Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Chẩn đoán và phát hiện virus OFV (Orchid Fleck Virus) và CymCV (Cymbidium mosaic virus) gây hại trên cây hoa lan tại tp. hồ chí minh bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

Hiện nay, trên thế giới phát hiện ít nhất 30 loài virus có gây hại cho cây hoalan đã được ghi nhận trong đó có đáng chú ý có loại virus đốm vòng OFV Orchidfleck virus và CymMV Cymbidium

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÈ TÀI: CHAN DOAN VA PHÁT HIỆN VIRUS OFV (Orchid Fleck Virus) VÀ CymMV (Cymbidium mosaic virus) GAY HAI TREN CAY HOA LAN TẠI TP HO CHÍ

MINH BANG KY THUAT MULTIPLEX RT-PCR

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : LE BÙI TRUNG TÍN

Mã số sinh viên : 18126178

Niên khóa : 2018-2022

TP Thu Đức, 8/ 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

DE TÀI: CHAN DOAN VÀ PHAT HIỆN VIRUS OFV (Orchid Fleck Virus) VA CymMV (Cymbidium mosaic virus) GAY HAI TREN CAY HOA LAN TAI TP HO CHi MINH BANG KY

THUAT MULTIPLEX RT-PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

GS TS BÙI CÁCH TUYẾN LÊ BÙI TRUNG TÍN

TS PHAM ĐỨC TOÀN

TP Thủ Đức, 8/2023

LỜI CẢM ƠNLời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Bangiám hiệu Trường Đạihọc Nông Lâm Thành phó Hồ Chi Minh, thay Dinh Xuân Phát -Trưởng Khoa Khoahọc Sinh học, cô Lê Thị Diệu Trang - cố van học tập lớp DH18SHBva toàn thé quýthầy cô đã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trongbốn năm học đại học.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS TS Bùi Cách Tuyến và TS.Phạm Đức Toàn, những người thầy đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và chia sẻ kinhnghiệm, luôn quan tâm, theo dõi, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện cũng như hỗtrợ kinh phí dé giúp tôi sửa chữa và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp Cam ơn thay đã

là điểm tựa, là tắm gương cho tôi để ngày càng hoàn thiện hơn Tôi xin chân thành

cảm ơn anh Trương Quang Toản và các anh chị, các bạn cùng làm việc trong Phòng

thí nghiệm Sinh hoc phân tử (A204), viện NC CNSH và Môi trường, trường DH

Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, và các bạn lớp DH18SH đã hỗ trợ, chia sẻ kinhnghiệm và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm đề tài Sau khi nghiên cứu

đề tài và kết thúc khóa học, em đã học hỏi và tích lũy được kiến thức và kinhnghiệm từ Thay cô đi trước dé hoàn thiện và phát triển bản thân Bên cạnh đó, đâycũng là cơ hội giúp em nhận ra mình cần hoàn thiện thêm những gi dé chuan bị cho

một hành trình dài phía trước.

Do kiến thức của bản thân còn hạn chế và thiếu kinh nghiệm thực tiễn nên nộidung bài nghiên cứu khó tránh những thiếu sót Em rất mong nhận sự góp ý thêm từquý thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Lê Bui Trung Tin , MSSV:18126178, Lớp: DH18SHB (Số di động:

0947167094, Email : 18126178@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc khoa Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tôi xin cam đoan: Đây là khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệm trước

hội đồng về những cam kết này

Tp.Hồ Chí Minh ngày tháng năm 2023

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT

Đến nay loài người đã biết được trên 750 chi với 35000 loài lan tự nhiên và 75000giống lan do kết quả chọn lọc và lai tạo Việt Nam với khoảng 1003 loài phong lanhiện có Hiện nay, trên thế giới phát hiện ít nhất 30 loài virus có gây hại cho cây hoalan đã được ghi nhận trong đó có đáng chú ý có loại virus đốm vòng OFV (Orchidfleck virus) và CymMV (Cymbidium mosaic virus) được phát hiện nhiều trên hoa langây ảnh hưởng đến chất lượng và giá trị của loài hoa lan Hiện nay ở nước ta chưa cóphương pháp hay một quy trình cụ thé va đáng tin cậy dé có thể phát hiện virus OFV

va CymMV Vì vậy cần có một phương pháp đáng tin cậy, có hiệu quả cao, phát hiện

virus OFV và CymMV nhanh chóng và chính xác nhằm phát hiện cây đã bệnh, đã cóbiểu hiện hoặc chưa có biểu hiện nhằm cách li với khu vực trồng và có biện pháp xử lýphù hợp Với những lí do trên tiến hành thực hiện chan đoán va phát hiện virus OFV

(Orchid fleck virus) và CymMV (Cymbidium mosaic virus) gây hại trên cây hoa lan tại

Tp Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR Kết quả thống kê cho thấy có sựhiện điện của CyzzÄ⁄V trên 30 mẫu là 18/30 (Chiếm 60%) trong đó giống Dendrobium

là giống nhiễm CymMV nhiều nhất Giải trình tự gen sản phẩm PCR và so sánh kết quảtrên genbank cho thấy tỉ lệ tương đồng của CymMV được phát hiện so với trình tựCymMV đã được công bồ có sự tương đồng là 97,81% Xây dựng thành công quy trìnhmultiplex RT-PCR với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 63°C, thời gian bắt cặp là 60 giây,nồng độ primer CymMV là 0.2 uM Quy trình mang lại hiệu quả và độ chính xác cao,tiết kiệm rất nhiều về công sức, thời gian cũng như chi phí so với khi tiến hành kiểmtra đối với từng đối tượng virus, nâng cao khả năng phục vụ cho công tác quản lý dịch

bệnh trên cây lan.

Từ khóa: lan, CymMV, OFV, Multiplex RT-PCR.

11

Up to now, humans have known over 750 genera with 35000 species of natural orchids

and 75000 orchid varieties as a result of selection and hybridization Vietnam with about

1003 existing orchid species Currently, in the world, at least 30 species of viruses that are harmful to orchids have been detected in the world including notably OFV (Orchid fleck virus) and CymMV (Cymbidium mosaic virus) Many detections on orchids affect the

quality and value of orchids Currently in our country there is no specific and reliable

method or process to detect OFV and CymMV viruses Therefore, there is a need for a reliable, highly effective method to quickly and accurately detect OFV and CymMV virus

to detect diseased plants, showing or no symptoms, to isolate them from the growing area and take appropriate action For the above reasons, we have carried out diagnostics and detection of OF V (Orchid fleck virus) and CymMV (Cymbidium mosaic virus) harmful on orchids in Ho Chi Minh City by Multiplex RT-PCR technique Statistical results showed that the presence of CymMV on 30 samples was 18/30 (accounting for 60%) of which Dendrobium variety was the most infected with CymMV The PCR product gene sequencing and comparing the results on genbank showed that the similarity rate of CymMV detected compared with the published CymMV sequence had similarity of 97.81% Successfully built a multiplex RT-PCR procedure with an optimal annealing

temperature of 63°C, a pairing time of 60 seconds, and a primer CymMV concentration of

0.2 uM The process brings high efficiency and accuracy, saving a lot of effort, time and cost compared to testing for each virus object, improving the service ability for management disease management on orchids.

Key word: Orchids, CumMV, OFV, Multiplex RT-PCR.

MỤC LỤC

CO KT sang iocaachuitếggoniGöngnùfsrdiudizĐfniirgGSSntXSfthlezrlrgdiggldiohsirlidiiggetotäi<ög9ugimgf iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN -5 2222+222 22222 t re ii

Poo Ol songsssssstrisnssisdgERgiSISEESSNSRSHEIGRRGESSIHUDAGISSGIRGGIDDNHHSEIDSGHEDSIRENGHDEDHEHEIDIHSĐESIEBESSHIGRSOSGGDEĐ0S43 iv MUC LUC 94 V

DANH BAGEL CÁC CHỈTVIẾT TẤT —ekeerrrrniececekE.recreerrreee viiTIANH BCH ĐẶC ETN sre carrcarnonnsarensscencerenennoneniumnenvceaveicvensenccarrarsmeneennensnomeene viiiTOE BH AIG bannggengibietgiiseoifgsdiingtdsonsgi0i03210010300001005049/0013000080/0g8g1 ix

eh y1 1111.1 |

1.1.Đặt vấn đề - 5c c1 12211211211211211211 1111211 112121 1 1212111 1e cecrcrereg | 1.2 Mục tiêu đề tài - 2 2 S1 2x 2212211211211211211211211211111111111112121121121212121 21c ye 2

LS NGI đUN1£ THUG 160 esgannaissdniietoioniTtiDIENT0E3855G0SENSD2D4GHSMISRNISWHHHOTBIRSOHSMOSMQBNSESS0 Đ2JĐDANGE 2

Chuong II TONG QUAN IV tiệiPi 0” ốốố ốc 3

Zell Plan leal, hoa HOC ieeweruncneenee eae renee: 3

2.1.2 Nguồn gốc - phân bố của cây hoa latie cesscsscsscessessessecsessesssssessessssessecsessessessesseesecseeees 3 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây hoa lan o cecceccescescsssessessessessesseesessesessecsessessessessessecsveaee 5 2.1.4 Các yếu tô ngoại cảnh ảnh hưởng đến cây hoa lan - 2-22 ©22222+222222z222zzczz2 10 2.2.1 Một số virus gây bệnh trên lan - 2 2¿©2%+2E2EE9EE12E122127112212211221211211211 22c 2 13

2.2.2 THEW CHUMNZ -cc-roersesencnnnsrrertennegrespenseensonesnssnsennensentanssensnasentonssnsenseennasnneseestnenssenannenei 13

2.3 Sơ lược về virus OFV và CYMMD ooccccccccccsssssesssessesssessessesssessessseesesssessussseesiessesssesseeasecseeess 14 2.4 Kỹ thuật chan đoán bệnh virus 2-2-2 +s2+22+EE+EE£EE£EE2EE22E12171121121121121121111 21 xe 16 2.4.1 Kỹ thuật chân đoán dựa vào triệu chứng - 5-5 cv 222201102111 cckeo 16 2.4.2 Kỹ thuật chân đoán virus bằng kính hiển vi quang học -2 2 2222225522 16

2.4.3 Kỹ thuật chan đoán bằng các xác định acid nucleic -2¿©22z222z+2szz2z+z2zzzzzse2 16

2.5 POR, RT-PCR va Multiplex real-time PỚR cá cv SS022112122 0 162.30202616 02/056 17

2.5.1 Kỹ thuat PCR se senaesreooaiĐDLGISESESSAgE11230588040101315GESRSEASSSEISESEENSSINSSSIESEBIRSSSGG3403302310138.80L 17

5,5,5, Phương pháp BVP CI or ecenecarsinessnrrevirecorssniecovnirenoibeesvirnsteeeneseesnnntessoeveomevteecstanniccerstevess 18 2.5.3 Phương pháp Multiplex real-time: PGR ssis.issosscssssnisvesssesveseorsmnnvransasnnssrvs dáng 0416150051550 883056 18

2.6 KY thuật:giãi trình tt DNA ssc cssssessvesnseostessestsnssssnenpsves con eawesmesasnvansadsosorecnuusbivennseuenscestits 19

CHUGNG 9 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHẬP ecesssisnasecscmemssuseuentrmianscssimnemaniniet 20

3.1 Thời gian va dia điểm nghiên COU o.oo cccccscescesseeseeseessessessessessessessessessessusseesesssessessesseeees 20 3.2 Vật liệu và hoá ChAt oo eececccccceccessescesessssssessessessessessscscssssvesscsssssesseseeseessessecscsessecseeseeseeseesees 20

3.2.1 48006 .305i0ả 11 20

A KHẨN ae 25 3.2.3 Thiết bị và đụng cụ ¿- 252221221 21221121121121121121121121111111111111111111211211211 1c re 25 3.2.4 Xây dựng quy trình phát hiện virus OFV và CymM gây bệnh trên cây hoa lan bằng kỹ

"000030 111 28

Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 22©22¿22222E222E222E222E 222x222 30

1.1; Lý trích RNA tổng số lữ mô TH creer ccxteancepescerecperseonsvecemansenncennmenenieneensenarerentenes 30

0i: 01.j 190/008 6 31 4.3.Phát hiện sự hiện điện của virus CymMV và OFV trên mẫu có biểu hiện nghi ngờ nhiễm

virus thông qua phương pháp RT-PCT - +: 252 2222121121 51211125121 21 11 re 32

4.4 Xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR dé phát hiện CymMV và @FV 34

Chương 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, 2- 22 5222E22E2zzzzszrssrxrzrszrsers-e - 3Ô

es ve neeeeeeeaeesoscnnrsetntBioctotiMitSnSSieSiEEGSSlnnttvfirEfXGSisSiSiMSESeiisldrsjo2g02Si6G01033:360G0iGnE 39

TH | nggaynsaogorrtrdnoi G0 GGENEUEIGENGAGSIEIIDAURGGREGEGRESStgyAntutyngi 39

TÀI LIEU THAM KHẢO 2-22 5S22E22EE2EE22E122512112211211211211211211211211 21 c0 40

PHU LUC sáxác6gne gõ ng g0 G11 G0 Gà 95g73 E034 I435131IAX4ESSSB33351315393349135551S8SESESEXES45133312833E1033 1

: Deoxyribo nucleic acid

: Ethylene diamine tetraacetic acid

: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

: messenger Ribonucleic acid

: National Center for Biotechnology Information

: Nucleotide

: Cymbidium mosaic virus

: Orchid fleck virus

: Polymerase Chain Reaction

: Pineapple Closterovirus

: Ribonucleic acid

: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

: Thermus aquaticus - polymerase

: Tris-borate- Ethylene diamine tetraacetic acid

: Melting temperature

Vil

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HìnH,2.1; Cay 108 atl scccancwncamnnwnmmaance aime nase aon ares SGSREBI3S830845838880/6083 3

Hình 2.2 Minh họa các cơ quan sinh dưỡng của cây hoa lan (Cam nang cây trong) 5

Hinh 2.3 Minh hoạ cơ quan sinh sản của cây hoa lan eee 55c +csscsrses 9 Hình 2.4.Triệu chứng khi nhiễm OFV (K S Kubo) - 2-2-5 25225252z2+2zzzz5+<: 14 Hình 2.5 Các triệu chứng CymMV trên Phalaenopsis SSP (Sue Bottom, 2014) 15 Hình 2.6 Chu ky BếHH:CỦáa Cyl, suasnnsnBi da Sh041168583130136403/6608389986a4690631015338863/80988331838888 16 Hình 2.7 Minh hoa quá trình PCTR: 2 5< 2221321223 1221121 5511531221121 151 511 1 21c, 17 Hình 3.1: Danh sách 30 mẫu lan đã được thu thập (1-30) - 25

Hình 4.1 Kết quả điện di 30 sản phẩm PCR của eDNA -cs-cs-cc-cs-cc 3 ÏHình 4.2 Kết quả điện di PCR kiểm tra virus CyzzÄ⁄ƒ trên mẫnu - 32Hình 4.3 Kết quả điện di PCR kiểm tra virus OFV trên mẫu - 2 225522 34

Hình 4.4 Sản phẩm RT-PCR của 10 chu trình nhiệt -2- 5252 522522522522522522 36

Hình 4.5 Kết quả điện di của 3 mốc thời gian và nhiệt độ bắt cặp khác nhau 36Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm mutiplex RT-PCR 52©52555-55-c+- 37

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 3.1 Thống kê các mẫu lan thu được 2-2 222+22z+S++E++E++E+22+2z+zz+zzxzzxez 20Bang 4.1 Nồng độ RNA tổng số 2-522 2522222222 22Eerrrrrrrrrrerrrrrerre 3Ô

Bang 4.2 Trình tự sản phẩm RT-PCR của CymMV 2+©2¿©5255225225z2z>z+ss+2 33

Bang 4.3 Kết qua phân tích BLAST của trình tự C4 2-2222+222222z2zzzczzcs 33

Bảng 4.4 Các đặc tính cơ bản của cap pDTII€T - 5 52552 +22**++<+seeseeeseerssercee2

Bang 4.5 Kết qua phân tích BLAST của 2 primer CY505 và O160 35Bang 4.7 Kết quả multiplex RT-PCR trên 30 mẫu lan 22 2 2255z22zz5+2 38

1X

CHƯƠNG L MỞ ĐẦU1.1.Đặt vấn đề

Trong các loại hoa được trồng phổ biến, hoa lan được biết đến như một loài hoakhông chỉ ở vẻ đẹp, hương thơm, màu sắc đa dạng mà còn có giá trị kinh tế cao Đếnnay loài người đã biết được trên 750 chi với 35000 loài lan tự nhiên và 75000 giốnglan do kết quả chọn lọc và lai tạo Việt Nam với khoảng 1003 loài phong lan hiện có,đây là nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú phục vụ tốt cho công tác chọn tạocác giống hoa lan mới Tuy nhiên, hầu hết các loài lan này chỉ được khai thác và nuôitrồng trong điều kiện tự nhiên, chưa được áp dụng các biện pháp kỹ thuật nên năngsuất, chất lượng hoa không cao, chưa đáp ứng được nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng.Trong khi các giống lan nhập nội lại có các ưu điểm như sinh trưởng, phát triển khỏe,sản lượng hoa cao, chất lượng hoa tốt: hoa to, màu sắc đẹp, đa dạng, độ bền hoa kéodài và điều khiển ra hoa được vào các dịp lễ Tết, nên đã mang lại hiệu quả cao chongười trồng lan Cây hoa lan là thực vật thuộc bộ Asparagale, là loài thực vật có hoa,lớp thực vật một lá mầm Đây là một trong những họ lớn nhất của thực vật, chúngphân bồ khắp nơi trên thế giới Từ một số loài chính bằng việc lại giống trong tự nhiên

và cả nhân tạo đã tạo lên nhiều loại mới, một số loài là đột biến từ các loài hiện tại Họ

này được chia thành năm phân họ: Orchidoideae, Epidendroideae, Cypripediodeae,

Vanilloideae, và Apostasiodeae Hoa lan được nhiều người ưa chuộng vì vẻ đẹp đặcsắc và các hình thức đa dạng của chúng Hiện nay, ngành công nghiệp về lan đang có

xu hướng phát triển thành một ngành thương mại và phát triển trên toàn thế giới Lanđược nuôi trồng ở nhiều khu vực khác nhau với nhiều quy mô lớn nhỏ khác nhau từcác khu công nghiệp, trang trại đến các nhà lưới, hộ gia đình và áp dụng nhữngphương pháp chăm sóc từ truyền thống đến các phương pháp hiện đại Cùng với sựphát triển kinh tế từ cây hoa lan thì các vấn đề bệnh hại và cách kiểm soát các bệnh hạitrên cây hoa lan ngày càng được chú trọng Hiện nay, trên thế giới phát hiện ít nhất 30

loài virus có gây hại cho cây hoa lan đã được ghi nhận, trong đó có đáng chú ý có loại

virus đốm vòng OFV (Orchid fleck virus) và CymMV (Cymbidium mosaic virus) đượcphat hiện nhiều trên hoa lan gây anh hưởng đến chat lượng va giá trị của loài hoa lan

Việt Nam là một đất nước nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới, có khí hậunhiệt đới ẩm gió mùa là điều kiện thích hợp cho các loại dịch bệnh phát triển Cùngvới đó, lan là loài thực vật có giả hành (thân gia), là nơi dự trữ chất đinh dưỡng va

nước để nuôi cây, nơi đây là nơi quan trọng nhất của cây, rat dé bị virus xâm nhập va

gây hại.

Vì vậy cần có một phương pháp đáng tin cậy, có hiệu quả cao, phát hiện virusOFV nhanh chóng và chính xác nhằm phát hiện cây đã bệnh, đã có biểu hiện hoặcchưa có biểu hiện nhằm cách li với khu vực trồng và có biện pháp xử lý phù hợp Vớinhững lí do trên nên tiến hành thực hiện đề tài “Chân đoán và phát hiện virus OFV

(Orchid fleck virus) và CymMV (Cymbidium mosaic virus) gây hại trên cây hoa lan tại

Tp Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật RT-PCR”

1.2 Mục tiêu đề tài

Xây dung và hoàn thiện quy trình phát hiện sự hiện diện của virus OF V (Orchid

fleck virus) và CymMV (Cymbidium mosaic virus) gay hại trên lan bang ky thuat

Multiplex RT-PCR.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Xây dựng và hoàn thiện quy trình RT-PCR phát hiện sự hiện diện của từng loại virus CymMV và OFV gây hại trên hoa lan.

Nội dung 2: Xây dựng và hoàn thiện quy trình Multiplex RT-PCR trong chan

đoán phát hiện CymMV và OFV gây hại trên cây hoa lan.

Chương II TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Sơ lược về cây hoa lan

Chi (genus): Phalaenopsis

Tén khoa hoc: Phalaenopsis Blume

Hinh 2.1 Cay lan (1825)

Ho lan được xếp trong bộ Asparageles trong hệ thống APG II năm 2009 Phân loại họnày luôn luôn thay đối do các nghiên cứu mới vẫn tiếp tục nhận dang nhiều yếu tố

phân loại mới.

Hiện tai cây hoa lan đã được công nhận 5 phân ho:

Apostasioideae: 2 chỉ và 16 loài, tây nam châu Á

Cypripedioideae: 5 chi và 130 loài, khu vực ôn đới của thé giới cũng như nhiệtđới châu Mỹ và châu Á

Vanilloideae: 15 chi va 180 loài, khu vực cận nhiệt đới và ôn đới âm ướt, miềnđông Bắc Mỹ

Epidendroideae: khoảng 650 chi và khoảng 18.000 loài, khắp thé giới

Orchidoideae: 208 chi và khoảng 3.755 loài, khắp thế giới nhận dạng nhiều yếu

tố phân loại mới

2.1.2 Nguồn gốc - phân bố của cây hoa lan

Trung tâm dữ liệu Thực Vật Việt Nam, lan thuộc họ Orchideceae là một trong

những họ lớn nhất của thực vật và có các chi mọc trên toàn thé giới (ngoại trừ vùngCực) Họ phong lan phân bố từ 68° Bắc đến 56° Nam, nghĩa là từ gần cực Bắc nhưThuy Điển , Alaska, xuống tận cuối cùng ở cực nam của Australia Tuy nhiên tập trungphân bố của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt châu Mỹ và Đông nam á

Ngay ở các vùng nhiệt đới họ phong lan cũng phân bố rộng khắp từ vùng đầm lầy sátbiển, hồ qua các đôi núi thấp lên các vùng núi cao Mặc dù đa số các loài lan chỉ mọc ở

độ cao dưới 2000 m so với mặt nước biển, song có một số ít loài sống cả ở độ cao5000m so với mặt nước biển (ở Colombia có một số loài phong lan sống ở núi quanhnăm tuyết phủ)

Đến nay loài người đã biết được 750 chi, có khoảng 25.000 loài Qua kết quả lai tạo vàchọn lọc, các nhà chọn giống và trồng lan đã bổ sung thêm 75.000 loài lan mới (Saprorbx-Tea huntum,1953; Camphell 1994) Những cây lan là những cây bụi sống trên mặtđất được gọi là địa lan hoặc bám vào thân cây, cành cây được gọi là phong lan Họ lanphân bố nhiều nhất trong 2 vùng nhiệt đới, có 250 chi và 6.800 loài Các loài đặc sản ởchâu Mỹ gồm: Cattleya (60 loài), Epidendrum (500 loài), Odontoglosum (200 loài) ở

vùng khí hậu ôn hoà số lượng loài giảm đi nhanh chóng và rõ rệt Bắc bán cầu có

khoảng 75 chi và 900 loài Nam bán cầu có khoảng 40 chi và 500 loài ( F.Gbriger,1971) Lúc đầu lan chí được khai thác nhằm mục đích làm được liệu và hương liệu.Người ta cứ tưởng rằng cây lan được biết đến đầu tiên ở châu Âu qua bản viết tay bằng

chữ Hy Lạp (Enenquiry into plans) của Theophrastus khoảng 379 đến 285 trước công

nguyên) nhưng thực ra cây lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông khoảng từ 551

— 497 trước công nguyên.

Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Hoa là Kiến lan (vì được tím ra đầu tiên ởPhúc Kiến) đó là Cymbidium Ensifonymum là một loài bán địa lan ở phương Đông lanđược chú ý đến vì vẻ đẹp duyên dang của lá và hương thơm tuyệt vời của hoa (vì quanniệm thấm mỹ thời ấy chuộng tao nhã cứ không ưa phô chương sặc sỡ)

Họ Orchidaceae phân bố rộng khắp thế giới, gần như có thể có mặt trong mọimôi trường sống, ngoại trừ các sa mạc và sông băng Phan lớn các loài được tìm thấytrong khu vực nhiệt đới, chủ yếu là châu Á, Nam Mỹ và Trung Mỹ Chúng cũng đượctìm thấy tại các vĩ độ cao hơn vòng Bắc cực, ở miền nam Patagonia và thậm chí trêndao Macquarie, gần với châu Nam Cực

Việt Nam có hơn 900 loài phong lan phân bồ rộng rãi trên cả nước Chúng cókhả năng sinh trưởng, phát triển tốt cho hoa đẹp, có thé sử dung làm nguôồn gen quýcho công tác lai tạo giống hoa lan

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây hoa lan

2.1.3.1 Cơ quan sinh dưỡng

NHÓM ĐA THAN NHÓM ĐƠN THÂN

— thân giả (giả hành)

mai ( tuỳ thuộc vào từng loài) đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày Hệ

rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung của cơ thé Nhiều loài lan rấtnhỏ bé, hình dạng xấu xí, khó khăn lắm mới nhận được chúng trong kẽ nứt của vỏ cây

gỗ, trên các cành, nhánh cao tít Hệ rễ cũng nhỏ, đan thành búi, ngược lại ở các loài

phong lan có kích thước lớn hay trung bình, hệ rễ khí sinh phát triển rất phong phú,mọc rat dai, mập, khoẻ vừa giữ cho cơ thé khỏi bị gió làm lung lay, vừa làm cột chống

đỡ cho thân vươn cao.

Đề làm nhiệm vụ hap thu dinh dưỡng, chúng được bao bọc bởi một lớp mô hútday, âm, bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí Với lớp mô xốp đó, rễkhông những có khả năng hap thu nước mưa chảy dọc trên vỏ cây mà còn lay được

nước lơ lửng trong không khí (sương sớm hay hơi nước).

Nhiều loài có hệ rễ đan, bén chang chit, là nơi thu gom mun để làm nguồn dựtrữ chất đinh dưỡng cho cây Ngược lại, có loài mọc bò dài, hệ rễ có khi buông thongxuống theo các đoạn thân, cứng hoặc mảnh mai, treo lơ lửng trong không khí kéo đài

xuống tận đất và hoạt động phá rễ của cây khác Ở một số loài lan có thân, lá kémphát triển (thậm chí tiêu giảm hoàn toàn) hệ rễ phá triển dày đặc và kiêm nhiệm luôn

cả vai trò quang hợp Rễ có dang det, bò rất dài, màu xanh như lá

Đặc biệt các loài phong lan sống hoại, bộ rễ có hình dạng, cấu trúc khá độc đáo

Nó có dang búi nhỏ với những voi hút ngắn, day đặc dé lay được đinh dưỡng từ nhữngđám xác thực vật thông qua hoạt động của nam Tuy nhiên, có một ít loài tuy sốnghoại, nhưng cây có thể dài đến vài chục mét, nó có khả năng leo, bò rất cao

Thân lan:

Lan có 2 loại thân: đa thân và đơn thân.

Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành) Đó là

bộ phận dự trữ nước và các chất dinh dưỡng dé nuôi cây trong điều kiện khô hạn khisống bám trên cao

Củ giả rất da dang: Hình cầu hoặc hình thuôn dai xếp sát nhau hay rải rác đềuđặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả

Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa day dịch nhay, phía ngoài là lớp biểu

bì với vách tế bào dày, nhẫn bóng bảo vệ, tránh sự mat nước do mặt trời hun nóng Da

số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp

Thân rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang lá.Theo M.E Pñzer (1882) (Trần Hợp, 1990), phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộcloại sinh trưởng hợp trục (nhóm không thân) Thân này gồm hệ thống của nhiều nhánhlâu năm, với bộ phận nằm ngang, bò dải trên giá thé hay ẩn sâu trong lòng đất, gọi làthân rễ Ngược lại, rất ít khi gặp các loài phong lan sinh trưởng đơn trục ( nhóm cóthân) nghĩa là sự sinh trưởng của trục chính không giới hạn, làm cho thân rất dài, cơthé khó có khả năng duy trì được tư thế thang đứng, nó phải nhờ đến các rễ chống đỡ

để vươn cao, nếu không, nó đành phải bò dải hay leo cuốn Đôi khi thân của một sốloài lan rất ngắn, bị che khuất bởi hệ thống lá hay rễ mọc thành bụi dày

Ở các loài phong lan sống phụ, có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả (giahành) Đó là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng dé nuôi cây trong hoàn cảnh khôhạn khi sống bám trên cao Củ giả rất đa dạng, hoặc hình cầu, thuôn đài, xếp sát nhauhay rải rác, đều đặn (Bulbophylum) hay hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành mộtthân giả ( Dendrobium) Kích thước của củ giả cũng rất biến động, từ dang củ rất nhỏchỉ lớn bằng đầu chiếc kim găm (Bulbophylum) đến to bằng chiếc mũ người lớn

6

(Peristeria elata) Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm

nhiệm vụ quang hợp.

Lá lan:

Hầu hết các loài phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ

hệ thống lá, lá mềm mại, duyên dáng và hấp dẫn Lá mọc đơn độc, hoặc xếp dày đặc ở

sốc, hay xếp cách đều đặn trên thân, trên củ giả Hình dạng lá thay đổi rất nhiều, từ

loại lá mọng nước, nạc, dài hình kim, hình trụ đài, tiết điện tròn hay có rãnh, đến loại

lá hình phiến mỏng, dài màu xanh bóng, đậm hay nhạt tuỳ theo vị trí sống của cây, đặcbiệt rất hiếm loại lá hình tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân Phiến lá trải rộng haygấp lại theo các gân vòng cung (như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa, hình chữV), những lá dưới sát gốc thường tiêu giảm đi chỉ còn những bẹ không có phiến haygiảm han thành các vay

Về màu sắc, phiến lá thường có màu xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có

màu khác nhau thường mặt dưới lá có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lá khảm thêm

nhiều màu sắc sặc sỡ Nhiều loài lan lại có lá màu hồng và nỗi lên các đường vẽ trắngtheo các gân rất đẹp

Phong lan, nhất là ở các vùng nhiệt đới thường trút hết lá trong mùa khô hạn.Lúc này cây ra hoa hay sống ân, chờ mùa mưa đến sẽ cho chồi mới Một số loài lansống trong đất có chu kỳ sống rất đặc biệt, xen mùa lá với mùa hoa Khi cây ra hoatoàn bộ lá đều chết khô đi và khi hoa tàn, củ giả sẽ cho chồi, lá mới

Cấu tạo của hoa lan cực kỳ phong phú và hấp dan Ta có thé gặp nhiều loài mamỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm mộtbông, nhưng đa số các loài lan đều nở rộ nhiều hoa, tập hợp thành chùm phân bố ở

đỉnh thân hay nách lá.

Mặc dù muôn hình, muôn vẻ nhưng nếu ta quan sát tông quát hoa của bất kỳ cây lan

nào cũng đều thấy có một tô chức đồng nhất của mẫu hoa 3 là một kiểu hoa đặc trưngcủa lớp một lá mam, nhung da biến đổi rất nhiều dé hoa có đối xứng qua một mặtphẳng Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh hoa ngoài cùng gọi là 3 cánh đài,thường có cùng màu sắc và cùng kích thước với nhau, một cánh đài nằm ở phía trênhay phía sau của hoa gọi là cánh đài lưng, hai cánh đài còn lại nằm ở hai bên gọi là

cánh dai cạnh hay cánh đài bên Ba cánh đài lẽ ra phải nhỏ và có mau xanh như những

loài hoa khác, nhưng ở hoa lan chúng lại to và có màu sắc, cùng kích thước với nhau

dược gọi là cánh đài dạng cánh Nam kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 2 cánhhoa, thường giống nhau về hình dạng ,kích thước cũng như màu sắc nên được gọi là 2cánh bên, cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới của hoa, thường có màu sắc vàhình dạng đặc biệt khác hắn 2 cánh kia được gọi là cánh môi hay cánh lưỡi Chínhcánh môi quyết định phan lớn giá trị thâm mỹ của cả hoa lan.

Ở giữa hoa có một cái trụ nỗi lên, đó là bộ phận sinh dục của hoa, giúp duy trìnoi gidng của cây lan Trụ ấy gồm cả phan sinh duc đực và cái nên được gọi là trục —hợp nhuy Phần đực nằm ở bên trên của trục, thường có cái nắp che chở, bên trongchứa phấn khối màu vàng, số lượng phấn khối biến đổi từ 2,4,6 đến § có dạng thuônhay cong lưỡi liềm, đôi khi thuôn dài, có đuôi Phan khối do nhiều hat phan dính lạivới nhau Số lượng, hình dạng, kích thước của phấn khối thay đổi tuỳ theo giống và

loài lan.

Hoa phong lan có bầu hạ, thuôn dài kéo theo cuống (rất khó phân biệt giữa bầu

và cuống hoa) Sự vặn xoắn toàn bộ hoa trong quá trình phát triển là đặc điểm của bầu.Hoa thường bị vặn xoắn 1800 sao cho cánh môi khi hoa bắt đầu nở hướng ra bên

ngoài, ở vào phía dưới, làm chỗ đậu thuận lợi cho côn trùng Rất ít khi gặp hoa vặn

3600 như loài Malaxia, Paludosa hoặc không vặn gì do cuống hoa rủ xuống như loài

Stanhopea, khi hoa nở, cánh môi hướng lên trên, nó thích nghi với loài côn trùng ưa

lộn đầu xuống khi chui vào hoa

Bầu hoa lan có 3 ô gọi là 3 tâm bì hoặc bì đính noãn trung trụ (ở các loài lannguyên thuỷ) hoặc đính noãn bên ở các loài lan tiến hoá hơn Trong bầu chứa vô sốcác hạt nhỏ li ti gọi là tiểu noãn nằm trên 3 đường, dọc theo chiều dài của 3 mép tâm

bì Sau khi thụ phấn, thụ tinh các tiểu noãn sẽ biến đổi và phát triển thành hat, trongkhi đó bầu noãn sẽ to phát triển thành quả

2.1.3.2 Cơ quan sinh sản

Hoa lan:

Cấu tao của hoa lan cực kỳ phong phú và hấp dan, ta có thé gặp nhiều loài màmỗi mùa chỉ có một đóa hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm mộtbông Tuy nhiên đa số các loài lan đều nở rộ nhiều hoa, tập hợp thành chùm Phân bó

ở đỉnh thân hay nách lá, gốc cuống chính, thường có lá bắc dạng vảy hay dạng mo.Cuống chính đôi khi rút ngắn lại làm cụm hoa có dạng tán giả, hay cuống chính vừangắn lại vừa mập, cụm hoa có dạng gần như hình đầu Ở nhiều loài có cuống rất ngắn

8

nên chùm hoa có dạng bông hay cuống chính vặn xoắn để hoa xếp theo đường xoắn

Hình 2.3 Minh hoạ cơ quan sinh sản của cây hoa lan.

Hoa lan có cấu tạo từ 7 bộ phận là 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ mang hoa

Người ta thường ít chú ý đến đài hoa vì nó không ảnh hưởng nhiều đến giá trị tham mỹ

của cây Tuy nhiên, chúng ta cũng phải công nhận đào hoa cũng góp phần không nhỏ

để tạo nên vẻ đẹp của cây, không không có đài hoa lan sẽ trở nên rất lạ Phần đài hoa

của lan Vandacoerulea, Vanda Onomea, Vanda Thananchai khá to, dài và tròn nhìn

rất bắt mắt Chúng có màu sắc nổi bật và rất ấn tượng Mỗi loài hoa lan sẽ có những

màu sắc đài hoa khác nhau

Cánh hoa:

Cấu tạo của hoa lanNhững cánh hoa lan chính là điều cuốn hút người xem nhấtkhi nhìn thấy chúng, mỗi bông hoa lan sẽ có cấu trúc 3 cánh cạnh bên đài hoa Và mộttrong những cánh hoa sẽ biến thành môi Cánh hoa thường rộng hơn đài hoa và nó là

bộ phận quyết định chính đến hình dáng cũng như vẻ đẹp của hoa phong lan

Một bông hoa lan đẹp sẽ được quyết định rất nhiều bởi cánh hoa, cánh đẹp hoa sẽ đẹp,

cánh xấu sẽ khiến hoa xấu đi rất nhiều Thông thường hai cánh hoa sẽ bằng nhaunhưng đôi khi chúng cũng có sự chênh lệch thay đổi

Masdevallia hay những loài thuộc giống Bulbophyllum có phần cánh hoa được

thu lại thành các cấu trúc mà mắt thường khó có thé nhận rõ được Với một số loài

phong lan cánh hoa có hình ruy bang dài khoảng 0,6m như Paphiopedium sauterianum

và Phragnipedium caudatum.

Môi hoa:

Cấu trúc hoa lan có gi đặc biếtSự biến đổi về hình dang của môi hoa rất da dang

và trong một hoa lan nó là bộ phận quan trọng nhất Chúng ta sẽ không thể nảo tìm

được hai bông boa có môi hoa giống hoặc gần giống nhau, chúng hoàn toàn khác biệt

Và bạn có biết là kết quả của việc thụ phấn thành công hay không phụ thuộc rất nhiều

vao cau tạo của môi hoa hay không

Môi hoa được tạo thành từ cánh hoa và biến dạng thành chúng, nó được đánh

giá là bộ phận đẹp nhất của hoa lan và quyết định nhiều đến giá trị thâm mỹ của cây Ở

loài lan Cattleya, Laelia, Phalus môi hoa có hình trụ Hay như lan Oncidium,

Odontoglossum thì môi hoa sẽ phát triển ở diện tích rộng hơn

Nếu bạn là người yêu thích lan Cattleya thì sẽ thấy môi của chúng rất đặc biệt, nó rất

đẹp, cầu kỳ và có nhiều mảu sắc khác nhau

Trụ hoa:

Đây cũng là một bộ phận tạo nên sự khác biệt cho hoa phong lan với những loài

hoa khác Trụ hoa chứa hai bộ phận sinh dục đực và cái của hoa lan Phần cái có chất

nhay, còn phần đực là tiểu nhụy mang phan khối Số lượng phấn khối thường là

2,4,6,8 và nó cũng là thành phần quyết định họ của lan

Quả và hạt lan:

Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt doc, có dạng từ quả cải dài đến hình trụ ngHat lan rất nhiều, nhỏ li ti Trọng lượng toàn bộ hạt trong một quả nang chỉ bằng 1/10

đến 1/1000 miligam và hau như không có trọng lượng

2.1.4 Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến cây hoa lan

Nhiệt độ:

Nhiệt độ tác động lên cây lan thông qua con đường quang hợp Thông thường

cường độ quang hợp tăng khi nhiệt độ tăng Chính vì vậy, khi nhiệt độ tăng cao làm

tăng nhu cầu hấp thụ dinh dưỡng của cây lan, do vậy trong mùa nắng cần tăng lượng

phân bón dé đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng gia tăng Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra

hoa của một số loài lan Tuy nhiên, nhiệt độ tăng quá cao làm cho quá trình quang hợp

10

bị ngưng trệ Nhiệt độ cao cùng với âm độ cao tạo điều kiện thuận lợi cho các loạibệnh hại phát triển.

Mỗi loài lan chỉ sinh trưởng và phát triển trong một khoảng nhiệt độ thích hợp

Căn cứ vào nhu cau nhiệt độ của từng loài lan mà người ta chia ra làm 3 nhóm:

Nhóm cây ưa lạnh: Gồm những loải lan chịu nhiệt độ ban ngày không quá140C, ban đêm không quá 13°C Những loài lan này thường xuất xứ từ vùng hàn đới,

ôn đới và các khu vực núi cao vùng nhiệt đới Vi dụ lan: Lycaste, Cymbidium

Nhóm cây ưu nhiệt độ trung bình: Gồm những loài lan thích hợp với nhiệt độ

ban ngày không dưới 14,5°C, ban đêm không dưới 13,5°C Vi dụ lan Vanda.

Nhóm cây ưa nóng: Bao gồm những loài lan chịu nhiệt độ ban ngày không dưới21°C, ban đêm không dưới 18,5°C Những loài lan này thường có nguồn gốc ở vùngnhiệt đới Da số lan Dendrobium sp.hiện trồng ở thành phố Hồ Chí Minh đều thuộc

nhóm này.

Ánh sáng:

Ánh sáng rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng nói chung,

lan nói riêng Tuy nhiên, khi cây lan tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng trực xạ (vào giữa

trưa) thường bị cháy lá, vì vậy khi trồng lan cần phải làm giàn che để giảm bớt cường

độ ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của một số loài lan Do đó,một số loài lan như Dendrobium, Oncidium, cần ánh sáng dé ra hoa nên một số nhavườn đã phơi nắng chúng đề ép cây ra hoa

Nhóm ưa sáng: Đòi hỏi ánh sáng nhiều, khoảng 100% ánh sáng trực tiếp như

loài Vanda lá hình trụ.

Nhóm ưa ánh sáng trung bình: Bao gồm các loài có nhu cầu ánh sáng khoảng50% đến 80% như các loài của Catleya, Dendrobium

Nhóm ưa ánh sáng yếu: Bao gồm các loài lan có nhu cầu ánh sáng khoảng 30%

như các loài của Phalaenopsis, Paphiopedilum.

Tuỳ theo nhu cầu ánh sáng của từng loại lan mà có cách thức làm giàn che chophù hợp đề đáp ứng nhu cầu ánh sáng của chúng

Tuỳ theo tuổi lan, yêu cầu về ánh sáng cũng khác nhau: Cây lan con giai đoạn

từ 0 - 12 tháng tuổi đang trong giai đoạn tăng trưởng thân lá chỉ cần chiếu sáng 50%,lan nhỡ từ 12 - 18 tháng tuổi cần chiếu sáng 70% và thời điểm ra hoa có thể cho chiếusáng nhiều hơn

Hướng chiếu sáng cũng rất quan trọng đối với lan Cây lan đặt trồng ở hướngĐông sẽ nhận nhiều ánh sáng buổi sáng tốt hơn nhiều so với cây lan đặt trồng ở hướngTây nhận ánh nắng buổi chiều Chính vi vậy, khi trồng lan trên sân thượng hay bancông ở phía Tây, cây lan kém phát triển và ít hoa Khi trồng lan cần bố trí hàng theohướng Bắc - Nam dé cây nhận được ánh sáng phân bố đầy đủ nhất.

Độ am:

Độ ẩm là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của các loàilan Các loài lan sống trong tự nhiên, sống nhờ vào nước mưa, hơi nước trong khôngkhí Do vậy, sự phân bố mưa trong năm có ảnh hưởng lớn đến đời sống của các loàilan Nước từ các trận mưa, từ không khí âm vào rễ, đi qua thân lá, di chuyền trong thân

và bốc hơi qua lá, sự di chuyên này giúp vận chuyền thức ăn trong cây Lượng nướcnày đối với cây lan vô cùng quan trọng nên phải thường xuyên tưới nước cho cây Nếuthiếu nước, quá trình quang hợp, hô hấp bị ngưng trệ Chính vì vậy, việc chọn địa điểmthích hợp cho vườn lan sẽ giúp ta giảm được nhiều công sức chăm sóc cho cây lan.Trong vấn đề trồng lan, yếu tố âm độ là quan trọng nhất, trong tự nhiên chính độ âm làyếu tố chi phối việc phân bố các vùng có cây lan Về yếu tổ độ âm có 3 khu vực cần

lưu ý:

Độ âm của vùng: Là am độ của khu vực rộng lớn, nơi thiết lập vườn lan Độ am

nay do diéu kién dia ly, dia hinh quyét định Nên chọn khu vực lập vườn lan có bờ mặt

diện tích bằng phẳng, thoáng mát Ví dụ vùng có sông ngòi, kênh rạch, rừng cây sẽ có

am độ cao hon vùng đôi trọc, đồng trồng

Độ 4m của vườn: Là âm độ của chính vườn lan Chọn nơi lập vườn lan gầnnguồn nước tưới Những vùng trồng mới có nhiệt độ khu vực cao như Củ Chi có thểtrồng cây, dây leo, trang bị hệ thống tưới quanh vườn lan dé nâng cao độ am vuon,thích hợp cho cây phat triển

Độ 4m trong chậu lan: Gọi là ầm độ cục bộ, do cấu tạo của giá thé, thể tíchchậu, chế độ tưới nước quyết định Ví dụ trong vùng khô hạn ta có thể sử dụng xơ dừa

dé trong lan, tang số lần tưới va lượng nước tưới Tuy nhiên, am độ cục bộ cao sẽkhông có lợi cho cây lan vì dễ gây úng thối cây Sự hài hoà về ẩm độ vùng trồng, âm

độ vườn sẽ giúp cho sự sinh trưởng của cây lan tốt hơn, hay nói cách khác, nó gópphần quyết định vào sự thành công của khu vườn Do đó, chọn địa điểm vườn thiết kếtrồng lan phù hợp sẽ giúp ta giảm rất nhiều chi phi trong khâu chăm sóc cây lan

12

2.2 Sơ lược về bệnh virus hại cây hoa lan

2.2.1 Một số virus gây bệnh trên lan

Nhóm virus Rod-shaped:

Tobamovirus: Odontoglossum ringspot virus (ORSV), Tobacco mosaic orchid strain (TMV-orchid).

virus-Potexvirus: Cymbidium mosaic virus (CymMV).

Tobravirus: Tobacco rattle virus (TRV), Potyvirus Bean yellow mosaic virus (BYMV), Dendrobium mosaic virus (DenMV), Clover yellow vein virus (CYVV), Turnip mosaic virus (TuMV), Vanilla mosaic virus (VaMV), Phalaenopsis chlorotic spot virus (PhCSYV).

Closterovirus: Dendrobium vein necrosis virus (DVMV).

Nhóm virus /sometric:

Tombusvirus: Cymbidium ringspot virus (CyRSV).

Tospovirus: Tomato spotted wilt virus (TSWV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Capsicum chlorosis virus (CaCV).

Carmovirus: Carnation mottle virus (Car MV).

Cucumovirus: Cucumber mosaic virus (CMV).

Nepovirus: Tomato ringspot virus (TomRSV).

Unassigned: Orchid fleck virus (OF V).

2.2.2 Triệu chứng

Khi bị nhiễm virus, lá lan sẽ xuất hiện các dém, vệt, đường và vòng bị nhiễmnắm và hoại tử trên lá Trên hoa có thé sẽ xuất hiện các đốm và vệt hoại tử cũng nhưmàu sắc bị vỡ hoặc thay đôi Bệnh virus có thé được biểu hiện trên tất cả các bộ phậncủa cây (Sue Bottom, 2014) Ngoài ra, biểu hiện của các triệu chứng virus có thể tiềm

an ở những cây lan phát triển tốt (Inouye, 2008)

Hiện nay không có phương pháp điều trị cho cây bị nhiễm virus Các biện phápđang được sử dụng phổ biến phát hiện ra cây lan nhiễm virus là tiêu hủy cây dé ngăn

nó lây nhiễm sang cây khác Đối với các cây có giá trị kinh tế cao, không thé thực hiện

biện pháp thiêu hủy, người ta sẽ sử dụng biện pháp cách ly, chăm sóc riêng biệt hoàn

toàn với các cây khác và tuân theo các biện pháp phòng ngừa dé tránh lây nhiễm cho

các cây không nhiễm bệnh, có thể bổ sung các nano đồng ngăn chặn sự phát triển của

virus.

2.3 Sơ lược về virus OFV và CymMV

Virus gây bệnh đốm hoại tử trên lan — OFV:

Orchid fleck virus (OFV) gây ra các triệu chứng đôm và đốm hoại tử hoặc hoại

tử ở nhiều loài lan trên toàn thế giới OFV được truyền qua nhện giả, Brevipalpus

californicus đóng vai trò là vector chính cho OFV.

Các hạt hình que có đường kính 32-40 nm, chiều dai 100-150nm Các tổnthương úa vàng và hoại tử hoặc đốm vòng ở lá và thân của cây hoa lan, quýt, cà phê.(Kubo và ctv, 2009) Bộ gen của OFV bao gồm hai phân tử 6431 (RNA1) va 6001nucleotide (RNA2) Mặc dù một số protein được mã hóa của Ó# có trình tự tương tự

như protein của rhabdovirus thực vật.

Hình 2.5 Các triệu chứng CymMV trên Phalaenopsis SSP (Sue Bottom, 2014).

Đây là loại virus lan phổ biến nhất gây bệnh cho rất nhiều giống lan Khi biểuhiện, triệu chứng của virus CymMV có thé gay ra hién tuong cac đốm hay các vệt dai

có màu nâu hoặc gây ra hiện tượng úa vàng trên lá Những vệt màu vàng tạo thành thékhảm hay những vệt lốm đốm Triệu chứng này xuất hiện trên cả mặt trên và mặt dướicủa lá Đôikhi những cây lan này có thể biểu hiện những vòng úa trong khi những loàikhác sẽ biểu hiện những vết đóm của bệnh Xuất hiện các mảng trũng có thể được quansát thay trênlá Khi đã nhiễm bệnh, dù một số cây bị nhiễm bệnh có triệu chứng nhẹhoặc không xuất hiện triệu chứng nhưng vẫn đủ virus để lây nhiễm sang các cây lâncận khác Điều này là do tình trạng héo úa và hoại tử có thé sẽ mat một khoảng thờigian để biểu hiện,tuy nhiên, virus vẫn có thể đã tồn tại trong cây nhưng không biểuhiện các triệu chứng rõ rang của bệnh ra bên ngoài Virus vẫn có thé được truyền từcác cây trồng cho nhau mặc đù có vẻ ngoài của chúng là hoàn toàn "khỏe mạnh"

Chu kỳ bệnh của CymMV: Đầu tiên virus xâm nhập vào lan từ các dụng cụ dé cắttia hoặc nhân giống cây Sau khi CymMV xâm nhập vào bên trong cây lan, virion mở ra

và liên kết với lớp vỏ protein tại 5 'SL 1 RNA Điều này cho phép virus kết hợp RNA của nóvào vật chủ và tế bào chủ bắt đầu tạo ra các hat virus (Verchot-Lubicz, 2007) Sau đó,virus bắt đầulây nhiễm các khung đọc như TGB1, TGB 2 và TGB 3, mỗi khung này hỗ trợkhả năng lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào khác trong phong lan (ViralZone,2012) Khi virus lây nhiễm TGB 1, nó cho phép virus di chuyên dé dang qua cácplasmodesmata Sau khivirus lây nhiễm TGB 2 và TGB 3, nó cho phép virus bắt đầu dichuyền qua từng lưới nội chất của tế bảo phong lan Ảnh hưởng đến các vị trí nảy cho

phép virus dễ dàng di chuyển qua từng tế bào thực vật Nhìn chung, sRNA đơn phân,

dương tính, từ virion kết nối đuôi 3 'của nó với đuôi 5' của vật chủ (Verchot-Lubicz,2007) Các bản dịch sẽ tiếp tục diễn ravà được tháo rời từ phần cuối của virion 5 ' Vớinhiều virion lưu hành khắp vật chủ, chicần một vết thương khác từ dụng cụ cắt để bắtđầu lây nhiễm sang một cây lan khác (Adams, 2004).

5) Virus sẽ tiếp tục di chuyến từ tế bào này

sàng tế bào khác trong vật chủ nhiễm bệnh,

va chỉ lầy nhiễm sang vật chủ khác khi bị

tốn thương bởi dụng cụ cắt và dụng cụ đó

Pa: tục sử dung tên cây khic.

1) Virus xâm nhập vào thực

vật thông qua các dung cụ nhân giống bị nhiệm virus.

4) Viron bắt dau lây

Hinh 2.6 Chu kỳ bệnh của CymMV.

2.4 Kỹ thuật chan đoán bệnh virus

2.4.1 Kỹ thuật chan đoán dựa vào triệu chứng

Bệnh cây do virus gây ra có thể dựa vào các đặc điểm riêng biệt của một loạibệnh do một số nguyên nhân gây ra Các này đòi hỏi người chân đoán cần phải amhiểu đặc tính của cây, nắm rõ biểu hiện của từng loại bệnh và biết cách phân loạichúng vì sẽ dé gây nhằm lẫn vì các loài virus gây hại có các triệu chứng giống nhau.2.4.2 Kỹ thuật chan đoán virus bằng kính hiến vi quang học

Để quan sát được tinh thé virus có kích thước nhỏ cần giải phẩu mô bệnh,nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học Nhưng khi thấy triệu chứng bệnhcây trồng đôi khi không phải một loại virus mà còn là nhiều loại virus khác nhau,khiến việc sử dụng kính hiển vi quang khó phân biệt các loại virus khác nhau, khôngphân biệt và nhận biết được loại virus mình chú ý

2.4.3 Kỹ thuật chan đoán bằng các xác định acid nucleic

2.4.3.1 Kỹ thuật PCR và RT-PCR

Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại đoạn DNA để xác định được

virus Phương pháp này linh hoạt, có độ đặc hiệu cao, độ nhạy cao nhưng giá thành hơi

cao Còn với virus có genome ở dang RNA cần được phiên mã ngược thành cDNA

16

trước khi thực hiện phản ứng PCR Còn RT-PCR là xác định những loài virus có bộ

gen RNA dé phiên mã ngược và khuếch dai để xác định loài virus

2.5 PCR, RT- PCR va Multiplex real-time PCR

2.5.1 Kỹ thuật PCR

Sự ra đời của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã biến đổi hoàn toàn khoahọc sinh học từ khi nó được phát hiện lần đầu tiên (Mullis, 1990) Lần đầu tiên, nó chophép phát hiện và sản xuất cụ thể một lượng lớn DNA Các chiến lược dựa trên PCR

đã thúc đây những nỗ lực khoa học to lớn như Dự án Bộ gen người Kỹ thuật này hiệnđang được các bác sĩ lâm sàng và nhà nghiên cứu sử dụng rộng rãi để chân đoán bệnh,nhân bản và giải trình tự gen, đồng thời thực hiện các nghiên cứu định lượng và bộ gentinh vi một cách nhanh chóng và rất nhạy cảm Một trong những ứng dụng y tế quantrọng nhất của phương pháp PCR cô điền là phát hiện mam bệnh

Ms (B)

Primers bind to template DNA strands

Taq polymerase synthesizes new DNA strands (c)

faae Peet ase? [2 )7^95955”'+

YN Mac V À

¿7% { ` : :

Hinh 2.7 Minh hoa qua trinh PCR.

(A): Biến tinh, (B): Bat cặp,(C): Kéo dài.

Nguyên tac của phương pháp PCR:

DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuônđều cần sự hiện diện của những mối chuyên biệt Môi (primer) là những đoạn DNAngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase

sẽ nối dai mỗi dé hình thành mach mới Do đó nếu ta cung cấp hai mỗi chuyên biệt bắt