Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân tích thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng sinh học của dịch chiết lá khôi nhung (Ardisia silvestris Pitard)

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định đặcđiểm thực vật học, định tính và định lượng một số nhóm chất có trong lá Khôi nhung và thử nghiệm kháng năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

BREAKER

NGUYEN THI THANH NGA

PHAN TICH THANH PHAN HOA HOC VA DANH GIA

MOT SO TAC DUNG SINH HOC CUA

DICH CHIET LA KHOI NHUNG

(Ardisia silvestris Pitard)

LUAN VAN THAC SI CONG NGHE SINH HOC

Thanh phé Hé Chi Minh, thang 9/2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

th % & % Ä % %% % %% %% k%

NGUYEN THỊ THANH NGA

PHAN TÍCH THÀNH PHAN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ

MOT SO TÁC DỤNG SINH HOC CUA

DICH CHIET LA KHOI NHUNG

(Ardisia silvestris Pitard)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh hoc

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Nguyễn Thanh Nga, sinh ngày 07 tháng 5 năm 1987 tại huyện Cam

Lộ, tỉnh Quang Tri.

Tốt nghiệp PTTH tại Trường Trung học phô thông Cam lộ, huyện Cam Lé6,tinh

Quảng Tri, năm 2005.

Tốt nghiệp Đại học ngành công nghệ sinh học hệ chính quy tại Đại học Báchkhoa Đà Nẵng, TP Đà Nẵng

Quá trình công tác (cơ quan công tác, chức vụ theo thời gian).

Các công trình đã công bố (nếu có):

Thang 5 năm 2017 theo học Cao học ngành công nghệ sinh học tại trường daihọc Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: Khu phố 5 - TT Trảng Bom - Đồng Nai

Điện thoại: 0987721828

Email (Fax): thanhngas2@gmail.com

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác

Học viên (Ký tên và ghi rõ họ và tên)

Nguyễn Thị Thanh Nga

1H

TÓM TẮT

Khôi nhung là cây dược liệu quý, có nhiều tác dụng trong việc điều trị cácbệnh lý liên quan đến da dày như làm giảm acid của dạ dày, giảm triệu chứng đaubụng, làm lành và làm se vết loét Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định đặcđiểm thực vật học, định tính và định lượng một số nhóm chất có trong lá Khôi nhung

và thử nghiệm kháng năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa của các dịch chiết khác nhau

Nghiên cứu đã thu nhận được một số kết quả như: Mô tả được các đặc điểmcủa biểu bì lá, đặc điểm vi phẫu các bộ phận lá, thân và rễ của cây Khôi nhung Khảo

sát các đặc điểm của bột lá Khôi nhung sử dụng làm dược liệu về thành phần cau tạo,

độ âm và độ tro toàn phần của bột Bột Khôi nhung có độ ẩm và độ tro toàn phần lầnlượt là 5,58+0,17% và 10,4+0,35% phù hợp với tiêu chuẩn của Dược Điền học Việt

Nam IV (2010) Nghiên cứu cũng đã xác định được trong lá Khôi nhung có các hợpchất như alkaloid, flavonoid, coumarin, tanin, anthocyanoid, carotenoid, các acid hữu

cơ, chất khử, proanthocyanidin, saponin, anthraquinon Hàm lượng polyphenol, tanin

và flavonoid của lá Khôi nhung lần lượt là 0,26% CK, 8,8% (w/w) và 1,442+0,19(mg/g)

Các dung môi khác nhau với độ phân cực khác nhau cũng đã được sử dung détách chiết các hợp chất từ cao tổng methanol Kết quả cho thấy hiệu suất chiết củadung môi hexan, Nước, etyl acetate và butanol có hiệu suất tăng dần tương ứng vớicác dung môi từ 4,35+0,7%; 9,297-+0,1%; 9,/716+0,5% và 21,46+0,6%.

Các dịch chiết cũng đã được đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa.Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH của dịch chiết butanol là cao nhấttrong các dịch chiết với IC50 là 15,81 ug/ml, tiếp đến là dịch chiết Nước và etylacetate với với IC50 lần lượt là 220,17uig/ml va 210,03ug/m1 Dịch chiết hexan khôngthé hiện khả năng kháng oxy hóa

Kha năng kháng khuẩn của dịch chiết Ethyacetate đối với vi khuẩn Escherichiacoli, và Salmonella sp trong phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch lần lượt là

IV

20,54+0,13 mm và 15,34+0,12 mm Đối với phương pháp khuếch tán trên đĩa giấyvòng kháng khuẩn của dịch chiết etyl acetate đối với vi khuẩn E.coli và Samonella là7,26+0,16 mm và 6,17+0,14 mm Các dịch chiét hexan, butanol va dich chiết Nướckhông thể hiện tinh kháng đối với E.coli và Samonella

SUMMARYCây khôi nhung Ardisia silvestris Pitatd là cây dược liệu quý, có nhiều tacdụng trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến da dày như làm giảm acid của dạdày, giảm triệu chứng đau bụng, làm lành và làm se vết loét Nghiên cứu này đượcthực hiện nhằm xác định đặc điểm thực vật học, định tính và định lượng một số nhómchất có trong lá Khôi nhung và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóacủa các dịch chiết.

Kết quả nghiên cứu đã mô tả được các đặc điểm của biểu bì lá, đặc điểm vi

phẫu các bộ phận lá, thân và rễ của cây Khôi nhung Khảo sát các đặc điểm của bột

lá Khôi nhung sử dụng làm dược liệu về thành phần cấu tạo, độ âm và độ tro toànphan của bột Bột Khôi nhung có độ 4m và độ tro toàn phan lần lượt là 5,58::0,17%

và độ tro toàn phần 10,4+0,35% phù hợp với tiêu chuẩn của Dược Điền học Việt Nam

IV (2010) Nghiên cứu cũng đã xác định được trong lá Khôi nhung có các hợp chất

như alkaloid, flavonoid, coumarin, tanin, anthocyanoid, carotenoid, các acid hữu co,

chat khử, proanthocyanidin, saponin, anthraquinon Hàm lượng polyphenol, tanin vàflavonoid cua lá Khôi nhung lần lượt là 0,26%CK, 8,8%(w/w) và 1,442+0,19(mg/g)

Các dung môi khác nhau với độ phân cực khác nhau cũng đã được sử dụng détách chiết các hợp chất từ cao tổng methanol Kết quả cho thấy hiệu suất chiết củadung môi hexan, Nước, etyl acetate và butanol có hiệu suất tăng dần tương ứng vớicác dung môi từ 4,35+0,7%; 9,297-:0,1%; 9,716+0,5% và 21,46+0,6%.

Các dịch chiết cũng đã được đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa.Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH của dịch chiết butanol là cao nhấttrong các dich chiết với IC50 là 15,805 ug/ml, tiếp đến là dịch chiết Nước và etylacetate với với IC50 lần lượt là 220,217ug/ml và 210,034uig/ml Dịch chiết hexankhông thể hiện khả năng kháng oxy hóa

Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Ethyacetate đối với vi khuẩn

Escherichia coli, và Salmonella sp trong phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch lầnlượt là 20,54+0,13 mm và 15,34+0,12 mm Đối với phương pháp khuếch tán trên đĩa

VI

giấy vòng kháng khuẩn của dịch chiết etyl acetate đối với vi khuẩn E.coli vàSamonella là 7,26+0,16 mm và 6,17+0,14 mm Các dịch chiết hexan, butanol và dịchchiết Nước không thể hiện tinh kháng đối với E.coli và Samonella.

Vil

SUMMARYArdisia silvestris Pitatd is a valuable medicinal plant which has a lots effects

in the treatment of stomach-related ailments such as reducing stomach acid, reducing

symptoms of stomach pain, healing and astringent ulcers This study was carried out

to determine the botanical, qualitative and quantitative characteristics of some groups

of substances contained in Ardisia silvestris Pitatd leaves and test the antibacterial and antioxidant resistance potency of different extracts.

The descriptions about the characteristics of the leaf epidermis, microscopic

characteristics of leaf parts, stems and roots of Ardisia silvestris Pitatd were performed The characteristics of Ardisia silvestris Pitatd leaf powder for medicinal using were caried out in components, humidity and total ash of the powder The humidity and total ash were 5.58 + 0.17% and total ash 10.4 + 0.35%, respectively,

in accordance with the standards of Vietnam Pharmacopoeia IV (2010) The Ardisia silvestris Pitatd leaves compounds such as alkaloids, flavonoids, coumarin, tannins, anthocyanoids, carotenoids, organic acids, reducing agents, proanthocyanidins, saponins, anthraquinones were conducted The polyphenol, tannin and flavonoid content of Ardisia silvestris Pitatd leaves were 0.26% CK, 8.8% (w / w) and 1.442 + 0.19 (mg / g), respectively.

Different solvents with different polarities were used to extract compounds from high total methanol The results showed that the extraction efficiency of solvent hexane, Water, ethyl acetate and butanol had increased efficiency corresponding to solvents from 4.35 + 0.7%; 9,297 + 0.1%; 9,716 + 0.5% and 21.46 + 0.6%.

The antibacterial and antioxidant properties were also evaluated The resistance to oxidation according to DPPH method of butanol extract is highest

among extracts with IC50 of 15,805 mg/ml, followed by water extract and ety] acetate

with IC50 is 220,217mg / ml and 210,034mg, respectively hexane extracts did not exhibit oxidation resistance The antibacterial capacity of etylacetate extract against Escherichia coli, and Salmonella sp in agar plate diffusion method was 20.54 + 0.13

Vill

mm and 15.34 + 0.12 mm, respectively For the diffusion method on the antibacterial

loop paper plate of Ethyl acetate extract for E.coli and Samonella 1s 7.26 + 0.16 mm and 6.17 + 0.14 mm The hexane, butanol and Water extracts did not show resistance

to E.coli and Samonella.

1X

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập cũng như làm làm luận văn tại trường tôi gặp phải một

số khó khăn nhất định nhưng nhờ sự động viên giúp đỡ của Thay, Cô và bạn bè đã

giúp tôi vượt qua được những khó khăn Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

đến TS Huỳnh Văn Biết người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, định hướng, theo sát,động viên, hỗ trợ và đóng góp cho tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôithực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô thuộc bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức quý báu

-và những kinh nghiệm thực tiễn cho tôi trong thời gian tham gia học tập tại trường.

Xin chân thành cảm ơn TS Trịnh Thị Phi Ly, KS Nguyễn Thi Vân Anh đã

tận tình hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu-thí nghiệm tại

Phòng Hóa — Viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường.

Kính chúc Quý thầy, Quý cô bộ môn Công nghệ Sinh học cũng như các cán

bộ kỹ thuật viện Công nghệ Sinh học và Môi trường lời chúc sức khỏe, thành đạt và hạnh phúc.

ĐH Nông Lâm TP.HCM, ngày 24 tháng 12 năm 2022

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Nga

LO CAI Off bus n0 166x651 005653550191 3S84ES356305SEg1S9S55EBSESGHSESGESSEHEESĐESGBSSSSSHNNSEĐSSSSS2ES4ĐSHG140Đ9N8588 x

Danh sách các chữ viẾt tắt 2-52 SS22S92E92E92192112112112112112112112112112112112121 2 xe XIVI1 19i0.148 1ì: 1 XV Darih.sách các bằng, . sc-se con H6 066 men sinenssutonainesngnsenacegnandhsarerethsonasasionenes XVI

DE AY san secssicomecrsne assurance cada |Chương 1: TONG QUAN TÀI LIỆU 2-2-2 2S2SE22E£2E22E22E22E22EZE2E2Ezxee, 31.1 Giới thiệu về chi Ardisia - + 25<+S2E£232E1252212112121221212212112111211 2111 xe 3

12 APOISTA SUES IES PILAT ss snsocsnvesenssneunesnnenansssovsenwanencssenve nswssuneonamewemesmensesmemeonneney °1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học củachi Ardisia tại Việt Nam và trên thé giới -. 7- c2 2E 71.3.1 Nghiên cứu về thành phan hóa học trên thé giới 2-2 2255222522 71.3.1.1 Các hợp chất có khung triterpenoid saponin 2-5222 2s2zz2x>zz>s2 71.3.1.2 Các hợp chất có khung quinone va alkyl phenol 2-2: 22 2552522522 81.3.1.3 Các hợp chất có khung isocouiari 2+2 2s2s+2E+2z2zzxzzzxzssez 101.3.1.4 Các hợp chất có khung resorcinol -¿ s2 22+s2+z+2z+2z+2z+zzzxzzzzzxzzsez 101.3.1.5, Các hợp chất có Khung Maven susseessaeeneeDsiticgiGiEHUlvg0004000006200/0066355 11

XI

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên thé giới - 2-2 252222222 121.3.3 Các nghiên cứu về chỉ Ardisia trong nước 22 2+222z22++2zx+zxczez 141.4 Một số nhĩm hợp chất chính 1369119901101 TS TT Ta 15Lads EG]VIHEHỌ sssssisbsirtoonoEtonoonttioorstagibsctbpstipsuEtgloissơnggioitdsgtiolsistesgitidlslisosfsseusgi 15

AD, UT o-seessszsseseussbezssgtorsookistie sg0gagsisdbiJonifsinSugguiU47.0gi3807g0Ei0.n m058°0“3uE01ữcairbzrrrluetbzslioszgkzr3rdTE 16

I j2 18

Chương 2: NOI DUNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 202.1 Vật liệu và hĩa chất nghiên cứu 2-2 52+2E+2E22E22E2EE22E22E21212122222ce, 2021.1; Wat GU OWED) Ứ Gye exces eee ese out rr acter 202.1.2 Thiét bi, dụng cu và hĩa TT .ằằằẶằẶằằằẮằẶằằẽ.ẶằẶằ= em 212:2; PHƯØNE Play NEBEH CUWU csesceccosseruenearsususe ncaaneneeemasmsueneemsnaerosensenwsmemeenenceensers 222.2.1 Phương pháp thu mẫu và nghiên cứu thực vật 2- - 2 2+5=zzszs+ 222.2.1.1 Phương pháp thu mẫu, chuẩn bị bột Khơi nhung - 2 252552 2233.15 mm si Miễu lí ÍỀ, cac, HH HH ng HH g0 rani 32

2.2.5.1 Phuong pháp xác định ham lượng polyphenol - - -=-=+s=+ 30 2.2.5.2 Phương pháp xác định hàm lượng tan1n - - eeeeeeeeeeeeeteetee DD 2.2.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng Flavono1d - -= -z=c+s=+ 33

2.2.6 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học -5cc+cccsccsxcee 34 2.2.6.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro

- phương pháp, D PP sen z1: 160600 210G0H63510.S580SS-EEBSBESGREBERHESSHESESENSSESNSI4SESSSIEM4SE8SESE 34

Xil

2.2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn . 2 22©5222+z2z+2+z>sz 36

Chương 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©222222222222222222222222222zxee 385.1,NEHiEn cứn về THØ VẪ huaangaugingthdittttinniSgifGitplrottitiySinitogtostiregettvdssttsgxisipse 383.1.1 Quan sát biểu bì lá -2- 2 522222222EzE.errrrrrrrrrrrrrrr.38ÿ.1;P T86 đi hoi ae 383.1.3 Đặc điểm của Bột lá Khôi nhung - 2 2 2+522S22E2E+EzEezrrrrrrrrrer 423.2 Khảo sát độ ẩm và độ tro toàn phan của bột lá Khôi nhung - 443.2.1 Xác định độ âm mẫu PES UVC 5IPSTSSS ẽ.ốốẽố 443.2.2 Xáo định độ tro mau ngưyễn lIỆN scccsssicccaneserrersassaccararnoraserscrrannssnornvararariasad 443.3 Tach chiết các hợp chat từ bột lá Khôi nhung - 22 22252222z+522 453.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học -2- 2 2 522SE+2E+2E+£E+2EZEzEzEzzzzzez 463.4.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học -2 225225552 463.4.2 Định lượng một số hợp chất trong dịch chiết lá cây Khôi nhung 49

3.4.2.1 Hàm lượng polyphenol -. - eee 5 22+ +21 2x 1 31221 11 1H re 49 3.42 2 Hann lượng TSTHHHseszzs2ss6xs4:5565568 60 666231358g085403g82333g23363M3.388EGES/00082303H38838E3nggẺ 50 34.2.3 Ham lượng EÍAVOHO1:sscescsscueiceitiig6861021166615580605131858588333556359534E838E3933538880 51 3.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cây Khôi nhung - 5 5552 32

3.5.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro — phương pháp DPPH 523.5.2 Đánh giá kha năng khang khuan oo ccc ecceecececeeceeceeeceeeeeeceeeeeeseeeeeeeeseees 543.5.2.1 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch -2- 22 2z222z+2szzczze 54b) Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết đối với vi khuẩn Salmonella sp 55

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải

eur Khu Bao tên thiên nhiên —

Văn hóa Đông Nai

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số loài trong chi Ardisia 2: 22222222222+22E22E2Exzzxvszxee 5Hình 1.2 Ardisia-silvesttis PT: sueeasesearresoeigiDitioEEGISIGSINNVESGARSVINGRIEEEENISYESEWSHBR 7 Hình 2.1 Cây Khôi nhung tại vườn ươm viện CNSH va MT' 20Hình 2.2 So đồ tách chiết các hợp chat từ cây Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard

— ÔỎ 27 Hình 2.3 Phương trình phản ứng DPPH 5 52+ S2<£+2++scezeezseezke 38Hình 2.4 Sơ đồ bó trí thí nghiệm kháng khuân - 2 2225522525522 38Hình 3.1 Đặc điểm biểu bì lá Khôi nhung, 22 22 522222S2S22E2£E2£22Ez2Ez£zz22 38Hình 3.2 Đặc điểm vi phẫu gân lá Khôi nhung -. 2-22552522252222522 39Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu phiến lá Khôi nhung 2-©22©222 5522222552 40Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu thân Khôi nhung 2 2 2 22S22E2S22Ez2Ez£zz22 AlHình 3.5 Đặc điểm vi phẫu rễ Khôi nhung - 2-22 ©2222222222EEz2Ez2z++zz2 42Hình 3.6 Đặc điểm của bột lá Khôi nhung -.-2-75 5+©cccccecez 43Hình 3.7: Soi bột lá Khối nhung .22052-S 5222222222202 001 12101061 260011842 66866 62 43Hình 3.8 Đường chuẩn acid gallic -2- 25s 2S‡2E22E£EE£EE22E2E2E212122.ze 49Hình 3.9 Đường chuân Rutin -2- 22522222 S22E22E22E2E2E2E2EE2E2ErErrrrrree 51Hình 3.10 Biéu đồ thé hiện hoạt tính kháng oxy hóa của các dich chiét 53Hình 3.11 Khả năng khang khuẩn của các dịch chiết đối với #.eoli 55Hình 3.12 Khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết đối với Salmonella sp 56Hình 3.13 Kha năng kháng khuẩn của các dịch chiết đối với #.eoli SửHình 3.14 Khả năng kháng khuẩn của các nghiệm thức đối với Salmonella sp 58

XV

DANH SÁCH CAC BANG

Bang 3.1 Kết quả xác định độ âm mẫu nguyên liệu - 2-52 44Bảng 3.2 Kết qua xác định hàm lượng tro mẫu nguyên liệu 45Bảng 3.3 Hiệu suất chiết các cao chiết từ bột khô lá Khôi nhung 46Bang 3.4 Kết quả định tính thành phần hóa học 2- 2: ©2222225522522522 48Bảng 3.5 Kết qua xác định hàm lượng polyphenol 2- 2: 522552z552 50Bảng 3.6 Kết qua thử nghiệm định lượng tanin 2- 22522552522 51Bảng 3.7 Kết qua xác định hàm lượng Flavonoid -2-52z 552522552 52

XVI

MỞ DAU

Theo y học cổ truyền, cây Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard, chỉ Ardisia, họMyrsinaceae hay còn gọi lá Khôi là một loài thảo dược quý, có nhiều tác dung sinhhọc như làm giảm độ acid của da dày, giảm đau, đặc biệt có tác dung làm se vết loét.Nhờ cơ chế nay, Khôi nhung đặc biệt hiệu qua trong điều tri da dày tá trang, làm giảm

bớt ợ chua, nóng rát vùng thượng vị, kích thích lên da non và làm lành dạ dày, tá

tràng nhanh chóng, giúp người bệnh có cảm giác dễ chịu khoan khoái, nhẹ bụng Đây

có thé được xem là nguyên liệu trị bệnh dau da day giảm quá trình xuất huyết da day,điều trị bệnh viêm loét da day — tá tràng, giúp giảm đau và làm lành da day, tá trangnhanh chóng Đặc biệt, khi kết hợp Khôi nhung với các dược liệu khác như nghệvàng, 6 tắc cốt có tác dụng nhanh chóng và hiệu quả hơn trong việc hỗ trợ điệu trịviêm loét da dày — tá tràng cấp va mạn tính, giúp giảm nhanh các triệu chứng daybụng, ợ hoi, ợ chua, dau vùng thường vị Ngoài ra, sự kết hợp này còn giúp bồ tỳ vi,

tăng cường chức năng hệ tiêu hóa, bảo vệ và tái tạo niêm mạc da dày — ta tràng.

Khu Bảo tồn thiên nhiên — Văn hóa Đồng Nai (KBT) được thành lập đầu năm

2004 với tổng diện tích tự nhiên 100.304 ha gồm 67.904 ha rừng và đất lâm nghiệp,32.400 ha diện tích đất ngập nước hồ Trị An Với điều kiện tự nhiên, khí hậu thuậnlợi tạo nên khu hệ thực vật phong phú và đa dạng Riêng về cây thuốc đã ghi nhậnđược 950 loài trong đó có cây Khôi nhung Theo kết quả đánh giá của đề tài “Đánhgiá thực trang và tiềm năng nguôn tải nguyên cây thuốc ở Khu bảo tồn thiên nhiên -Văn hóa Đồng Nai làm tiền đề xây dựng dự án “Xây dựng Vườn Quốc gia Bảo tồn

và Phát triển cây thuốc Đông Nam bộ”, cây Khôi nhung phân bố rộng ở trong KBT

và có trữ lượng tương đối lớn Hoạt động khai thác sử dụng loài cây này còn rất ítchủ yếu là người đồng bào dân tộc trong phạm vi nhỏ lẻ

Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tínhhiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn

và có thé đây mạnh khai thác sử dụng nguồn cây thuốc này tại KBT vào việc phòng

và chữa bệnh Đề tài “Phân tích thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụngsinh học của cay Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard" được thực hiện.

Thực hiện vi phẫu các bộ phận: thân, lá, rễ

Tách chiết và thu nhận các cao chiết lá

Định tính và định lượng các hợp chất bằng các phản ứng hóa học, phươngpháp chuẩn độ và đo quang phô

Thử nghiệm các hoạt tính sinh học ở mức độ in vitro.

Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá và soi bột được liệu Khôinhung

Nội dung 2: Nghiên cứu về thành phần hóa học trong cây Khôi nhung Ardisiasilvestris Pitard.

Nội dung 3: Thử nghiệm kha năng kháng khuan và kháng oxy hóa của các hợpchat trong dịch chiết cây Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard

Chương 1

TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Giới thiệu về chi Ardisia

Phân loại khoa học:

e Ngành Ngoc lan: Magnoliophyta

e Bộ Anh thao: Primunales

e Họ Đơn nem: Myrsinaceae

có các điểm tuyến Cum hoa hình chùm, xim, tan ngù ở đầu cành, nách lá hoặc ngoàinách lá Hoa lưỡng tính, mẫu 5, ít khi mẫu 4 Bao hoa có đài hoa và tràng hoa táchbiệt Lá bắc nhỏ, rụng sớm Cánh hoa mỏng, thuộc dạng hơi hợp ở gốc, ít khi hợp đến1⁄2 chiều đài, xếp vặn về phía phải và thường có điểm tuyến Bầu thường hình cầuhoặc hình trứng: vòi nhụy thường ngắn hơn cánh hoa; núm hình chấm; noãn 3 — 12hoặc nhiều hơn, xếp thành một vòng hay đến nhiều vòng Lá noãn có một vòi nhụy

và một núm nhụy, với bầu nhụy một ô, là loại bầu thượng hoặc bầu bán hạ Quả mọngdạng quả hạch, hình cầu hoặc hình cầu đẹp, màu hồng, thường có điểm tuyến, có lúccòng có gân tuyến, hạt được bao phủ bởi màng còn sót lại của giá noãn, phôi mọcngang hoặc mọc thang, (Pham Hoàng Hộ, 1999; Trần Thị Kim Liên, 2002)

Một số loài trong chi phân bé ở trên thế giới và Việt Nam đã được mô tả đặcđiềm hình thái, đặc điểm sinh lý, vị trí phân bố hoặc sử dung làm thuốc như:

Ardisia gigatifolia Stapf tên thường gọi là khôi trắng có hai mặt lá đều mauxanh tương tự như Khôi tia, theo kinh nghiệm dan gian thì cả hai loại đều có tác dụngchữa bệnh nhưng ưa dùng loại khôi tía hơn (Vũ Anh Tuấn, 2006) Phân bố ở TrungQuốc và Việt Nam, từ Sơn La, Hòa Bình, Hà Tây, Bắc Giang, Hà Nam, Ninh Binh,Nghệ An vào Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế đến Kon Tum (Trần Thị Kim Liên, 2002).Trong dân gian lá được dùng nấu nước cho phụ nữ uống sau khi sinh đẻ Ở TrungQuốc, rễ và toàn thân được dùng làm thuốc trị phong đau nhức các khớp, đòn ngã tonthuống, phụ nữ sau sinh bị bại liệt, lá đùng ngoài ngã đắp trị sưng đau, mụn lở loét

Cây Ardisia crenata Sims còn gọi là cây trọng đũa, cơm nguội rang Cây trọng

đũa phân bố ở An Độ, Malaysia, Thái Lan, Lào, Việt Nam va Trung Quốc, ở ViệtNam, cây phân bố rải rác khắp các tỉnh miền núi và trung du ở độ cao thường dưới

1500 m Cây ưa âm, hơi chịu bóng, mọc lẫn trong các quan thé cây bụi, cây gỗ nhỏ ởven rừng, bờ nương ray, đổi hoặc đôi khi đưới tán rừng kín thường xanh, rừng núi đávôi hoặc ở chỗ trồng của các cây gỗ đã bị chặt Trọng đũa ra hoa quả nhiều hàng năm,tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Cây còn có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặtđón Bộ phận dùng: Rễ, lá thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô

Ardisia humilis Vahl có tên tiếng Việt là Cơm nguội nhỏ, Cây dang dang, Lụcchột Cây mọc ở các tỉnh Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Khánh Hòa, Kon Tum, LâmĐồng Cây mọc tự nhiên rải rác trong rừng hỗn giao, sườn đồi, ở độ cao tới 1000 m.Dùng làm thuốc bổ máu, chữa phong thấp (cả cây)

Cơm nguội rạng Ardisia splendens được Pitard miêu tả khoa học lần đầu năm

1930 Cây bụi, cao khoảng 1-1,2 m Thân non tròn, mảnh, vỏ màu xám, có đường

khía dọc Lá hình mác ngược hẹp, cuống đài 5-8 mm, đẹp và có rãnh ở mặt trên Cánh

hoa 5, đài 5-6 mm, hình thuôn, nhọn, mỏng, màu hồng; ống rất ngắn Quả hình cầu,

đường kính 5- 7 mm Loài này mới thấy ở ở Quảng Trị (Mai Lãnh), Đồng Nai (Trần

Thị Kim Liên, 2002).

Hình 1.1 Một số loài trong chi Ardisia1.2 Ardisia silvestris Pitard

Ardisia silvestris Pitard hay còn gọi là Khôi nhung (hay Khôi tia; cây Độc lực: Don tướng quân) là một loai ở trong chi Ardisia, họ đơn nem.

Đặc điểm nhận dạng: Cây gỗ bụi nhỏ, cao khoảng 1,5 — 2 m, ít phân cành, thânrỗng xốp, gần ngọn có lá nhiều (Đỗ Tắt Lợi, 2005) Lá mọc cách, màu tím, thườngtập trung ở đầu thân hoặc đầu nhánh, phiến lá hình bầu dục hoặc trứng ngược, dài 20

— 30 cm, rộng 6 — 8 cm, hình mác thuôn, sốc và đầu nhọn, mép khía răng cưa nhọn,nhỏ, đều và sit nhau, mặt trên màu xanh mịn, mat đưới màu tím có nhiều chấm nhỏ

(cay ra có màu gach cua) Cụm hoa chùm tán ở nách lá, dai 10 — 15 cm Cánh hoamàu hồng tím; lá bắc hình mác; đài 5 ráng có long dạng mi; ống ngắn; tràng 5 cánh.Quả hạch hình cầu, khi chín màu đỏ (Vũ Huy Bích và ctv, 2006)

Sinh học và sinh thái: Mùa hoa thang tháng 5 — 7, mùa quả chín tháng 8 — 10.Tái sinh bằng hạt Cây ưa bóng mọc dưới tán rừng ram ẩm ướt, phát triển tốt trên lớpđất nhiều mùn trong rừng tự nhiên, ở độ cao từ 400 — 1000 m

Phân bố: Ở trong nước cây phân bố rộng khắp các tỉnh như Lào Cai (Sapa),

Lạng Sơn (Hữu Lũng), Quảng Ninh, Vĩnh Phúc (Tam Đảo) Hà Tây (Ba Vì), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hoá (Lang Chánh, Ngọc Lạc, Thạch Thành), Nghệ An

(Quỳ Châu), Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế (Phú Lộc), Đà Nẵng Trên thế giới TrungQuốc (Hải Nam, Quảng Tây) và Lào

Giá trị: Lá sắc uống chữa đau da dày, đau bụng (Sách đỏ Việt Nam năm 2007).Được dùng phối hợp với bồ công anh, khổ sâm, cam thảo dé sử dụng trong trườnghợp thể trạng sút kém, bụng đầy trướng, kém ăn, mệt mỏi, đau vùng thượng vị, đautừng cơn, lan ra hai bên sườn xuyên ra sau lưng, người bị viêm loét dạ dày tá tràng(Đỗ Tắt Lợi, 2005) Bài thuốc kết hợp 4 vị thuốc này đã được Hội đông y Thanh Hóa

và các Viện Đông y sử dụng trong điều trị bệnh đau dạ dày rất có hiệu quả

Nhân dân miền ngược vùng Lang Chánh, Ngọc Lạc tỉnh Thanh Hoá thường dùng lákhôi chế biến, sắc uống chữa đau bụng Hội Đông y Thanh Hoá đã kết hợp dùng lákhôi (80g), lá bồ công anh (40g) và lá khổ sâm (12g) sắc uống chữa đau da dày; cóthê gia thêm lá cam thảo dây (20g) Nhiều địa phương khác ở tỉnh Nghệ An cũngdùng lá khôi chữa đau dạ dày Lá khôi được dùng với lá vôi, lá hoé nau nước tắmcho trẻ bi sài 16, hoặc giã với lá Vối trộn với dầu vùng dap nhot cho trẻ Người Daodùng rễ cây khôi thái nhỏ phơi khô ngâm rượu uống cho bỏ huyết, lai dùng sắc

uông chữa kiệt ly ra máu, đau yêt hau và đau cơ nhục.

(Đỗ Xuân Cam - sinh vat rừng Việt Nam)1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chỉArdisia tại Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học trên thế giới

Trên thé giới các nghiên cứu về chi Ardisia được nghiên cứu khá sớm Từ năm

1968, nhà khoa học người Nhật là Ogawa Hideko và cộng sự đã tìm thấy các hợpchat ardisiaquion A, B, C từ cây Ardisia sieboldi (Paul và ctv, 2014) Tuy nhiên cácnghiên cứu về thành phan hóa học và hoạt tinh sinh học trong chi Ardisia mới thực

sự phát triển trong những năm gần đây Các công trình nghiên cứu này đều cho thấytrong chi Ardisia có nhiều hợp chất có cau trúc mới và có nhiều hoạt tính sinh họcđáng quý, nôi trội lên đó là hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư

1.3.1.1 Các hợp chất có khung triterpenoid saponin

Rất nhiều các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy các hợp chất triterpenoidsaponin rất phô biến trong chi Ardrisia Các hợp chat này cũng rất phố biến và phân

bố rộng rãi ở rất nhiều loài thực vật, một số sinh vật biển, nhờ có sự đa dạng về cấutrúc hóa học nên các hợp chất này có tính kháng nắm, kháng khuẩn và đặc biệt hơn

là có tác dụng ức chế tế bào ung thư rất tốt (Mu và ctv, 2013)

Năm 1986, Chaweewan và ctv đã phát hiện được 2 hợp chat triterpenoid saponin

là ardisiacrispin A và ardisiacrispin B phân lập được từ rễ của cây Ardisia crispa, (Jia

và ctv, 1994) Hỗn hợp 2 hợp chất này có tác dụng gây ức chế sự tăng sinh của tế bào

ung thư gan người Bel-7402 (L1 và ctv, 2012).

Có 24 hợp triterpenoid saponin đã được phân lập và khảo sát một số hoạt tính

của chúng từ rễ cây Ardisia japonica (Chang va ctv, 2007; de Mejia và ctv, 2011; Li

va ctv, 2005) 21 hợp chat trong số nay có kha năng ức chế các dòng tế bao ung thưtrên người gồm các dòng tế bào ung thư HL-60, KATO-III và A549 (Chang va ctv,2007).

Jing Huang và ctv đã nghiên cứu va phân lập được 8 hợp chất triterpenoidsaponin từ rễ loài cây Ardisia mamillata, được đặt tên là ardisimamillosides (A-H)(Huang và ctv, 2000a, 2000b, 2003), cùng với đó là 17 hợp chất triterpenoid saponin

đã thu được từ loài Ardisia gigantifolia, trong đó 13 hợp chất được phân lập từ phan

rễ thân của loài này, một trong số chúng có tiềm năng trong việc ức chế khối u ungthư biểu mô gan (Gong va ctv, 2010; Mu va ctv, 2010; 2012, 2013, 2015) Các dẫnxuất trong dịch chiết methanol cây Ardisia gigantifolia đã được báo cáo là có khanăng ức chế sự phát triển của khối u ung thư tuyến vú người MCF-7 in vitro

Một số nghiên cứu thành phan hóa học trên loài Ardisia pusilla đã phân lậpđược một số triterpenoid saponin mới và ardipusillosides (I-V), trong đóArdipusillosides (1,1) thé hién hoat tinh dang ké trong viéc chéng lai ung thu biểu mô(ej phối và gan, (Cao WY và ctv, 2015; Tian và ctv, 2009) Các nghiên cứu của Tang

va ctv, 2009 cho thay ba hợp chat Ardipusillosides (III-V) có khả năng gây độc tế bàoU251MG (tế bào u thần kinh đệm) ở người

1.3.1.2 Các hợp chất có khung quinone và alkyl phenol

Quinone là lớp chất hữu cơ bắt nguồn từ các hợp chất thom ví như benzen hoặc

naphthalen, hợp chất này được xác định bởi sự hiện diện của 2 liên kết đôi của một

vòng thơm Cũng giống như lớp chất triterpenoid saponin, ở một số loài thuộc chiArdisia, người ta cũng tìm thấy sự đa dạng về cau trúc của bộ khung quinone Các

hợp chất thuộc lớp này cũng có những tác dụng sinh học quý, có tiềm năng trong việcứng dụng thực tế.

Năm 1987, Tian và ctv đã phân lập được 2 hợp chat 1, 4-benzoquinon từ rễ câyArdisia cornudentata, thêm 3 hợp chat quinone khác đã được phân lập là 3-methoxy-2-methyl-5-pentylphenol, 3 methoxy-2-methyl-5-(1'-ketopentyl) phenol, cùng với 21hợp chất đã được nghiên cứu trước đó Một số chat trong số này cho thấy hoạt tinh

ức chế vi khuân H37R ở in vitro

Nhiều hợp chất có khung quinone, alkyl phenol khác tiếp tục được tìm thấytrong rễ loài Ardisia japonica, trong đó các hợp chất 31, 32, 33 đều có hoạt tính invitro dang ké trong việc ức chế hoạt độ của enzyme PTP1B (Fukuyama va ctv, 1993;

Li va ctv, 2005, 2007).

Các nha khoa hoc đã phân lập được 31 hợp chất với 4 hợp chất thuộc khungquinone và 27 hợp chất thuộc lớp chat alkyl phenol từ rễ và gốc loài Ardisia viren(Hsun-Shuo Chang và ctv, 2009).

Hỗn hợp a, B-amyrin (triterpene) (41), (42) và

2-methoxy-6-undecyl-1,4-benzoquinone (quinone) (43) phân lập từ dich chiét hexan Ardisia crispa đã được baocáo là có đặc tính chống viêm, ức chế khối u ở mức độ in vitro, khang lại virus Epstein

Barr (virus ở trong vòng họng người, có khả năng gây ung thư vòm họng), (Yeong

LT va ctv, 2014, 2015).

Ba hợp chat quinone được phan lập từ dich chiết cloroform của rễ Ardisiapunctata: 2-tridecyl-3 - [(2-tridecyl-3-axetoxy-4-methoxy-6-hydroxy) -phenyl] -6- methoxy-1; 4-benzoquinone ; 2-tridecyl- 3 - [(2-tridecyl-4,6-dihydroxy) -phenyl] -6- methoxy-1,4-benzoquinone, 2-tridecyl-3 - [(2-pentadecyl-4,6-dihydroxyl) - phenyl] - 6-methoxy-, 4-benzoquinone (Li C va ctv, 2006).

Nhiều nghiên cứu về kha năng tế bào của day chất ardisiaquinone trên các dong

tế bào, HeLa, A431, MCF7 và Ishikawa, đồng thời thử hoạt tính sinh học của chúngtrên các nhiều chủng vi khuẩn đã cho thấy những kết quả khả quan, qua đó các tácgiả nhận định các dẫn xuất tự nhiên của lớp chat alkyl phenol là những ứng cử viên

tiềm năng cho việc tìm ra những hợp chất mới trong điều trị bệnh đặc biệt là các bệnh

có liên quan tới bạch cầu và các bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi khuân gram dương(Ndonsta và ctv, 011, 2012; Paul, 2014).

1.3.1.3 Các hợp chất có khung isocoumarin

Cac hợp isocoumarin cũng rất được quan tâm trong chi Ardisia, đặc biệt làbergenin (44) Theo các nhà khoa học thì các chất này có hoạt tính chống lại tế bàoung thu gan, kháng nấm, chống loạn nhịp tim, chống HIV (Lim va ctv, 2000;Prithivirai va ctv, 1997; Qian Y và ctv, 2002).

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác đã phân lập được 11-Ogalloylbergenin (45)

và syringylbergenin (46) cùng với 2 dẫn xuất mới của bergenin 1a

11-O-vanilloyl-bergenin (47) và 11-O-(3-dimethylgalloyl)-bergenin (48) từ rễ Ardisia

crenata (Kashif Ali va ctv, 2012) Từ rễ loài Ardisia gigantifolia, 6 hợp chat là danxuất của bergenin cũng đã được phan lập, trong đó có một hợp chat mới là 11-O-veratroylbergenin (50) (Mu và ctv, 2013) Một dẫn xuất khác của bergernin là

demethoxybergenin (51) cũng được phân lập từ loài Ardisia colorata (Sumino và ctv,

2002).

Một triterpene glycoside mới là ardinsuloside, và mười hai hợp chất được biếtđến, demethoxybergenin, norbergenin, bergenin, 4-O-galloylbergenin, quercitrin,myricitrin, myricetin 3-O- (3 " - O-alloyl) -a-L-rhamnopyranoside, desmanthine-2, epicatechin este 3-O-alloyl, 3'-methoxyepicatechin 3-O- este alloyl, acid gallic, va

methyl galloate được phân lập từ lá của Ardisia insularis, một sé có hoạt tính ức chế

sự phát triển của ba dong tế bao ung thư là A-549 (tế bao ung thư phối ở người),

HT-29 (tế bào ung thư đại tràng) và OVCAR (tế bào ung thư buồng trứng ở người), (Van

NT và ctv, 2015).

1.3.1.4 Các hợp chất có khung resorcinol

Nhiều hợp chất resorcinol được phát hiện và phân lập từ một số loài như Ardisiabrevicaulis, Ardisia cornudentata, Ardisia gigantifolia, Ardisia maculosa và từ lá củacây Khôi nhung Ardisia silvestris, một số hoạt tính sinh học của chúng đã được thử

10

nghiệm va báo cáo (Chandra S và ctv, 2004; Chen va ctv, 2011; Liu va ctv, 2009; Nguyen H A va ctv, 1996).

Hai dẫn xuất resorcinol mới là 2methoxy4hydroxy6 (8Zpentadecenyl) benzene-1-O-acetate và 2-methoxy-4-hydroxy-6-pentadecyl-benzen-1-O-acetate,cùng với bốn hợp chất được biết đến trước đó là 2-methoxy-4-hydroxy-6-tridecyl-benzen-1-O-acetate (ardisiphenol D), 5 (8Z-pentadecenyl) resorcinol, 5-

-pentadecylresorcinol, 5-tridecylresorcinol đã được phân lập từ rễ của Ardisia

brevicaulis, các hợp chất này đều có hoạt tính ức chế, chống lại sự gia tăng của các

tế bao ung thư PANC-1, A-549, C7901, MCE-7, và PC-3, (Bao L va ctv, 2010; Chen

LP và ctv, 2011; Zhao F và ctv, 2014)

Guan YF va ctv, 2016 da phat hién ra hai dan xuat alkylresorcinols trong dichchiết cây Ardisia gigantifolia có khả năng chống lại vi khuẩn gây bệnh laoMycobacterium tuberculosis H37 RV là 5-(8Z-heptadecenyl) resorcinol và 5- (8Z- pentadeceny]) resorcinol.

1.3.1.5 Các hợp chất có khung flavonoid

Các báo cáo về lớp chất flavonoid trong chỉ này được báo cáo khá ít Khi nghiêncứu về hoạt tinh ức chế PTP1B trên loài Ardisia japonica, Li và ctv, 2005 đã lần lượtphát hiện ra các lớp chất flavonoid phổ biến như quercitin, myricitin, kaempferol 3-

O-ơ-L-rhamnopyranoside va rutin Nam 2009, từ loài Ardisia colorata trong một

nghiên cứu cua Kikuchi H và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất isoflavon (58 68), (Kikuchi và ctv, 2009).

-Có 7 hợp chất được phân lập và công bồ từ cây Ardisia chinensis là axit salicylic,axit 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic, axit gallic ethyl ester, 4-hydroxy-3,5 -dimethoxy benzoic axit methyl ester, axit protocatechuic, axit gallic va catechin (Li YL va ctv, 2006).

Hamsin DE va ctv, 2013, qua khao sat cho thay có sự hiện diện của flavonoid,triterpenes, và tannin trên cây Ardisia crispa.

11

1.3.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên thế giới

Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới về các loài trong chi Ardisia, có nhiều hoạttính sinh học quý: hoạt tinh kháng khuẩn, kháng nam, kháng virus, kháng viêm, giảmđau, khả năng chống oxy hóa, đái tháo đường, bảo vệ gan, hệ thần kinh và đặc biệt làhoạt tính chống ung thư tốt Kobayashi va ctv, 2005 đã công bồ rằng: "Chi Ardisia làmột nguồn mới cung cấp các hợp chất tăng cường sức khỏe và được phẩm có nguồngốc thiên nhiên quý giá"

Một nghiên cứu ở Malaysia về hoạt tính gây độc tế bào HL- 60 của gần 100 câythuốc cho thay dịch chiết metanol của loài Ardisia crenata ức chế hon 50% tế baoung thư ở nồng độ 20 pg/ml (Li va ctv, 2008)

Cùng với các hợp chất tritecpen saponin, các hợp chất là dẫn xuất củabenzoquinon tìm thay ở một số loài trong chi Ardisia thé hiện hoạt tính gây độc đốivới nhiều dong tế bào ung thư Một hợp chất benzoquinonoid là 2-metoxy-6-tridecyl-1,4-benzoquinon (ký hiệu AC7-1) có khả năng ngăn chặn sự bám dính và xâm lấncủa tế bảo u ác tính B16-F10 in vitro, đồng thời ức chế sự lớn lên và di căn vào phốicủa khối u trong cơ thé, (Kang YH và ctv, 2001) Hai hợp chat chất alkyl benzoquinon

là ardisianone vả cornudentanone từ loài Ardisia cornudentata cũng được phát hiện

có khả năng gây độc đối với dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ IC50 tương ứng là 2,3

và 2,5 ug/ml, (Chang và ctv, 2011).

Hỗn hop hai hợp chất ardisiacrispin A va ardisiacrispin B đã được thử nghiệm

có hoạt tính gây độc tế bào U251MG tiềm năng với giá trị IC50 là 3,33 pmol/l, sovới chất đối chứng đương là Nimustine hydrochloride (giá trị IC50 là 0,98 mol),mặt khác ardisiacrispin A cũng thể hiện hoạt tính này song ở giá trị IC50 thấp hơnnhiều (12,20 +1,14 mol), (Tian va ctv, 2009) Hỗn hợp hai hợp chất này cũng đãđược thử nghiệm và cho thấy khả năng gây ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư

gan người Bel-7402 (Li và ctv, 2012).

Nhiều hợp chat tritecpen saponin được phân lập từ Ardisia japonica có khả năng

ức chế các dòng tế bào ung thư trên người gồm các dòng tế bào ung thư HL-60,

12

KATO- III và A549, ức chế khối u ung thư biểu mô gan (Chang và ctv, 2007; Gong

và ctv, 2010; Mu va ctv, 2010; 2012, 2013, 2015) Các hợp chấtt ardisiacrispin B,

ardisiacrenoside A, B, C, D va primulanin được thử nghiệm trên enzym cAMP

phosphodiesterase (một loại enzym có tac dụng phân hủy các chất truyền tín hiệu nộibảo gây ra việc rối loại ở nam giới), kết qua cho thấy các hợp chất có kha năng ứcchế mạnh ngoại trừ ardisiacrenoside D Ba hợp chất tritecpen saponin từ loài Ardisiacolorata đã được thử nghiệm và chứng minh có hoạt tính ức chế hoạt tính tế bào ung

thư vú ở chuột FM3A (Chang va ctv, 2007).

Hợp chat saponin là : 3B-O- {a-L-pyran rhamnose- (1 — 3) - [B-D-xylopyranose-(1 — 2)] - beta-D-glucopyranose- (1 — 4) - [B-D-lucopyranose - (1 — 2)] - alpha- L-pyran arabinose} -cyclamiretin A (AG4), phan lập từ cây Ardisiae gigantifolia

được đã được nghiên cứu là có tiềm năng trong việc ức chế khối u và kháng lai sựphát triển của tế bào ung thư vòm hong ở người (CNE), bằng cách giảm sự tăng sinh

tế bào, kích thích quá trình apoptosis, và ngăn chặn chu kỳ tế bào trong giai đoạn S(Dong XZ và ctv, 2015) Ba saponin khác ở trong cây Ardisiae gigantifolia cũng đượcnghiên cứu là có hoạt tính ức chế mạnh với các đòng tế bào ung thư Bel-7402, HepG2,

và SMMC-7721, hai trong ba hợp chat này có khả năng gây chế tế bao mạnh hơn cảchất đối chứng dương là (epirubicin Hydrochloride) (Mu LH và ctv, 2015)

Ngoài những hợp chất tritecpen saponin và benzoquinon ra thì các dẫn xuất củaresorcinol trong chi Ardisia cũng có hoạt tính gây độc tế bao, chống các khôi u tốt.Một thử nghiệm với các hợp chất là dẫn xuất của resorcinol phân lập từ cây Ardisiagigantifolia trên các dòng tế bào ung thư PC-3, EMT6, A549, Hela, RM-1, vaSGC7901 cho thay chúng có hoạt tinh gây độc mạnh, giá trị IC50 nhỏ hơn 30 umol/I.Bốn dẫn xuất của resorcinol là 4-hydroxy-2-methoxy-6-[(8Z)-pentadec-8-en-1-vllphenyl acetate, 4-hydroxy-2-methoxy-6-pentadecylphenyl acetate, 5-tridecylresorcinol và ardisiphenol D phân lập từ cây Ardisia brevicaulis thé hiện hoạttính ức chế mạnh với đòng tế bào A549, MCF-7, PANC-1, đặc biết với A549 thì cả

4 hợp chất trên đều có hoạt tính rất mạnh với dòng tế bào ung thư phổi A549 (IC50

13

lần lượt là 3,0; 3,2; 12,5; 3,4 umol/I), mạnh hơn cả chất đối chứng là cisplatin (IC50

là 18,7 nmol/]), (Bao và ctv, 2010).

Tuy có ý nghiên cứu tìm thấy được các hợp chat flavonoid trong chi Ardisia,song các hợp chất có khung flavonoid trong chỉ này cũng có những hoạt tính sinh họcrat đặc biệt Một hợp chat là isoflavoinoid được tìm thấy trong cây Ardisia colorata

là cloratanin A có tác dụng ức tế bào ung thư phối người AGS qua con đường tăngcường hoạt tính của DR5 (một thụ thể gây chết gắn kết với protein gây ra cái chếttheo chương trình của tế bào TRAIL), (Kikuchi và ctv, 2009) Ở Mỹ người ta sử dụng

lá của cây Ardisia compressa nâu nước uống thay trà

Ngoài ra các cây thuốc chi Ardisia còn nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý khácnhư kháng virus (viêm gan B, viêm gan C, HIV-1 và 2), hoạt tính trừ giun, ức chếenzyme (PTPB, acetylcholinesterase), hoạt tính chống oxy hóa, chống nhồi máu cơtim.

1.3.3 Các nghiên cứu về chỉ Ardisia trong nước

Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở trong chiArdisia, họ Myrsinnaceae chưa có nhiều ở nước ta và chủ yếu tập trung ở phía Bắc.Theo Trần Thị Kim Liên, 2002; Võ Văn Chi, 1997; Viện Dược liệu, 2003; NguyễnViết Thân, 2005 thì trong Ardisisa silvestris có tanin và glucozid, ngoài ra còn có một

số tài liệu định tính được một số hợp chất khác trong cây như: coumarin, flavonoid,sterol, carotene, chất béo (N guyen Thi Phuong Dung, 2002); tannin, saponin,alkaloid, đường khử, chat béo, carotene, flavonoid (Nguyễn Phuong Thanh, 1999);phan lập được ba hoạt chất 2 methyl — 5 — (Z - nonadec — 14 enyl) resorcinol và 5 —

(Z.— nonadec — 14 — enyl) resesorcinol (Nguyen HA và ctv, 1996), quercetin (Nguyễn

Thị Phương Dung, 2002).

Theo y học cổ truyền, các cây họ Myrsinnaceae có tính mát, tác dụng kháng

sinh, tiêu nhũng, tiêu viêm, hoạt huyết tán ứ Được dùng đề chữa bệnh phong thấp,

đau xương, đòn ngã chan thương, chữa các bệnh về gan, đái tháo đường, bệnh ly,

14

sưng đau yết hầu, mụt nhọt, các bệnh về tiêu hóa, giun sán một số loài lá còn đượcdùng nấu nước uống thay trà, (Đỗ Tất Lợi, 2005; Võ Văn Chi, 1997).

Theo nghiên cứu sơ bộ nghiên cứu trên thỏ, chuột bach và khỉ (Lê Trần Đức,1997; Đỗ Tat Lợi, 2005) về cây Ardisia sivestris Pitard có một số kết quả sau đây:

Làm giảm độ acid của dạ dày khi.

Làm giảm nhu động ruột cô lập của thỏ.

Làm yếu sự co bóp của tim

Làm giảm sự hoạt động bình thường trên chuột bạch.

Bệnh viện 108 thí nghiệm dùng trên lâm sàng (mới trên 5 bệnh nhân) thì 4người giảm đau 80 — 100%, dịch vị giảm xuống bình thường

Viện Đông y áp dụng lá khôi chữa một số trường hợp đau dạ dày (dùng riênghay phối hợp với nhiều vị thuốc khác) đã sơ bộ nhận định như sau: Với liều 100 g lákhôi Ardisia sivestris Pitard trở xuống uống hàng ngày thì có thé từ đỡ đau đến hếtđau, bệnh nhân ăn được ngủ được Nhưng với liều 250 g một ngày thì làm bệnh nhânmệt, người ué oải, da tái xanh, sức khỏe xuống dan nếu tiếp tục uống, (Đỗ Tắt Lợi,2005).

Cao lỏng 1 : 1 cây khôi Ardisia sivestris Pitard có tác dụng chống viêm, giảmđau trên mô hình thí nghiệm bằng đường uống đối với chuột thí nghiệm Cao lỏngKhôi nhung và dịch chiết flavonoid toàn phần đều có ức chế lét trên chuột thí nghiệm

và có tác dụng ức chế 2 chung virus gram (+) là Bacillus subtitis và Escherichia coli,

(Nguyén Thi Phuong Dung, 2002).

1.4 Một số nhóm hợp chat chính trong thực vat

1.4.1 Polyphenol

Thực vật chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính kháng oxi hóa như phenolictv acid,flavonoids, tannins, lignans (Cai và ctv, 2004) Các hợp chất phenolictv là những chấtkháng oxi hóa tự nhiên và được phát hiện là hợp chất thứ cấp phô biến trong các loạithực vật Hợp chất này có nhiều chức năng sinh học quý vì chúng có nhiều khả năng

15

trì hoãn hiệu quả quá trình oxi hóa chất béo và do đó góp phan cải thiện chất lượng

và dinh dưỡng của thực phẩm

Phenolictv là những hợp chất là nhóm hợp chất chứa nhiều polyphenol thơm

có nhóm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzen (Lê Ngọc Tú và ctv, 2002).Polyphenol có nhiều trong các loại thực vật, đóng vai trò hết sức quan trọng đối vớiđời sống thực vật như tạo màu sắc, bảo vệ thực vật khỏi những xâm hại của côn trùng,kháng lại sự oxi hóa và tác dụng của tia cực tím Polyphenol có tác dụng kháng oxihóa mạnh, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng dị ứng, kháng lão hóa và một số bệnh

liên quan tới ung thu (Jin Dai va ctv, 2010).

Polyphenol là một trong những hợp chat thứ cấp chính của thực vật, tham giavào một số chức năng sinh lý như kháng oxi hóa (Bhattacharyya, 2014) và có tác

dụng mạnh mẽ trong hoạt tính kháng oxi hóa (Kikuzaki, 2002) Phần lớn các hợp chất

phenolictv bị ảnh hưởng bởi một số yếu tô tác động như UV, nhiệt độ, thành phầndưỡng chat và yếu tô di truyền (Wei, 2001; Ling, 2007)

Hàm lượng polyphenol phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng hay độ non già củanguyên liệu Nguyên liệu càng non, hàm lượng polyphenol càng lớn và ngược lại.Hàm lượng polyphenol thu được từ 16,0 %CK đến 26,6 %CK trong các nguyên liệukhảo sát từ già đến non (nguyên liệu được sấy chân không ở 75°C) (Giang TrungKhoa, 2011).

1.4.2 Tannin

Tanin hay tannoid là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năngtạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất cao phân tử khác như aminoacid và alkaloid.

Tanin phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, tập trung nhiều ở các họ Rau răm(Polygonaceae), Hoa hồng (Rosaceae), Đậu (Fabaceae), Sim (Myrtaceae), Cà phê(Rutaceae), và có mặt ở nhiều bộ phận của cây: rễ, thân rễ (Đại hoàng), vỏ (Chiêuliêu), lá (Trà), hoa (Hoa hồng, hạt (Cau), vỏ quả (Măng cụt) Đặc biệt, có một sốtanin được tạo thành do thực vat bị một bệnh lý nao đó, như vi thuốc Ngũ bội tử là

16

những túi được hình thành do nhộng của con sâu ngũ bội tử gây ra trên cành và cuống

lá của cây Muối (Rhus semialata, thuộc họ Anacardiaceae) Hàm lượng tanin trongdược liệu thường khá cao, chiếm từ 6-35%, đặc biệt trong Ngũ bội tử có thé lên đến50-70% Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đôi chất và oxy hoá khử, đồngthời nhờ có nhiều nhóm phenol nên tanin có tính kháng khuẩn, bảo vệ cây trướcnhững tác nhân gây bệnh từ bên ngoài.

Dựa vào cấu trúc hoá học, tanin được phan làm hai loại:

Tanin thuỷ phân được hay còn gọi là tanin pyrogallic vì sau khi bị thuỷ phan,những tanin thuộc nhóm này sẽ bị cắt ra thành một đường, thường là glucose và mộtacid, thường là acid gallic.

Tanin không thuỷ phân được hay tanin ngưng tụ Dưới tác dụng của acid hayenzym, chúng dé tạo thành tanin đỏ hoặc một sản phâm trùng hợp gọi là phlobaphenrất Ít tan trong nước Phlobaphen là đặc trưng của một số được liệu như vỏ Canhkina,

vỏ qué,

Đa số các tanin đều có vị chát, làm săn se da, tan được trong nước, nhất làtrong nước nóng, tan trong cồn loãng, kiềm loãng và hầu như không tan trong dungmôi hữu cơ.

Tanin tạo kết tủa với muối sat III (Fe?”), tuỳ loại mà cho màu xanh đen (taninthuỷ phân) hoặc xanh lá cây đậm (Tanin ngưng tụ) Chính vì vậy, khi dùng dao bằngsat dé cắt got vỏ những loại trái cây chứa nhiều tanin (như Ôi), trên miếng trái cây sẽxuất hiện màu đen xin rất xấu Cũng vì thết, khi có Tanin, các lương y luôn dan dongười bệnh phải sắc thuốc bằng ấm đất để không làm mất tanin, giảm tác dụng củathang thuốc

Tanin là một hợp chất có khá nhiều ứng dụng trong điều trị:

Do có tính tao tủa với protein, khi tiếp xúc với niêm mạc, tổ chức da bị tổnthương hay vét loét, tanin sẽ tạo một màng mỏng, làm máu đông lại, ngừng chảy

nên ứng dung lam thuôc đông máu và thuôc săn se da.

17

Tanin có tính kháng khuẩn, kháng virus, được dùng trong điều trị các bệnhviêm ruột, tiêu chảy mà búp Ôi, búp Sim, vỏ Ôi và vỏ Măng cụt là những dược liệutiêu biểu đã được dân gian sử dụng Phối hợp với tinh làm săn se, tanin còn đượcdùng dé làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miêng, họng bị viêm loét hoặc chữa vếtloét do người bệnh nằm lâu.

Tanin tạo kết tủa với các alcaloid và các muối kim loại nặng như chì, thuỷngân, kẽm nên làm giảm sự hấp thu của những chất này trong ruột, vì vậy đượcứng dụng để giải độc trong những trường hợp ngộ độc alcaloid và kim loại nặng.Cũng vì lý do này, không nên uống thuốc với nước trà

1.4.3 Flavonoid

Flavonoid (hoặc bioflavonoid - bắt nguồn từ Latin flavus nghĩa là màu vàng,màu của flavonoid trong tự nhiên) là một loại chất chuyền hóa trung gian của thựcvật Tuy nhiên một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lạikhông có màu Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộcflavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon có thé gâynhằm lẫn

Flavonoid được gọi là vitamin P (do tac dung thâm thấu vào thành mach máu)

từ giữa những năm 1930 đến những năm 50 đầu, nhưng thuật ngữ này đã lỗi thời vàkhông còn được sử dụng

Flavonoid phổ biến ở nhiều loại thực vật và có nhiều chức năng

Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc củahoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa dé thu hút nhiều độngvật đến thụ phan

Trong thực vật bậc cao, flavonoids tham gia vào lọc tia cực tim (UV), cộng

sinh cố định đạm va sắc tổ hoa

Flavonoids có thé hoạt động như một chất chuyền giao hóa học hoặc điều

chỉnh sinh ly Flavonoids cũng có thé hoạt động như các chất ức chế chu kỳ tế bào

18

Flavonoids được tiết ra bởi rễ các cây chủ dé giúp vi khuẩn Rhizobia trong

giai đoạn lây nhiễm của mối quan hệ cộng sinh với các cây họ đậu (legumes) như đậu

cô ve, đậu hà lan, cỏ ba lá (clover), và đậu nành Rhizobia sống trong dat có thé cảmnhận được chất flavonoid và tiết ra các chất tiếp nhận Các chất này lần lượt được cáccây chủ nhận biết và có thé dẫn đến sự biến dang các rễ cũng như một số phản ứngcủa tế bào chăng hạn như chất khử tạp chất ion va sự hình thành nốt san ở rễ (rootnodule).

Ngoài ra, một số chất flavonoid có hoạt tính ức chế chống lại các sinh vật gây

bệnh ở thực vật như Fusarium oxysporum.

Flavonoid (đặc biệt là các flavanoids như cathechin) là "nhóm phổ biến nhấttrong các hợp chat polyphenolic có trong chế độ dinh dưỡng của con người và đượctìm thấy khắp các loài thực vật Flavonol, như quercetin, cũng tìm thấy rộng rãi nhưngvới lượng ít hơn Sự phân bó rộng rãi của các flavonoid, cũng như đặc điểm đa dạng,độc tính tương đối thấp so với các hợp chất khác như alkaloid nên động vật, gồm cảcon người có thé tiêu thụ một lượng đáng kể trong khâu phan Thực phẩm có hàmlượng flavonoid cao như ngò tây, hành, việt quất và các berry khác, trà đen, trà xanh

và trà Ô long, chuối, các loại quả có múi, bạch quả, vang đỏ, hắc mai biển và socola

đen (với hàm lượng ca cao từ 70% trở lên).

19

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Cây Khôi nhung

Dược liệu Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard được thu hai từ cây Khôi nhung

3 năm tudi đã được trồng tại Vườn ươm — Viện công nghệ sinh học và môi

trường-ĐH Nông Lâm TP HCM (Giống được lấy từ Khu bảo tồn thiên nhiên — Văn hóa ĐồngNai, địa chi tại ấp 1, Mã Đà, Vĩnh Cửu, Đồng Nai, được trồng bằng phương pháp

giâm hom).

Thu 1 cây hoàn chỉnh, đầy đủ các bộ phận rễ, thân, lá dé thực hiện vi phẫu.Thu hái lá từ lá thứ 3 tính từ ngọn cây (không thu nhận lá non), loại bỏ các lágià, sâu bệnh, rửa sạch dé chuẩn bị bột lá Khôi nhung cho các nghiên cứu Khảo sát

độ âm và độ tro toàn phần của bột Khôi nhung, chuẩn bị dịch chiết

Vi khuẩn thử nghiệm

Các vi khuẩn dùng dé thử tác dụng kháng khuẩn: Escherichia coli, Salmonellađược phân lập và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Vi sinh của Viện công nghệ Sinh học

và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Hình 2.1: Cây Khôi nhung tại vườn ươm viện CNSH và MT

20

Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện từ tháng 04/2019 đến tháng 9/2020 tại Viên Công nghệ Sinhhọc và Môi trường trường đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Thiết bị, dụng cụ:

- Tủ say đảm bảo điều chỉnh nhiệt độ (103 + 2 °C) hiệu SANYO MOV - 112

- Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ 525 + 25 °C hiệu LENTON FURNACES,Made In England.

- Bề siêu âm Sonorex RK — 1028H (Bandelin)

- Máy cô quay BUCHI - 114 (Thụy Si)

- Máy đo quang phô

- Tủ ấm CO2

- Tủ lạnh sâu -84 °C, tủ lạnh thường.

- May li tâm, máy doc Elisa; Box Laminar PII.

- Binh đựng mức, pipet, ống nghiệm, ống đo các loại, bình chạy sắc kí

- Dia petri, pipet, micropipet

- Dung cy lam tiéu ban.

Hoa chat:

- Các chất tay nhuộm tiêu ban: nước Javen, xanh metylen, lora hydrat, đỏ sonphèn

- Các hóa chất dùng cho chiết xuất: methanol, hexan, ethyl acetate, n-butanol

- Các thuốc thử dùng cho định tính: TT Diazo, FeCl; 5%, NaOH 10%, NH4OH,HCI, H2SO4, KOH, NazSO¿a

- DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)

- Hóa chất khác: trichloroacetic acid, phosphate buffered saline, acetic acid, trisbase, sulforhodamine - B, trypsin.

21

- Các chất đối chứng: Acid ascorbic, Rutin.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu và nghiên cứu thực vật

2.2.1.1 Phương pháp thu mẫu, chuẩn bị bột Khôi nhung

Thu mẫu: thu một cây hoàn chỉnh có đủ các bộ phận rễ, thân lá dé thực hiện viphẫu, quan sát biểu bì lá

Chuẩn bị bột Khôi nhung: thu khoảng 2kg lá tươi, loại bỏ những lá bị sâu, vàng

úa, đưa đi rửa sạch và say khô ở nhiệt độ 50°C, sau đó dem xay min và sang lọc quarây 2mm, bột thu được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm chiết tách và soibột.

2.2.1.2 Quan sát biếu bì lá

Khi khảo sát các bộ phận của dược liệu có thể tách lấy riêng lớp biểu bì đểquan sát các đặc điểm của tế bào biểu bì, lớp cutin, cau tạo lỗ khí, lông che chở, lôngtiết, biểu bì tiết (nếu có)

Dé tách riêng lớp biểu bì: tiến hành dun mẫu lá (1cm?) trong dung dịch HNO3loãng trong thời gian 1-2 phút cho đến khi lá có màu vàng và có nhiều bọt khí trên bềmặt thì đừng lại, lấy mẫu lá ra rửa sạch bằng nước và đưa mẫu lá vào đĩa đồng hồđựng nước cat, ding kim mũi mác tách hai lớp biểu bì (trên và dưới) ra sau đó dùngđầu bút lông đánh nhẹ trên bề mặt (mặt trong của biểu bi) mẫu đã tach dé rửa sạchphần thịt lá, đặt lên lam kính và tiến hành quan sát

Ghi lại hình anh quan sát được qua kính hiển vi quang học và mô tả các đặcđiểm của biểu bì lá Khôi nhung

2.2.1.3 Vi phẫu

Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trongkiểm nghiệm dược liệu, trong đó hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩaquan trọng nhất trong khảo sát vi học

Tiêu bản vi phẫu Khôi nhung được chuẩn bị qua các giai đoạn sau: Chọn lấymột mẫu được liệu thích hợp sao cho có đủ các đặc điểm thực vật gồm có rễ, thân, lá

22

Dùng lưỡi dao cao cắt mẫu được liệu thành từng lát mỏng 10 - 20 im, mẫu vi phẫusau khi cắt được ngâm ngay vào nước javen 50% khoảng 15 đến 20 phút, sau đó rửasạch mẫu bằng nước cất và ngâm mẫu vào trong axit axetic 1% trong 5 phút, rửa lạibằng nước cất, đưa mẫu nhuộm trong dung dịch xanh metylen 0,1% trong 30 giâyđến 1 phút, lay mẫu ra rửa sạch bằng nước cất, nhuộm mau trong dung dịch carmin1% khoảng15- 20 phút sau đó lay mau ra rửa sạch bằng nước cat

Mau sau khi chuẩn bị xong được đưa lên kính hiển vi quan sát và ghi lại hìnhảnh quan sát được qua kính hiển vi quang học, mô tả các đặc điểm, hình dáng củamẫu vi phẫu

2.2.1.4 Soi bột

Mỗi dược liệu đều có những đặc điểm đặc trưng, chúng có thé được thé hiệnmột phần qua đặc điểm bột được liệu những đặc điểm này có thé được dùng dé phanbiệt dược liệu này với dược liệu khác.

Khảo sát bột được liệu bằng kính hiển vi nhằm mục đích tìm ra những đặc

điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu giúp cho việc định danh, xác định độ tinhkhiết của dược liệu, phân biệt với dược liệu dé nhằm lẫn và phát hiện sự gia mao nếu

z

có.

Trước khi soi kính hién vi quan sát bột bằng cảm quan (nhận định màu sắc, mùi

vi, độ min, nhám, xơ )

Chuẩn bị bột dé soi như sau: Lay lá Khôi nhung (là bộ phan sử dung lam dượcliệu), cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ 60°C, tán nhỏ, ray qua ray số 32 (ray mịn) Phần trênrây được tán và xay tiếp cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn

Cách lên tiêu bản bột soi như sau: Ngâm bột trong một ít nước Javen 50%,

thỉnh thoảng khuấy đều đến khi bột mất màu Rửa nhiều lần với nước cất Sau khichuẩn bị bột, cho một giọt nước lên phiến kính, dùng que sạch trộn đều bột, cho một

it bột vào giữa giọt chat lỏng, lấy một góc của lá kính khuấy nhẹ dé phân tán bột vàđậy kính lại Dùng ngón tay trỏ di nhẹ trên lá kính dé các phần tử của bột tách ra và

23