3.1. Nghiên cứu về thực vật 3.1.1. Quan sát biểu bì lá
Biểu bì lá Khôi nhung gồm nhiều tế bảo trong suốt, màng tế bào uốn lượn, vách tế bao day, xếp sát nhau, các tế bao sắp xếp theo kiểu di bào. Giữa các tế bảo có nhiều lỗ khí không, một số tế bao biểu bì mang các lông che chở đa bao và lông tiết
3.1.2.Đặc điểm vi phẫu a. Đặc điểm vi phẫu lá
Đặc điểm vi phẫu của lá Khôi nhung được thé hiện qua hình 3.2 và 3.3
38
Mô mềm Lông tiết
Điều bi
Hình 3.2. Đặc điểm vi phẫu gân lá Khôi nhung
Đặc điển của gân lá: Mặt cắt ngang của gân lá cho thấy hình thái bên ngoài của gân lá có hình bầu dục, lồi lên ở phần đưới, phần trên có một chỗ lõm ở giữa
Ngoài cùng của gân lá là lớp biéu bì trên và biéu bì đưới là lớp tế bào mỏng ở ngoài cùng phủ một lớp cutin mỏng, trên bề mặt biểu bì có các lông che chở đa bào và các lông tiết. Mô day nằm sát lớp biéu bì, gồm 5-7 lớp tế bào hình chữ nhật, kích thước nhỏ tế bào tròn, thành dày. Mô mềm thuộc loại mô mềm đặc, gồm các tế bảo tròn, to, thành mỏng. Mô cứng gồm các tế bào có màng hóa gỗ, làm thành hình chữ V xếp ở giữa gân lá, bắt màu xanh, làm thành các cột nâng đỡ bao quanh bó libe gỗ, bó libe gỗ xếp thành một hàng phía bao quanh gỗ.
Đặc điểm cua phiến lá: bên ngoài là lớp tế bào biểu bì với các tế bào hình chữ nhật, biểu bì dưới mang nhiều lông tiết hơn biểu bì trên, lông tiết có thân đa bào và đầu tiết đơn bào. Biểu bì tế bào hình đa giác; biểu bì trên gồm 2 lớp tế bào xếp song song, biểu bì đưới gồm một lớp tế bào. Tế bào mô mềm có hình lục giác, kích thước không đều, xếp chừa những khuyết nhỏ. Bó libe gỗ của gân phụ được bao quanh bởi một vòng tế bào mô mềm có kích thước to. Tinh thé calci oxalat hình cầu gai tập nam rãi rác khắp mô mềm và tập trung quanh bó libe gỗ của gân phụ. (hình 3.3)
39
b. Đặc điểm vi phẫu thân
Vi phẫu thân cây Khôi nhung được thể hiện qua hình 3.4 có hình tròn đối xứng
qua tâm.
Cấu tạo thân non (cách đỉnh sinh trưởng 5mm): chia làm 2 phần, phần vỏ bên ngoài cùng là lớp biểu bì với các tế bào có thành mỏng, bao quanh bởi các lông che chở day đặc và bên trong là các mô mén. phan trụ giữa có một vòng bó mạch bao quanh chia tách phần mô mềm vỏ và mô mềm tủy, vòng bó mạch chia làm 2 vùng mạch rây bên ngoài và mạch gỗ bên trong (hình 3.4).
Cấu tạo thân trưởng thành (cách đỉnh sinh trưởng Sem). Thân non va thân trưởng thành có cau tạo giống nhau tuy nhiên ở thân trưởng thành có ít lông che chở hơn, và vùng mạch gỗ lớn hơn rất nhiều lông che chở có cau tao phan lớn là các mô mềm, có một vòng bó mạch ở giữa Phần ngoài cùng của vùng vỏ là biểu bì biểu bì được bao quanh bởi rất nhiều lông che chở đa bào và một ít lông tiết. Các mô gỗ nối với nhau thành một vòng tròn bao quanh phần mô mềm tủy và được bao quanh bởi các mô
mém vỏ.
40
a) Vi phẫu thân Khôi nhung trưởng thành b) Vi phẫu thân Khôi nhung non c) Hình thái lông che chở của thân d) Mô mềm chứa các tinh thé canci
oxalat
c. Đặc điểm vi phẫu rễ
Vi phẫu cắt ngang của rễ Khôi nhung thấy được rễ có hình tron, vùng vỏ chiếm gần 3⁄4 diện tích vi phẫu, vùng trung trụ chiếm 3⁄4 diện tích
Vùng vỏ: ngoai cùng là ban có 7-10 lớp tế bao hình chữ nhật xếp thành day xuyên tâm và song song với nhau, nhiều chỗ bị nứt. Mô mềm vỏ gồm 15-20 lớp tế bào có hình bầu dục, vách tế bào mỏng, xếp chừa những đạo, rải rác khắp mô mềm vỏ có các tế bao mô cứng hình bau dục bên trong rỗng, bên ngoài thành cellulose day.
Vùng trung trụ: vùng trung trụ có cấu tạo không đối xứng qua tâm. Libe tạo thành vòng bao quanh gỗ, gỗ hai tạo thành vòng liên tục bao quanh gỗ 1, gỗ 1 gồm 3
41
đến 4 lớp bao quanh mô mềm tủy. Tia tủy đi từ tâm xuyên qua vùng gỗ và loe rộng ở vùng libe, là những tế bao hình chữ nhật xếp theo hướng xuyên tâm.
Tang lông hút
Hình 3.5. Đặc điểm vi phẫu rễ Khôi nhung 3.1.3 Đặc điểm của Bột lá Khôi nhung
Bột lá Khôi nhung có màu xanh lục, có mùi thơm nhẹ, vị hơi đắng, chát, bột
có các mảnh và một ít xơ sợi (hình).
42
Hình 3.6. Bột lá Khôi nhung
Bột lá Khôi nhung khi quan sát dưới kính hiển vi thấy có các lông che chở, biểu bì mang khí không, mãnh mạch vạch, mạch vòng, các sợi, các tinh thé calci oxalat hình cầu gai, hình thoi, mãnh tế bao lông tiết, các cấu trúc được thê hiện trong
hình 3.7
1. Manh tế bao lông tiết , 2. Soi có thành cellulose day, 3. Tế bao biểu bì với các lỗ khí không, 4 tinh thé Canxi xalat hình cầu gai, 5. Tinh thể Canxi oxalat hình thoi, 6.
Mãnh mạch mạng, 7.Các tế bào mô mềm có chứa tinh thé canxi oxalat 8. Mach vòng nằm trong mạch gỗ, 9. Mãnh mạch vạch
43
3.2. Khảo sát độ 4m và độ tro toàn phần của bột lá Khôi nhung 3.2.1. Xác định độ 4m mẫu nguyên liệu
Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ 4m nhất định gọi là độ an toàn, quá độ âm đó thì dược liệu dé bị lên mốc, hư hỏng, thành phần các chất chứa trong nguyên liệu bị biến đối. Việc xây dựng chỉ tiêu độ 4m cho được liệu là xác định giới hạn tối da cho phép của một dược liệu dé nó có thé giữ được chất lượng trong
quá trình bảo quản.
Qua phương pháp phân tích theo Dược điển Việt Nam IV được trình bày ở mục 2.2.2, độ âm của mẫu được thực hiện ba lần lặp lại, kết quả độ am trung binh
được ghi nhận ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả xác định độ 4m mẫu nguyên liệu
Khôi lượng mâu
Mẫu - - Độ âm (%)
Trước sây Sau sây
1 1,000 0,949 5,37 2 1,000 0,946 5,71 3 1,000 0,948 5,49
Trung binh 0,948 5,58 + 0,17
Kết quả cho thay độ 4m mẫu bột lá Khôi nhung đạt trung bình là (5,58 + 0,17)% phù hợp với tiêu chuẩn của Dược Điển học Việt Nam IV (2010) là âm độ dược liệu không quá 13%. Độ âm thấp có thé bảo quản bột trong thời gian dai.
3.2.2. Xác định độ tro mẫu nguyên liệu
Xác định độ tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong mẫu dược liệu. Đây là thành phần các chất vô cơ của được liệu, nhưng cũng có thể có thêm những tạp chất vô cơ lẫn vào dược liệu. Các loại cây khác nhau, sinh trưởng ở những vùng khác nhau có thành phần vô cơ khác nhau. Có những dược liệu có độ
44
tro cao hoặc thấp bat thường giúp cho việc phân biệt chúng với các được liệu khác và phòng chống giả mạo.
Qua phương pháp phân tích theo Dược điển Việt Nam IV được trình bày ở mục 2.2.2, độ âm của mẫu được thực hiện ba lần lặp lại, kết quả độ âm trung bình
được ghi nhận ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng tro mẫu nguyên liệu Khối lượng h ằ
x Khôi lượng bình va mau (g) Ham lượng
Mau mau (g) ‘
tro(%) Trước nung Sau nung
1 1,000 66,195 65,294 9,9 2 1,000 56,137 55,242 10,7 3 1,000 62,636 61,743 10,7
Trung binh 10,4 + 0,53
Kết quả cho thay độ tro toàn phan các mau cây lá khôi dat trung bình là (10,4 + 0,53)% phù hợp với tiêu chuẩn Theo Dược điển Việt Nam IV, độ tro toàn phan
không quá 12%.
3.3. Tách chiết các hợp chất từ bột lá Khôi nhung
Bột lá Khôi nhung được chiết bằng theo phương pháp tách chiết đã được trình bày trong mục 2.2.3. Khối lượng các cao chiết thu được qua 3 lần thực hiện, kết quả trung bình va hiệu suất chiết của mỗi phân đoạn cao chiết được trình bay theo bảng
Siằ
45
Bảng 3.3. Hiệu suất chiết các cao chiết từ Bột lá Khôi nhung
Bot Cao ; Hiéu suat , Khôi lượng(g)
Khôi chiét (%)
nhung (g) Lan] Lần2 Lan3 Trung binh
hexan 0.438 0.441 0.427 0,44+0,01 4,35+0,1 AE 0.966 0.976 0.973 0,972+0,01 9,72+0,1 10
butanol 2.211 2.124 2.109 2,14840,06 21,48+0,6
Nước 0.919 0.933 0937 0,93010,01 9,297+0,1
Các cao chiết sau khi đã xác định khối lượng được định mức thành 50ml dịch chiết với các dung môi đã sử dụng để chiết tách tương ứng. Các dịch chiết này sẽ được sử dung dé định tính các thành phần hóa học va thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn va kháng oxy hóa.
3.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học
3.4.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học
Khảo sát thành phần hóa học của các hợp chất trong thực vật có ý nghĩa quan trọng trong xác định các nhóm chất và tác dụng của các chất này. Khi xác định được các chất hiện diện trong cây từ đó giúp xác định cấu trúc, chức năng và việc tách chiết từng chất dé dang và ít tốn kém thời gian, chi phí. Đồng thời qua việc xác định sự hiện diện của các hợp chat trong cây cũng góp phan nâng cao giá trị sử dụng nhờ những hợp chất có trong cây.
Kết quả định tính qua bảng 3.4 cho thấy:
Dịch chiết hexan có chứa các hợp chất coumarin, tanin, saponin và hợp chất
polyuronic.
Dịch chiết etyl acetate có chứa các hop chat carotenoid, coumarin,
Anthraquinon, Anthocyanosid, tanin, va alkanoid.
46
Dịch chiết butanol có chứa các hợp chất carotenoid, tanin, polyuronic, alkanoid, flavonoid và chất khử
Dịch chiết nước có chứa Anthraquinon, Anthocyanosid, Proanthocyanidin, tanin, saponin, acid hữu cơ, akaloid, flavonoid va chat khtr
Két qua dinh tinh cac hop chat trong cac dich chiét va hiéu suat tach chiét cho thấy: dich chiết hexan có thành phan các hợp chat ít nhất và hiệu suất chiết thấp nhất với 4 hợp chat và hiệu suất chiết là 4,35+0,1%. Dịch chiết butanol cũng chứa 4 hợp chất nhưng hiệu suất chiết cao nhất là 21,48+0,6% điều này cho thấy trong dịch chiết
Butabol chứa hàm lượng lớn carotenoid, tanin, polyuronic, alkanoid
47
Bảng 3.4. Kết quả định tính thành phần hóa học
Kết quả định tính các dich chiết
Phản ứng Dịch .“ Dịch Dịch
Nhúm hợp chất Thuốc thử ; ô chiột = 1
dương tính chiết chiết chiết
etyl
hexan butanol nước
acetate
Xanh duong
Carotenoid H2SO4 - + + - hay xanh đậm
- Phát quang có hiện tượng
Coumarin 4 „ L + = 2 trong kiém van duc
Anthraquinon KOH 10% - + - + Anthocyanosid HCl Do - + - +
Proanthocyanidin HCI/ nhiệt độ Đỏ - - - + - Xanh rêu hay
Tanin dd FeC13 + + + + xanh đen
Saponin Lac manh dd Bot bén SE - - bã
Acid hữu cơ Na2CO3 Sui bọt - - 2 + : - Tủa bông
Hợp chât Pha loãng với :
- : trăng- vàng + - + + polyuronic con 90%
nau
Akaloid TT Dragendorff Tua do cam - + + +
; Dd có mau đỏ
Flavonoid Mg/ HCl dd ` - - + + hong
: ; Mau do gach
Chat khir TT Fehling - - + + ở đáy
48
3.4.2 Định lượng một số hợp chat trong dịch chiết lá cây Khôi nhung
3.4.2.1. Hàm lượng polyphenol
Biểu đồ thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ acid gallic và mật độ quang của mỗi nồng độ được thẻ hiện trong hình 3.8.
Sau khi dựng đường chuẩn acid gallic trong dãy nồng độ 10; 20; 30; 40; 50 ug/mL, xác định được phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0216x + 0,0527; với R2
= 0,9866. Giá trị hệ số gốc của đường chuẩn là a = 0,0216; giá tri giao diém b = 0,0527. Từ đó xác định polyphenol téng số của các mẫu tổng dựa vào hệ số a và b trong phương trình đường chuẩn acid gallic xác định được thông qua mật độ quang đo được của mẫu. Hàm lượng polyphenol tổng số của mẫu được tính bằng công thức và kết quả được thé hiện ở bảng 3.5.
_ te y = 0,0216x + 0,0527 R?= 0,9866
=
Mật độ quang (nm) o œ° ð ¿
°o
0 10 20 30 40 50 60
Hàm lượng (ug/ml)
Hình 3.8. Đường chuẩn acid gallic
49
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol
Lần „ Hệ _ Thể tích „
Khôi lượng Nông độ trên Ket quả lặp pha „ định mức Abs
cần (g) đường chuân (%CK) lai loang f (ml)
1 1,0089 10 22,87 10 0,54668 0,25
2 1,0019 10 25,23 10 0,59762 0,28 3 1,0095 10 23,22 10 0,55432 0,26 TB 1,0068+0,04 10 23,7741,17 10 0,56621+0,03 0,26+0,02
Hàm lượng polyphenol téng số của các nghiệm thức dat 0,26 %CK tương
đương với hàm lượng 2,6mg/g, hàm lượng polyphenol trong các nghiệm thức thu
được thấp hơn so với thí nghiệm được thực hiện khảo sát trên chẻ (nguyên liệu từ non đến già) của tác gia Nguyễn Trung Khoa và ctv (2011) là 14,63 %CK đến 26,60 %CK (mẫu được sấy ở 70°C) và thấp hơn 16,05 lần hàm lượng polyphenol trong lá Ardisia
elliptica (41,75 mg/g )(Siti-Azima va ctv, 2013) 3.4.2.2. Ham lượng tanin
Hàm lượng Tannin được xác định bằng phương pháp oxy hóa. Trong môi trường acid mạnh MnO/ - bị khử về Mn?*. Trong môi trường acid yếu, trung tính hay kiềm thì MnO¿' chỉ bị khử tới MnO›. Qúa trình chuẩn độ chuyển từ màu xanh tim đậm chuyền sang màu vàng thì dừng lại. Tiến hành theo phương pháp oxy hóa, quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dich thử chuyên sang màu vàng. 1 mL dung dịch KMnO¿ 0.1N tương ứng với 0,004157 g tanin tinh khiết.
50
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm định lượng tanin
Số ml chuẩn Số ml chuẩn độ
Lần ' - Kết quả,%
Dược liệu độ cho mầu cho mau thử
lặp lại ‘ (w/w)
trang (ml) (ml)
1 0,75 1,60 8,84
Lá khôi 2 0,70 1,600 9,35
3 0,70 1,50 8,31 TB 0,71+0,03 1,50+0,06 8,80 + 0,52
Dựa vào kết qua bang 3.6 kết qua thử nghiệm định lượng tanin là (8,80 + 0,52)
% tương đương với hàm lượng 88 + 0,52mg/g. Theo dược liệu Việt Nam hàm lượng
tanin có trong lá 6i từ 7 — 10%. Như vậy, hàm lượng tanin của lá khôi đạt 8,80% gan bằng với lượng tanin trong lá ôi (một loại lá có hàm lượng tanin cao, thường dùng dé chữa đau bụng). Khi so sánh với hàm lượng tanin trong lá Trà thì thấy rằng hàm lượng tanin của lá Khôi nhung cao gấp 2.44 — 2,2 lần so với lá Trà khi lá Trà có hàm lượng tanin dao động trong khoảng 36,1 — 39,9mg/g (Nguyễn Trọng Tuân va Võ Văn Luận,
2020).
3.4.2.3. Hàm lượng Flavonoid
Xác định hàm lượng Flavovnoid với đường chuẩn Rutin.
12 +
y =0,0143x + 0,0177 1+ R? = 0,9904
2 0.8 5 0.6
= 0.4
0.2
0 t t t † † † 1 0 10 20 30 40 50 60 70
Mật độ (ug/ml)
Hình 3.9. Đường chuẩn Rutin
51
Sau khi dựng đường chuẩn rutin với các thé tích 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; 2,4 ml,
xac dinh duoc phuong trinh hồi quy tuyến tính y = 0,0143x + 0,0177; với R? = 0,9904.
Giá trị hệ số gốc của đường chuẩn là a = 0,0143; giá trị giao điểm b = 0,0177. Từ đó xác định flavanoid tổng số của các mẫu tông dựa vào hệ số a và b trong phương trình đường chuẩn rutin xác định được thông qua mật độ quang đo được của mẫu. Hàm lượng flavanoid tổng số của mẫu được tính bằng công thức và kết quả được thể hiện
ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng Flavonoid
: Hàm lượng : Khôi lượng . : Lân lặp lại ân() Abs Conc (mg/L) flavonoid tong so
cân(g
(mg/g)
1 1,001 0,572 38,783 1,162 2 1,004 0,578 39,154 1,560 3 1,009 0,596 40,469 1,604 TB 1,005 0.004 0,582+40.005 39,468+0,89 1,442 + 0,19
Hàm lượng Flavonoid trung bình qua các lần lặp lại của dịch chiết từ lá cây khôi đạt 1,442 + 0,19 (mg/g) thấp hơn so với kết quả nghiên cứu hàm lượng Flavonoid từ lá cây Rau Sam (P. oleracea.) (1,76 mg/g) (Hongbin Zhu. 2009) và thấp hơn hàm
lượng flavonoid trong lá Ardisia Elliptica khi hàm lượng flavonoid trong lá Ardisia Elliptica là 36,91mg/g (A. M. Siti-Azima và cộng sự, 2013).
3.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh hoc của cay Khôi nhung
3.5.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro — phương pháp DPPH
Khả năng kháng oxy hóa của các dịch chiết được xác định thông qua độ hấp phụ mau ở bước sóng 517nm khi so sánh với đường chuẩn của vitamin C được thé
hiện qua hình 3.10.
52
Hoạt tính kháng oxy hóa
220.17
210.03 200
= 150 Bp
R 100
4
50 415,02 sical 15.81
> =m . m0
VTMC MEOH Hexan Etyl Acetate Butano Nước
Hình 3.10. Biéu đồ thé hiện hoạt tinh kháng oxy hóa của các dịch chiết
DPPH là một trong những xét nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất dé đánh giá khả năng quét gốc tự do và cao chiết A. Silvestris cho thay hoạt động bắt gốc tự do cao hon với giá trị IC 50 của cao tong methanol là 24,01 ug/ ml khi so sánh với
Ardisia solanacea Roxb. Leaf có giá trị IC50 là 198,43+ 1,30 kg/ ml (R. Pratap
Chandran và ctv, 2013), hay khi so sánh với dịch chiết lá Trắc bách diệp cũng cho thấy khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Khôi nhung tốt hơn khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá bách diệp gấp 4.86 lần khi khả năng quét gốc tự do của dịch chiết methanol lá Trắc bách diệp đạt 50% ở nồng độ 236,97 ug/ml (Võ Trọng Tuan
và Võ Văn Luận (2020).
Nhìn vào biểu đồ thé hiện hoạt tính kháng oxy hóa của các dich chiết phân đoạn có thé thay rang: Trong các dịch chiết thì dich chiết butanol có khả năng khang oxy hóa cao nhất với IC50 là 15,81 pg/ml và gần bằng vitamin C với IC50 là 15,02 mg/ml, tiếp đến là dich chiết nước, sau đó là dịch chiết Ethyl acetate với IC50 lần lượt là 210,03 pg/ml và 220,17 pg/ml . Dịch chiết hexan không thể hiện tính kháng oxy hóa. Điều này cho thấy các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa cao trong dịch chiết lá Khôi nhung là những chất có tính phân cực tương đối cao và được tập trung trong dịch chiết butanol.
53
Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của các dịch chiết trong thí nghiệm tăng lên cùng độ phân cực của dung môi chiết từ hexan, ethyl acetate đến butanol, sau đó giảm xuống ở dich chiết nước, dịch chiết nước có khả năng kháng oxy hóa thấp là do các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa đã hòa tan gan hết trong butanol.
Kết quả này có sự tương ứng với kết quả của Đái Thị Xuân Trang và Võ Thị Tú Anh (2016) khi thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết hexane, chloroform và ethyl acetate đã cho kết quả là ethyl acetate có khả năng bắt góc tự do lớn nhất là lớn nhất (79,03 %), sau đó là cao cloroform và 56,27 % và thấp nhất là hexane (29,23
%) ở nồng độ cao chiết là 700pg/ml.
3.5.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
3.5.2.1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
a). Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết đối với Echerichia coli.
Kết quả đánh giá khả năng kháng vi khuẩn E.coli được ghi nhận và trình bày
ở hình 3.11.
Từ kết quả hình 3.11 cho thấy, các dịch chiết hexan và dịch chiết nước trong trong thí nghiệm nay không có khả năng kháng lại vi khuan E.coli, ở đĩa thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch chiết butanol vi khuẩn phát triển không phát triển được. Dịch chiết etyl acetate thé hiện khả năng kháng E.coli với vòng kháng khuẩn 19,54+0,13mm cao hơn 1,33 lần so với kháng sinh với vòng kháng khuan của kháng sinh là 15,35mm và kết quả này tương đương với kết quả của Biet V. Huynh và ctv năm 2020 với kích thước vòng kháng khuẩn là 20,67+ 0,94mm.
54