhóm tác giả cũng đã chứng

minh mối tương quan giữa hiệu suất trích ly và mức độ phá vỡ tế bào của enzyme.Tương tu, (Gómez-García và ctv, 2012) cũng cho thấy hiệu quả sử dụng các loại

enzyme (cellulase, pectinase) trong trích ly polyphenol từ nguyên liệu thực vật.

Trong nghiên cứu của (J M Kim va ctv, 2020) cho thay hàm lượng polyphenol

trong dịch trích trái nhàu đã tăng lên đáng kể khi xử lý bằng enzyme pectinase va

xenlulaza.

Từ các nghiên cứu trên, có thể thấy trích ly với sự hỗ trợ của enzyme là mộttrong những phương pháp hiệu quả trong trích ly các hợp chat sinh học Dé đánh giátính hiệu quả trong quá trình trích ly các hợp chat sinh học có trong trái nhàu, loạienzyme, nồng độ, nhiệt độ và thời gian thuỷ phân, cần được nghiên cứu

1.2.3 Trích ly với sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Các phương pháp tiền xử lý quan trong dé hỗ trợ phá vỡ cau trúc tế bào vàtăng tính thấm của thành hoặc màng tế bào Chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm đãđược áp dụng rộng rãi trong ba thập kỷ qua như một phương pháp chiết xuất hiệuquả trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm (Esclapez và ctv, 2011).Đánh giá cho thấy rang công nghệ trích ly có hỗ trợ bằng sóng siêu âm có thé tăngcường khả năng chiết xuất các thành phần như polyphenol, anthocyanin, hợp chấtthơm, polysaccharid, dầu và các hợp chất chức năng khi được sử dụng như mộtbước tiền xử lý trong một quy trình sản xuất (Vilkhu và ctv, 2008)

Sự lan truyền của siêu âm trong các hệ thống chất lỏng là thông qua một loạtcác sóng nén và kéo tạo ra các bong bóng tạo bọt trong chất lỏng (Soria vàVillamiel, 2010; Chemat và Khan, 2011) Kích thước của những bong bóng nayphát triển trong khoảng thời gian vài chu kỳ cho đến khi đạt đến điểm tới hạn, sau

đó những bong bóng này xẹp xuống và giải phóng một lượng lớn năng lượng, tạo ranhiệt độ cực cao (5000K) và áp suất (1000 atm) ở nhiệt độ phòng Trong quá trìnhsiêu âm hỗ trợ chiết xuất các thành phần hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thực vật,nhiệt độ và áp suất cao sẽ phá hủy thành tế bào, tạo điều kiện giải phóng các hợpchất hoạt tính sinh học từ thành tế bào thực vật và tăng cường quá trình truyền khối

Sự truyền nhiệt của sóng siêu âm là từ bên ngoài tế bào thực vật vào bên trong, theohướng ngược lại của quá trình chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (Xu và ctv, 2017) Có hailoại siêu âm: (ï) với tần số thấp (20 đến 100 kHz) và cường độ cao (10 đến

1000W/cm”), thường được sử dụng đề nhũ hóa và chiết xuất các hợp chất hữu cơ vàhoạt tính sinh học; và với tần số cao (200 kHz đến 10 MHz) và cường độ thấp,

(dưới 1W/cm’), có thé được sử dụng để khử ion kim loại và oxy hóa các chất ônhiễm hữu cơ (Hirazumi và Furusawa, 1999) Độ âm của mẫu, mức độ nghiền, kíchthước hạt và dung môi là những yếu tố rất quan trọng dé thu được hiệu quả và hiệuquả chiết xuất Hơn nữa, nhiệt độ, tần số áp suất và thời gian của sóng siêu âm lànhững yêu tô chi phôi hoạt động của sóng siêu âm.

©

tạo bọt khí xâm thực ở bề bong bóng xẹp xuống, tạo Dung môi di chuyên vào Sự khuếch tán của nội

mặt phân cách rắn-lỏng lỗ rỗng bằng các tia cắt và ra trong nội bảo bào và ly giải tế bào

Hình 1.4 Sơ đồ quá trình ly giải tế bào do bọt xâm thực của sóng siêu âm

(Perera va Alzahrani, 2021)Chiết xuất bang sóng siêu âm là một phương pháp sạch, tránh sử dung mộtlượng lớn dung môi và cắt giảm thời gian trích ly Người ta đã chú ý nhiều đến việc

ap dụng sóng siêu âm để chiết xuất các sản phẩm tự nhiên thường cần nhiều giờhoặc nhiều ngày để hoàn thành bằng các phương pháp thông thường Sử dụng sóngsiêu âm, việc chiết xuất đầy đủ giờ đây có thé được hoàn thành trong vài phút với

khả năng tái tạo cao, giảm tiêu thụ dung môi, đơn giản hóa thao tác và mang lại độ

tỉnh khiết cao hơn của sản phẩm cuối cùng, loại bỏ nước thải sau xử lý và chỉ tiêuthụ một phần nhỏ năng lượng hóa thạch thường cần thiết so với một phương phápchiết xuất thông thường Ngoài ra, sóng siêu âm không bị hạn chế bởi dung môi vàloại chất nền được sử dụng, hoặc bởi độ âm Kết quả là, sử dụng sóng siêu âm trongchiết xuất thực vật có lợi trong việc tăng chuyền khối, thâm nhập dung môi tốt hơn,

ít phụ thuộc vào dung môi sử dụng hơn, chiết xuất ở nhiệt độ thấp hơn, tốc độ chiếtxuất nhanh hơn và sản lượng cao hơn (Vinatoru, 2001)

Một trong những nghiên cứu cho thấy các hợp chất phenolic như rutin,naringin, naringenin, quercetin, axit ellagic, và kaempferol đã được trích ly hiệu qua

khi sử dung sóng siêu âm (Herrera và De Castro, 2004) Trong nghiên cứu của Li va

ctv (2020), ba phương pháp chiết xuất đã được áp dụng để chiết xuất cácpolysaccharides từ trái nhàu bao gồm chiết xuất bằng nước nóng, chiết xuất bằngđiện trường xung và chiết xuất bằng sóng siêu âm Trong đó, sóng siêu âm có năngsuất chiết xuất cao nhất, trọng lượng phân tử nhỏ nhất và các hoạt động chống oxyhóa tốt nhất

Có thể nhận thấy, để nâng cao hiệu quả trích ly các hợp chất sinh học từnguyên liệu thực vật (bao gồm trái nhàu), cần nghiên cứu các điều kiện trích ly nhưkích thước nguyên liệu, nhiệt độ, ap suất, tần số, và thời gian siêu âm v.v cần

được nghiên cứu (Azmir và ctv, 2013a).

1.2.4 Trích ly kết hợp giữa enzyme và sóng siêu âm

Một số hợp chất có thể khó chiết xuất và sự kết hợp của hai kỹ thuật chiếtxuất có thé là cần thiết, cụ thé là chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm, sau đó là dungenzyme dé thủy phân Chiết xuất bằng enzym hỗ trợ bằng sóng siêu âm được xácnhận là một công nghệ chiết xuất mới với những ưu điểm chính là nâng cao năngsuất chiết xuất và các hoạt động sinh lý của các chất chiết xuất từ các loại thực vậtkhác nhau Các nghiên cứu về phương pháp nay đã được áp dung dé thu được sanlượng cao nhất về hàm lượng phenolic, các hoạt động chống oxy hóa và kháng umạnh nhất.

Trong nghiên cứu của Yumna va ctv (2018) trích ly các hoạt chấtPhytosterols trong lá của cây Keji beling bằng cách sử dụng phương pháp enzymekết hợp với sóng siêu âm cho thấy năng suất chiết xuất tối đa thu được từ lá KejiBeling là 48,63% (lượng enzym cellulase bé sung là 70 mg/g và nồng độ etanol là50%, kích thước mắt lưới < 0,585 mm, thủy phân trong 2 giờ ở pH 4 - 6, tỷ lệ lỏng -rắn là 20: 1, thời gian siêu âm là 60 phút và nhiệt độ chiết là 30°C)

Trong phương pháp chiết xuất bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm, hiệu quả củaquá trình chiết xuất bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số như loại và nồng độ của

enzyme, thành phần dung môi, tỷ lệ dung môi và chất rắn, nhiệt độ chiết và thờigian chiết Vì vậy, việc tối ưu hóa các thông số này là rất quan trọng để cải thiệnnăng suất khai thác.

1.2.5 Một số phương pháp trích ly khác

Gần đây, sự phát triển của chiết xuất có sự hỗ trợ của vi sóng đã được ápdụng để chiết xuất các chất hoạt tính sinh học từ các nguyên liệu thực vật khácnhau ác đặc tính vật lý của các mô sinh học (mảng tế bào và các bào quan) bị biếnđổi do áp suất sinh ra bên trong vật liệu Màng tế bào bị vỡ, các hợp chất có hoạttính sinh học từ tế bào bị vỡ được giải phóng vào môi trường Sự xâm nhập củadung môi chiết qua chất nền sinh học xốp được tạo điều kiện thuận lợi Do đó, năngsuất chiết xuất của các hợp chất mong muốn có thê được tăng lên Ngoài ra, việc sửdụng chiết xuất này cũng mang lại một số lợi ích như sử dụng ít dung môi hữu cơhơn, giảm thời gian xử lý và gia nhiệt đồng đều (Uquiche và ctv, 2008; Azmir vàctv, 2013b).

Trong nghiên cứu của Jamaludin và ctv (2020) đã thực hiện chiết xuất cáchợp chất sinh học trong trái nhàu bằng áp suất thủy tĩnh cao sử dụng ethanol làmdung môi trích ly Kết quả thu được cho thấy năng suất chiết tăng lên, rút ngắn thờigian chiết và giảm tiêu thụ dung môi ở nhiệt độ phòng

Phương pháp chiết xuất siêu tới hạn: Chất lỏng được sử dụng trong quá trìnhchiết xuất này ở trạng thái siêu tới hạn, có áp suất và nhiệt độ cao hơn giá trị tới hạncủa chúng Ở trạng thái này, các đặc tính riêng biệt của chất lỏng siêu tới hạn như tỷtrọng, độ nhớt và độ khuếch tán là trung gian giữa chất khí và chất lỏng (Camel,2001) Điều quan trọng là, mật độ, mức độ hòa tan của chất lỏng, có thể được điềuchỉnh bằng cách thay đổi cả nhiệt độ và áp suất của chất lỏng Do đó, những đặctính này mang lại một số lợi thế bao gồm thời gian chiết xuất ngắn hơn, năng suấtchiết xuất cao hơn và lưu giữ tốt hơn các hợp chất dinh dưỡng và hoạt tính sinh học

có giá trị (Herrero va ctv, 2006) Tuy nhiên chi phí dau tư thiết bị cho các phươngpháp trên khá cao cũng là vấn đề cân nhắc khi đưa vào ứng dụng trong công nghiệp

1.3 Các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam có liên quan đến đề tài

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Ké từ năm 1996 đến nay, theo kết quả tìm kiếm và tong hợp tại liệu từ

Scopus, có khoảng 368 báo cáo đã được xuất bản về các thành phần có liên quanđến cây nhàu (rễ, thân, lá và quả)

Trước đó, các phương pháp trích ly truyền thống bằng dung môi được sửdụng khá phổ biến trong nghiên cứu các hợp chất sinh học trong trái nhàu, nhưtrong nghiên cứu của Muenmuang và cộng sự, ba loại dung môi (metanol, etanol vàhexan) được chọn cho các thí nghiệm chiết xuất các hợp chất sinh học trong tráinhàu Kết quả cho thấy dung môi metanol và etanol có năng suất chiết xuất cao vìnhững dung môi này có thé chiết cả hợp chất phân cực và không phân cực(Muenmuang và ctv, 2017) Tuy nhiên, sản pham sau khi chiết xuất phải trải quathêm công đoạn khử dung môi gây ảnh hưởng không tốt đến chất lượng dịch sau

trích Tương tu, nghiên cứu của Nagalingam va ctv (2012) cũng khảo sát trên ba

loại dung môi là nước, etanol và methanol dé trích ly các hợp chất sinh học trongtrái nhàu cho thấy sự hiện diện của tất cả các hợp chất sinh học chính trong trái

nhàu như phenol, saponin, steroid, terpenoids, carbohydrate và flavonoids, hiện

diện với số lượng chênh lệch khác nhau trong các loại dung môi khác nhau

Một nghiên cứu của Thoo và ctv (2010) về sử dụng dung môi là ethanol vàkhảo sát ảnh hưởng của nồng độ etanol (0-100%, v/v), thời gian chiết (20-120 phút)

và nhiệt độ chiết (25- 65°C) đối với việc chiết xuất các chất chống oxy hóa phenolic

từ trái nhàu Kết quả nghiên cứu cho ra điều kiện tối ưu hóa là 40% etanol trong

80 phút ở 65°C, với các giá trị 919,95 mg GAE /100 g DW đối với TPC; 472,73 mgCE/100 g DW đối với TFC; 791,71 mol TEAC/100 g DW đối với ABTS và1928.5 mol TEAC/100 g DW đối với DPPH

Các phương pháp tiền xử ly quan trong dé hỗ trợ phá vỡ cau trúc tế bao vatăng tính thấm của thành hoặc màng tế bào Về phương pháp sử dụng sóng siêu âmtrong trích ly cũng đã có nhiều nghiên cứu áp dụng Trong nghiên cứu của Li va ctv(2020) về đặc tính hóa lý, hoạt động chống oxy hóa và khả năng chống tăng sinh

của polysaccharid từ trái nhàu qua ba phương pháp trích ly bao gồm chiết xuất bằngnước nóng, chiết xuất bằng điện trường xung và chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm.

Kết quả cho thấy chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm có năng suất chiết xuất

cao nhất, trọng lượng phân tử nhỏ nhất và các hoạt động chống oxy hóa tốt nhấtcũng như khả năng chống tăng sinh tuyệt vời Theo Wang và ctv (2021) báo cáorằng ứng dụng kết hợp enzyme và sóng siêu âm đã được sử dụng thành công déchiết xuất polyphenol từ chanh dây

Tương tự, nghiên cứu mới nhất của Buanasari và ctv (2021) trích ly các hợpchất sinh học trong lá nhàu sử dụng phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm với 50%

V ethanol trong 60 phút Kết quả cho thay năng suất cao nhất thu được khi chiết với

tỷ lệ chất rắn - dung môi là 1:40 g / mL, ở nhiệt độ chiết 55°C, là 32,29 + 0,066%.Hàm lượng flavonoid cao nhất (173,41 + 0,615 mg đương lượng quercetin/g chiếtxuất), hàm lượng phenol (197,00 + 0,148 mg đương lượng axit gallic/g chiết xuất)

và hoạt động thu gom DPPH (97,65 + 0,912%) thu được trong quá trình chiết vớidung môi chat rắn tỷ lệ 1:30 g/ml ở nhiệt độ chiết 25°C Tác giả nhận định rằng việc

sử dụng phương pháp chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm bằng cách chọn các điềukiện vận hành tối ưu làm tăng đáng kế lượng hấp thụ hợp chất hoạt tính cần thiết

Ngoài ra, trong nghiên cứu của Jamaludin và ctv (2020) thực hiện chiết xuấtcác hợp chất sinh học trong trái nhàu bằng áp suất thủy tĩnh cao sử dụng ethanollàm dung môi trích ly Kết quả thu được cho thấy năng suất chiết tăng lên, rút ngắnthời gian chiết và giảm tiêu thụ dung môi ở nhiệt độ phòng Tuy nhiên chi phí đầu

tư thiết bị khá cao cũng là vấn đề cân nhắc khi đưa vào ứng dụng trong côngnghiép.

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Theo báo cáo của tác giả Nguyễn Trọng Thông và ctv (2005), tác giả chỉ báo

cáo quá trình trích ly các chất trong quả nhàu bằng các dung môi hoá học, chưa đềcập đến quá trình tinh sạch loại bỏ dung môi nên rất khó có thé ứng dụng đượctrong thực phẩm Kết quả này rất hữu ích cho những nghiên cứu tiếp theo trích lybằng các phương pháp tiên tiến, thân thiện với môi trường, đồng thời nghiên cứu

phương pháp chế biến và bảo quản các hoạt chất sinh học có trong quả nhàu nhằmứng dụng vào trong thực phẩm và/ hoặc thực phâm chức năng.

Nghiên cứu gần đây nhất là trích ly các hợp chất sinh học từ trái nhàu bằngenzyme có tiền xử lý siêu âm cho thấy bốn yếu tố khác nhau liên quan đến quá trìnhchiết xuất bằng enzym trong nước của các hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm

tổng số polyphenol, tông số flavonoid, tổng saponin và vitamin C, từ bột trái nhàu

đã được xử lý trước bằng siêu âm đã được kiểm tra Nghiên cứu cho thấy rằng cácđiều kiện chiết xuất bằng enzym thích hợp nhất đối với hàm lượng của các hợp chấthoạt tính sinh học thu được ở nồng độ enzym (hỗn hợp pectinase và xenlulaza, 1: 1,w/w) ở0,5% trọng lượng khô (dw), tỷ lệ nước trên bột là 16/1 (mL / g) và nhiệt độ

ủ ở 60°C trong 45 phút khi tiền xử lý bằng siêu âm được cố định ở 50 + 5°C trong

10 phút Trong những điều kiện đó, hàm lượng cao nhất của tông số polyphenol,flavonoid, saponin và vitamin C được tìm thấy tương ứng là 12,53 + 0,09 mg

GAE/g dw, 6,45 + 0,61 mg QE/ g dw, 56,02 + 2,45 mg AE/ g dw, va 1,04 + 0,09

mg AA/ g dw (Ho va ctv, 2022).

Nhìn chung, kết quả cho thay lợi ích sức khoẻ của cây nhau do có chứa nhiềuhợp chất sinh học có lợi cho sức khoẻ con người Tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếutập trung vào thành phần của các hợp chất sinh học có trong rễ, lá cây nhàu cũngnhư các hoạt tính được liệu và thử nghiệm lâm sàng về chống ung thư và khángviêm của chúng (Su và ctv, 2005) Nghiên cứu về trái nhàu cũng như các phươngpháp trích ly các hợp chất sinh học trong trái nhàu hiệu quả, thân thiện môi trường

van còn hạn chê và cân khai thác nhiêu hơn.