Chương II. TONG QUAN TÀI LIEU
Chương 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ly trích RNA tổng số từ mẫu lan
Sau khi tiến hành thu thập ngẫu nhiên hơn 30 mẫu tại khu vườn trồng và đánh giá sơ bộ triệu chứng, tiếp tục tiễn hành ly trích RNA tổng số của mẫu lan, sản phẩm ly trích được đo OD dé xem độ tinh sạch va nồng độ RNA đã li trích được.
Bảng 4.1. Nồng độ RNA tổng số
Mẫu A260/280 Nông độ (ng/pl)
1 1,901 11,32 2 1,957 9,20 3 2,062 7,63 4 1,987 15,89 5 2,011 L187 6 1,827 10,12 7 1,935 12,31 8 2,057 15,43 9 1,886 24,01 10 1,949 6,78 ll 1,866 15,44 12 1.998 7,31 13 1,901 35,18 14 2,079 LT 15 2,086 8,95 16 1,838 17,78 17 1,872 19,35 18 1,981 5,69 19 2,077 15,93 20 1,946 13,51 21 1,909 9,41 po 1,907 8,35 23 1,976 9,42 24 1,847 mol 25 1,846 8,71 26 1,875 5,54 a7 2,012 7,95 28 1,962 27,09 29 2,012 1137 30 1,803 31,74
30
RNA được ly trích từ bộ kit đã giúp loại bo DNA và các tạp chất, đảm bảo cho sản phẩm có độ tinh sạch cao, tuy nhiên lượng RNA thu được kha it. Sau khi do OD ở bước sóng 260/280 nm cho kết quả nằm trong khoảng 1,8 — 2,0 đã đáp ứng yêu cầu dé có thé thực hiện các bước tiếp theo.
4.2. Tái tổ hợp thành công cDNA
Sau khi tái tổ hợp cDNA, san pham được tién hành PCR với prmer 18S và điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TBE 0,5X để kiểm chứng xem thu được cDNA có thành công hay không. Kết quả kiểm tra được thê hiện qua hình sau:
200bp
115bp
200bp
115bp
200bp
100bp
Hình 4.1. Kết quả điện di 30 sản phẩm PCR của cDNA. M (a,b): Ladder 1000; M (c):
Ladder 100; 1 — 30: sản phẩm PCR. Sản phẩm được điện di trên gel 1,5%, trong dung dich TBE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thé 100V.
Kết quả điện di trên gel cho thay cDNA đã được tổ hợp tốt, các band đều sáng, không có hiện tượng mờ hoặc mat band, cDNA đủ điều kiện dé thực hiện PCR phát hiện sự
hiện diện của virus OF V và CymMV.
4.3.Phát hiện sự hiện diện của virus CymMV và OFV trên mẫu có biểu hiện nghi ngờ nhiễm virus thông qua phương pháp RT-PCR.
4.3.1. Phát hiện CymMV
Sau khi kiểm tra chất lượng cDNA bang primer 18S. Sản phẩm sau đó tiến hành phan ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu CY505 cho CymMV. Kích thước đoạn khuếch
đại tương ứng cho CymMV là 505 bp.
505bp
600bp 600bp 500bp
500bp
600bp 600bp
500bp 500bp
Hình 4.2. Kết quả điện di PCR kiểm tra virus CymMV trên mẫu. M: Ladder 100 bp Bioline; 1 — 30: sản phẩm PCR 30 mẫu lan với primer CY505; Sản phẩm được điện di
trên gel 1,5%, trong dung dich TBE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thé 100V.
Với kết quả từ Hình 4.2, những mẫu được cho là nhiễm virus gây bệnh khảm là những mẫu có xuất hiện đoạn khuếch đại (band) trùng khớp với đoạn khuếch đại có
khích thước trong 505 bp (Raymond và ctv, 2014) khi điện di trên gel agarose. Từ đó,
để kiểm chứng tính chính xác cả kết qua PCR, lựa chọn sử dụng mau ở giếng 4 (kí hiệu C4) tiến hành gửi mẫu giải trình tự. Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR thu được đoạn 497bp. Sau đó tiễn hành so sánh kết quả trên NCBI. Dưới đây là trình tự của sản phẩm sau khi được đem giải trình tự:
32
Bảng 4.2. Trình tự sản phẩm RT-PCR của CymMV
Mẫu Trinh tự (5’-3’)
C4 (497bp)
CACCTATCACCTCCTCTATCGCCACCCCCGAAGAAATCAAG GCCATAACCCAATTGTGGGTTAACAACCTTGGCCTCCCCGC TGACACTGTAGGTACCGCAGCCATTGACCTGGCCCGCGCCT ACGCTGACGTCGGGGCGTCTAAGAGTGCTACCCTGCTCGGC TTCTGCCCTACGAAACCTGATGTCCGTCGCGCCGCTCTTGCC GCGCAGATCTTCGTGGCCAACGTCACCCCCCGCCAGTTTTG CGCTTACTACGCAAAAGTGGTGTGGAATCTGATGCTGGCCA CCAACGATCCGCCCGCCAACTGGGCCAAGGCTGGTTTCCAG GAGGATACCCGGTTTGCTGCCTTTGACTTCTTCGATGCCGTC GATTCCACTGCCGCACTGGAGCCTGCTGAATGGCAGCGCCG CCCTACGGACCGTGAACGTGCTGCGCACTCGATCGGGAAGT ACGGACCCTCC
Sau khi có được trình tự của mẫu nghi ngờ, tiến hành so sánh 2 trình tự với một số trình tự tiêu chuẩn trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Bảng 4.3. Kết quả phân tích BLAST của trình tự C4
Mẫu Trinh tự CymMV Tỉ lệ bao phủ Tỉ lệ tương đồng 0Q993367.1 447/457 98%
C4 AB541560.1 447/457 98%
AB541559. 1 447/457 98%
Kết quả trên cho trình tự có sự tương đồng rat cao (98%) với các trình tự CymMV đã được so sánh trên NCBI. Như vậy có thé kết luận được mẫu đem giải trình tự có đương tính với CymMV, có thể sử dụng mẫu ở giếng 4 (497 bp) làm đối chứng dương cho virus CymMV cho các phan ứng PCR tiếp theo. Từ đó, kết hợp với hình 4.2 ghi nhận có sự xuất hiện của các band sáng cho thấy có 18/30 mẫu lan thu thập ban đầu dương tính với virus CymMV.
4.3.2. PCR tìm virus OFV
Sau khi kiểm tra cDNA bang primer 18S. Sản phẩm sau đó tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu OF160 cho OFV. Kích thước đoạn khuếch đại tương ứng
cho OFV là 160 bp.
100bp
100bp
100bp
Hình 4.3. Kết qua điện di PCR kiểm tra virus OFV trên mẫu. M: Ladder 100 bp Bioline; 1 — 30: sản phẩm PCR 30 mẫu lan với primer OF160; Sản phẩm được điện di
trên gel 1,5%, trong dung dịch TBE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thế 100V.
Kết quả điện di PCR kiểm tra virus OFV trên mẫu không phát hiện mẫu dương tính.
Virus OFV được truyền qua nhện Brevipalpus californicus (Maeda và ctv, 1998)
đóng vai trò là vector cho virus OFV. Tuy nhiên, hiện tai chưa tim được vector
truyền bệnh của virus OFV là nhện Brevipalpus californicus ở trong khu vườn thu thập mẫu. Qua đó có thể xác định vườn lấy mẫu không bị nhiễm virus này.
4.4. Xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR để phát hiện CymMV và OFV.
4.4.1. Kiểm tra độ đặc hiệu của primer
Khao sát các đặc tính cơ bản của cặp primer CY505 (F, R), 0160 (F, R) bang phần mềm Bioedit. Việc khảo sát các đặc tính cơ bản, độ đặc hiệu của cap primer cho két qua nhu sau:
34
Bảng 4.4. Các đặc tính cơ bản của cặp primer
Số Nu
Primer Trình tự (5’- 3’) GC Tm
(%)
CymMV-
ACCCCACTTCTGCACCAAAA 20 50% 60
CymMV-
7 CCGTACTTCCCGATCGAGTG 20 60% 60
GRCTKGCWGCGGAGGCWGAC; 68%-
OF V-F 20 72 (R = A/G, K = G/T, W = A/T) 74%
CTGGCGGAWGGKGGTGTGAACAG _ 1%-
OFV-R : 23 12 65%
(R=A/G,K=G/T, W = A/T)
Bảng 4.4 cho thấy các số liệu cơ bản của 2 cap primer đã đáp ứng đây đủ các điều kiện dé thực hiện phản ứng như: có số Nu nằm trong khoảng tối ưu từ 15 đến 25 Nu, nhiệt độ bắt cặp của 2 primer F-R không quá cách xa nhau và nhiệt độ bắt cặp trong khoảng từ 50°C đến 80°C.
Sau đó, dé kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer này tiễn hành Blast trình
tự primer trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Chương trình nay
giúp đò tìm dựa trên cơ sở dit liệu của các ngân hang gene dé tìm ra tất cả các gene có trình tự tương đồng với cặp primer này. Kết quả BLAST, tham khảo ở 3 trình tự có độ bao phủ cao nhất cho thấy các primer có độ đặc hiệu cao.
Bảng 4.5. Kết quả phân tích BLAST của 2 primer CY505 và O160
Primer Tên trình tự Tỉ lệ bao phủ
MN057672.1 100%
CY505 MG774930.1 100%
MG821322.1 100%
NC009608.1 95,65%
0160 AB244417.1 95,65%
KR0274431.1 95,65%
Từ bảng 4.5 cho ta thấy xét trên lý thuyết thì các cặp primer này là đặc hiệu và
hoàn toan phù hợp cho phản ứng RT-PCR.
4.4.2. Xác định chu trình nhiệt tối ưu
Để có thé xây dựng một quy trình Multiplex RT-PCR phù hợp, cần phải thực hiện khảo sát 10 mức nhiệt độ khác nhau lần lượt từ 56°C đến 65°C trên cùng một RNA được ly trích từ mẫu C4. Kết quả của RT-PCR của 10 mức nhiệt độ đã được điện
di trên gel agarose như sau:
600bp 505bp
500bp 115bp
200bp
100bp
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR của Ti cli trính nhiệt.
PCR với primer CymMV (F,R) va 18S (F,R); M: Ladder 100 bp Bioline ;1 —
10: sản phẩm PCR lần lượt 10 mốc nhiệt độ từ 56 - 65°C được điện di trên gel 1,5%, trong dung dịch TBE 0.5X, 30 phút ở hiệu điện thế 100V. Kết quả điện di trên gel cho thấy nhiệt độ 63°C cho thấy mẫu được phát hiện là tối ưu nhất.
4.4.3. Xác định nồng độ primer và thời gian bắt cặp tối ưu
600bp
Hình 4.5. Kết quả điện di của 3 mốc thời gian và nhiệt độ bắt cặp khác nhau. M:
Ladder 100 bp Bioline; 1-3: thời gian bat cặp 30 giâys và nông độ lan lượt 0.1,0.2,0.3 uM; 4-6 là thời gian bắt cặp 60 giây và nông độ lan lượt 0.1,0.2,0.3 uM; 7-9: thời
gian bắt cặp 90 giây và nông độ lan lượt 0.1,0.2,0.3 uM.
36
Kết quả điện di trên gel cho thấy nồng độ 0.2 uM và thời gian bắt cặp 60s cho thấy mẫu được phát hiện tối ưu nhất.
4.4.4. Áp dụng quy trình trên 30 mẫu lan thực địa
Áp dụng quy trình RT-PCR đã xây dựng được, tiến hành giám định CymMV trên 30 mẫu lá lan, mỗi lá lan được thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với 2 primer CymMV Œ,R) và 18S (F.R), đọc kết quả bằng điện di. Dưới đây là kếtquả thong kê điện di phản ứng RT-PCR phát hiện CymMV.
500bp
200bp
100bp
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm mutiplex RT-PCR. M(a): Ladder 100 bp Bioline;
M(b,c): Ladder 1000 bp Bioline(+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm,;1 - 30: 30 mau vật liệu ban dau. Sản phẩm được điện di trên gel 1,5%, trong dung dịch TBE
0.5X, 30 phút ở hiệu điện thé 100V.
Bảng 4.7. Kết quả multiplex RT-PCR trên 30 mẫu lan
MẪU CymMV MAU CymMV
| - 16 + 5 + 17 - 3 + 18 + 4 + 19 + 5 SE 20 +
6 - 21 + 7 + 35 + 8 + 23 + 9 + 24 + 10 - 25 + 11 - 26 - 12 + 27 - 13 - 28 - 14 - 29 - 15 - 30 +
Kết quả thống kê cho thấy có phát hiện sự hiện điện của CymMV trên 30 mẫu là 18/30 (Chiếm 60%) trong đó giống Dendrobium là giống nhiễm CymMV nhiều nhất chiếm 7/18 mẫu nhiễm CymMV, 7/11 mẫu Dendrobium được thu và giống Cattleya chiếm 4/18 mẫu dương tính. Dựa trên kết quả từ số liệu thống kê được, cho thấy tỷ lệ mẫu bị nhiễm virus CymMV là khá cao dựa trên tổng số mẫu thu được.
38