2.1. Vật liệu và hóa chất nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu Cây Khôi nhung
Dược liệu Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard được thu hai từ cây Khôi nhung
3 năm tudi đã được trồng tại Vườn ươm — Viện công nghệ sinh học và môi trường- ĐH Nông Lâm TP HCM (Giống được lấy từ Khu bảo tồn thiên nhiên — Văn hóa Đồng Nai, địa chi tại ấp 1, Mã Đà, Vĩnh Cửu, Đồng Nai, được trồng bằng phương pháp
giâm hom).
Thu 1 cây hoàn chỉnh, đầy đủ các bộ phận rễ, thân, lá dé thực hiện vi phẫu.
Thu hái lá từ lá thứ 3 tính từ ngọn cây (không thu nhận lá non), loại bỏ các lá
già, sâu bệnh, rửa sạch dé chuẩn bị bột lá Khôi nhung cho các nghiên cứu Khảo sát độ âm và độ tro toàn phần của bột Khôi nhung, chuẩn bị dịch chiết.
Vi khuẩn thử nghiệm
Các vi khuẩn dùng dé thử tác dụng kháng khuẩn: Escherichia coli, Salmonella được phân lập và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Vi sinh của Viện công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Hình 2.1: Cây Khôi nhung tại vườn ươm viện CNSH và MT
20
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện từ tháng 04/2019 đến tháng 9/2020 tại Viên Công nghệ Sinh học và Môi trường trường đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất Thiết bị, dụng cụ:
- Tủ say đảm bảo điều chỉnh nhiệt độ (103 + 2 °C) hiệu SANYO MOV - 112.
- Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ 525 + 25 °C hiệu LENTON FURNACES,
Made In England.
- Bề siêu âm Sonorex RK — 1028H (Bandelin).
- Máy cô quay BUCHI - 114 (Thụy Si)
- Máy đo quang phô - Tủ ấm CO2.
- Tủ lạnh sâu -84 °C, tủ lạnh thường.
- May li tâm, máy doc Elisa; Box Laminar PII.
- Binh đựng mức, pipet, ống nghiệm, ống đo các loại, bình chạy sắc kí...
- Dia petri, pipet, micropipet ....
- Dung cy lam tiéu ban.
Hoa chat:
- Các chất tay nhuộm tiêu ban: nước Javen, xanh metylen, lora hydrat, đỏ son
phèn...
- Các hóa chất dùng cho chiết xuất: methanol, hexan, ethyl acetate, n-butanol.
- Các thuốc thử dùng cho định tính: TT Diazo, FeCl; 5%, NaOH 10%, NH4OH,
HCI, H2SO4, KOH, NazSO¿a....
- DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)
- Hóa chất khác: trichloroacetic acid, phosphate buffered saline, acetic acid, tris
base, sulforhodamine - B, trypsin.
21
- Các chất đối chứng: Acid ascorbic, Rutin.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu và nghiên cứu thực vật 2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu, chuẩn bị bột Khôi nhung
Thu mẫu: thu một cây hoàn chỉnh có đủ các bộ phận rễ, thân lá dé thực hiện vi phẫu, quan sát biểu bì lá.
Chuẩn bị bột Khôi nhung: thu khoảng 2kg lá tươi, loại bỏ những lá bị sâu, vàng úa, đưa đi rửa sạch và say khô ở nhiệt độ 50°C, sau đó dem xay min và sang lọc qua rây 2mm, bột thu được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm chiết tách và soi
bột.
2.2.1.2. Quan sát biếu bì lá
Khi khảo sát các bộ phận của dược liệu có thể tách lấy riêng lớp biểu bì để quan sát các đặc điểm của tế bào biểu bì, lớp cutin, cau tạo lỗ khí, lông che chở, lông tiết, biểu bì tiết (nếu có)
Dé tách riêng lớp biểu bì: tiến hành dun mẫu lá (1cm?) trong dung dịch HNO3 loãng trong thời gian 1-2 phút cho đến khi lá có màu vàng và có nhiều bọt khí trên bề mặt thì đừng lại, lấy mẫu lá ra rửa sạch bằng nước và đưa mẫu lá vào đĩa đồng hồ đựng nước cat, ding kim mũi mác tách hai lớp biểu bì (trên và dưới) ra sau đó dùng đầu bút lông đánh nhẹ trên bề mặt (mặt trong của biểu bi) mẫu đã tach dé rửa sạch phần thịt lá, đặt lên lam kính và tiến hành quan sát.
Ghi lại hình anh quan sát được qua kính hiển vi quang học và mô tả các đặc điểm của biểu bì lá Khôi nhung.
2.2.1.3. Vi phẫu
Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu, trong đó hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học.
Tiêu bản vi phẫu Khôi nhung được chuẩn bị qua các giai đoạn sau: Chọn lấy một mẫu được liệu thích hợp sao cho có đủ các đặc điểm thực vật gồm có rễ, thân, lá.
22
Dùng lưỡi dao cao cắt mẫu được liệu thành từng lát mỏng 10 - 20 im, mẫu vi phẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước javen 50% khoảng 15 đến 20 phút, sau đó rửa sạch mẫu bằng nước cất và ngâm mẫu vào trong axit axetic 1% trong 5 phút, rửa lại bằng nước cất, đưa mẫu nhuộm trong dung dịch xanh metylen 0,1% trong 30 giây đến 1 phút, lay mẫu ra rửa sạch bằng nước cất, nhuộm mau trong dung dịch carmin
1% khoảng15- 20 phút sau đó lay mau ra rửa sạch bằng nước cat
Mau sau khi chuẩn bị xong được đưa lên kính hiển vi quan sát và ghi lại hình ảnh quan sát được qua kính hiển vi quang học, mô tả các đặc điểm, hình dáng của mẫu vi phẫu.
2.2.1.4. Soi bột
Mỗi dược liệu đều có những đặc điểm đặc trưng, chúng có thé được thé hiện một phần qua đặc điểm bột được liệu. những đặc điểm này có thé được dùng dé phan
biệt dược liệu này với dược liệu khác.
Khảo sát bột được liệu bằng kính hiển vi nhằm mục đích tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu, phân biệt với dược liệu dé nhằm lẫn và phát hiện sự gia mao nếu
z
có.
Trước khi soi kính hién vi quan sát bột bằng cảm quan (nhận định màu sắc, mùi
vi, độ min, nhám, xơ...)
Chuẩn bị bột dé soi như sau: Lay lá Khôi nhung (là bộ phan sử dung lam dược liệu), cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ 60°C, tán nhỏ, ray qua ray số 32 (ray mịn). Phần trên rây được tán và xay tiếp cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn.
Cách lên tiêu bản bột soi như sau: Ngâm bột trong một ít nước Javen 50%,
thỉnh thoảng khuấy đều đến khi bột mất màu. Rửa nhiều lần với nước cất. Sau khi chuẩn bị bột, cho một giọt nước lên phiến kính, dùng que sạch trộn đều bột, cho một it bột vào giữa giọt chat lỏng, lấy một góc của lá kính khuấy nhẹ dé phân tán bột và đậy kính lại. Dùng ngón tay trỏ di nhẹ trên lá kính dé các phần tử của bột tách ra và
23
phân tán đều. Loại bỏ phần bột và nước dư thừa ngoài lá kính bằng giấy thấm. Lau sạch mặt trên phiến kính và lá kính trước khi soi kính hiền vi.
Quan sát và ghi lại hình ảnh quan sát được qua kính hiển vi quang hoc. Mô ta
đặc điểm các thành phần của bột như: các mãnh mach, sợi, tinh thé calci oxalat...
2.2.2. Khảo sát độ 4m và độ tro toàn phan của bột Khôi nhung a. Xác định độ 4m của dược liệu
Nguyên tắc: Dùng nhiệt dé làm bay hơi nước có trong mau. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi say, tinh được độ âm của mau.
Tiến hành:
Say chén sứ ở nhiệt độ 105 °C. Dé nguội trong bình hút 4m 15 phút rồi dem cân dé xác định khối lượng. Lap lai cho đến khi khối lượng chén sứ không đổi.
Cân chính xác khoảng 1g được liệu và chén sứ, trải đều mẫu dược liệu ở đáy chén sứ và sấy ở nhiệt độ 105 °C, áp suất thường trong 4 giờ. Đề nguội trong bình hút âm 15 phút, cân và ghi nhận khối lượng.
Tiếp tục sấy mẫu ở 105 °C, áp suất thường trong 1 giờ, đề trong bình hút âm đến nguội va cân lại khối lượng. Lặp lại nhiều lần cho đến khi cân 3 lần liên tiếp khối lượng không đổi, độ chênh lệch không quá 5 mg.
Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, tính giá trị trung bình.
Công thức tính: — A = (a-b)/b * 100%
Trong đó:
A: Độ âm dược liệu (%)
a: Khối lượng được liệu trước khi sấy (g) b: Khối lượng dược liệu sau khi say (g) b. Xác định độ tro toàn phần
Nguyên tắc: Dùng sức nóng (550 - 600°C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ.
Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong thực phẩm.
Tiến hành
24
Nung chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi sau ba lần cân liên tiếp. Cân chính xác khoảng 1g được liệu cho vào chén sứ. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cần thận trên bếp điện đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Dùng kẹp sắt dai đưa chén vào lò nung ở 550 °C (đeo kính bảo vệ mắt) và nung đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dé nguội trong bình hút âm 30 phút. Cân và ghi lại kết quả.
Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong vòng 1 giờ nữa, dé nguội trong bình hút ẩm và cân, ghi nhận kết qua
Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro
chênh lệch không quá 0,5 mg.
Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, tinh gia tri trung bình.
Công thức tính
X = ((a-b)/c)*100%
Trong đó:
X: độ tro toàn phần của dược liệu (%) a: khối lượng chén có tro (g)
b: khối lượng chén không tro (g) c: khối lượng được liệu dùng (g)
2.2.3. Phương pháp tách chiết
Chiết xuất các hợp chất thực hiện theo phương pháp chiết xuất được Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựa, (1985)
Tach chiết cao tổng bằng phương pháp ngâm dầm kết hợp đánh sóng siêu âm.
Cơ sở của phương pháp này là sử dụng sóng siêu âm làm tăng cường quá trình
phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường quá trình chuyên khối, từ đó có thể làm tăng hiệu suất trích ly. Bên cạnh đó, phương pháp này cũng cho phép rút ngắn thời gian trích ly và làm giảm tiêu tốn dung môi...(Trần Chí Hải và ctv, 2016)
25
Tiến hành: Ngâm bột nguyên liệu (10g) trong bình chứa bằng thủy tinh với 200ml dung môi methanol, đánh sóng siêu âm 30p ở 40°C, Sau đó dé qua đêm ở nhiệt độ phòng đề cho dung môi xuyên thấm qua các tế bào thực vật, hòa tan các hợp chất thứ cấp có trong nguyên liệu và khuếch tán ra bên ngoài, gạn lấy dịch và cho tiếp dung môi methanol vào ngâm tiếp qua đêm, gạn lấy dịch chiết, bã còn lại tiếp tục ngâm và chiết cho đến khi dung môi không còn vết khi dé bay hơi trên giấy thấm.
Gộp các dịch chiết lại, dịch chiết được cất loại hết đung môi ở áp suất giảm đến lượng khô, sau đó thêm nước cất nóng 60 °C vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethylacetate, n-butanol. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lẫn một lượng nhỏ thẻ tích dung môi hữu cơ, chiết đến khi không còn chất hòa tan trong dung môi thì đổi sang dung môi khác có độ phân cực cao hơn. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng NaaSOa,
lọc và cất kiệt dung môi bang máy cat quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ < 50 °C. Can được sấy khô và cân dé xác định khối lượng.
Như vậy, từ toàn bộ phần trên lá của cây Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard đã thu nhận được 4 phân đoạn gồm n-hexane, ethylacetate, n-butanol và phan còn lại
sau cùng là cao nước với các ký hiệu tương ứng là: cao n-hexane (HK), cao ethylacetate (EK), cao n-butanol (BK) va cao nước (NK).
Sau khi phân lập được các cao chiết sẽ tiến hành định tính thành phần hóa học trong các cao chiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các cao chiết.
26
Methanol Bột dược liệu
Bã dược liệu
Dịch chiết methanol
Cô giảm áp Cao methanol téng
Lắc phân đoạn
Dịch lắc Dịch nước
N-butanol ae lai
Cô giảm ap Cô giảm áp Cô giảm áp Cô sim áp
Cao Cao Cao n-hexan Ethyl acetat N-butanol
Hình 2.2. So đồ tách chiết các hợp chat từ cây Khôi nhung Ardisia silvestris Pitard
Dịch lắc
n-hexan
2.2.4. Định tính thành phần hóa học trong các cao chiết
Định tính alcaloid TT: Mayer.
Công thức:
+ Dung dich A: 1,36 g HgCh + 60 ml nước cất + Dung dich B: 5 g KI + 10 ml nước cất
Hỗn hop 2 dung dich A va B, thêm nước cat vừa đủ 10 ml ta thu được hỗn hop thuốc thir Mayer.
Lay 1 ml dich chiết cho vào ống nghiệm, cho thêm 3 — 5 giọt TT Mayer vào, nếu xuất hiện kết tủa vàng hoặc trang là phan ứng dương tính.
TT: Dragendorf.
Công thức:
+ Dung dịch A: 8 g Bi(NO)3-H20 + 25 ml dd HNO3 30% (d= 1,18)
+ Dung dich B: 28 g KI + 1 ml dd HCI 6N + 5 ml nước cat.
2
Hỗn hợp 2 dung dịch A và B, để yên trong tủ lạnh ở 5°C cho tủa màu nâu sậm và tan trở lại, lọc, thêm nước cất vừa đủ 100 ml, được TT Dragendorf
Lay 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm rồi cho thêm 2 — 3 giọt TT Dragendorf, nếu có tủa đỏ là phản ứng dương tính.
Định tính flavonoid
Cho vao ba ống nghiệm nhỏ mỗi ống 1 ml dịch chiết lần luợt cho vào các ống
nghiệm như sau:
Ong 1: cho một ít bột Mg hoặc Zn (khoảng 10 mg) vào sau đó cho thêm vào từ từ từ 3 — 5 giọt acid HCI đặc đề yên vài phút nếu thấy dung dịch chuyên sang màu đỏ
thì phản ứng dương tính.
Ong 2: cho vào một ít dung dich NaOH 10% nếu thấy kết tủa vàng, thì cho tiếp 1 ml nước cất nếu tủa tan và màu vàng tăng lên thi phản ứng dương tính.
Ong 3: vào vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl; 5% nếu thấy kết tủa den
là phản ứng dương tính.
Định tính coumarin
+ Phản ứng mở vòng Lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết. Ong 1 thêm 0,5 ml dung dich NaOH 10%, ống 2 dé nguyên. Dun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội nếu thầy ống 1 có màu vàng đậm va đục, ống 2 không thay đổi. Thì tiếp tục thêm 4 ml nước cat, lắc đều thấy ống 1 trong, ông 2 trở nên đục, tiếp tục cho thêm vào ống 1 vài giọt HCI đậm đặc thấy ống 1 tủa đục, ống 2 vẫn đục.
+ Phản ứng Diazo hóa:
Cho vào một ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% đun sôi rồi để nguội, thêm vài gọt TT Diazo mới pha (hòa tan 0,9 g acid sunfanilic trong 9 ml HCl đậm đặc, đun nóng, thêm nước vừa đủ 100 ml. Lay 10 ml dich đó ngâm trong nước đá rồi cho thêm 10 ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa ngâm trong đó. Lắc đều rồi giữ ở 0°C, dung dịch pha xong dùng ngay).
Nếu xuất hiện màu đỏ gạch ching tỏ phản ứng dương tính.
28
Định tính tamin
Lay khoảng 1g bột khô dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 20 ml nước cất và đun sôi trong 2 phút. Dé nguội, lọc. Lay 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 2 ml dịch lọc rồi thêm vào các dịch lọc và quan sát:
+ Ong 1: 2 giọt dung dịch FeCl3 5% nếu xuất hiện tủa màu nâu đen thì phản
ứng dương tính.
+ Ong 2: 2 giọt dung dich gelatin 1% nếu xuất hiện tủa bông thì phản ứng đương
tính.
+Ong 3: 2 giọt dung dịch chi acetate 10% nếu có xuất hiện tủa bông trắng trong
thì phản ứng dương tính.
Định tính saponin
Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột được liệu thêm 5 ml nước. Dun sôi nhẹ, lọc lây dịch chiết cho vào ống nghiệm lớn khác. Lắc mạnh theo chiều đọc trong 5 phút.
Đề yên trong vòng 15 phút. Nếu cột bọt bền sau 15 phút thì kết luận là có saponin.
Định tính anthranoid
Lay 2 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết rồi thêm vào mỗi ống như
sau:
+ Ong 1: thêm 1 ml dung dịch ammoniac 10%, lắc nhẹ. Nếu lớp nước có màu
do sim, lớp choloroform có màu vàng xanh thi phản ứng dương tính.
+ Ong 2: thêm 1 ml dung dich NaOH 10% lắc nhẹ, nếu thấy mau đỏ nhạt xuất
hiện thì tức là phản ứng dương tính.
Định tính Glucosid tím
Thực hiện các phản ứng như sau:
+ Phan ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5 ml dich chiết, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính.Cho 1 ml dịch chiết vào một ống nghiệm, cô cách thủy tới khô, cho 0,5 ml Anhudric acetic vào lắc đều cho tan hết cắn, đặt nghiêng 50°, thêm 0,5 ml H2SO4
29
đặc theo thành ống nghiệm, nơi tiếp xúc hai lớp chất mỏng nếu thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ ở trên có màu xanh là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng Baljet: Cho 1 ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm thuốc thử Balijet mới pha (gồm 1 phần dung dich acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH
10%), nếu có xuất hiện mau cam thi phản ứng dương tính.
Định tính caroten
Cho 2 ml dịch chiết
vào ống nghiệm. Đề bốc hơi dung môi đến khô, thêm 2 giọt acid sulfuric đặc vào cắn nếu thấy có xuất hiện màu xanh thì phản ứng dương tính.
Các phản ứng dương tính chứng tỏ là trong được liệu Khôi nhung có các chất
đang khảo sát.
Định tính các acid hữu cơ
Làm dịch chiết giống như ở phan định tính tamin, thêm vài hạt tinh thé Natri cacbonat nếu xuất hiện bọt khí thì nhận xét sơ bộ có acid hữu cơ.
Định tính đường khử
Làm dịch chiết giống ở phần định tính tamin, thêm T.T Fehling A và T.T Fehling B đun sôi cách thủy 10 phút, nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì nhận xét sơ
bộ có đường khử.
2.2.5. Phương pháp định lượng các hợp chat bằng quang pho hap thu nguyên tử
UV - VIS
2.2.5.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp Folin-
Ciocalteu được Fu và cộng tác viên mô tả (Fu và ctv., 2011).
Nguyên tắc:
Dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu (FC) để xác định các polyphenol trong dịch chiết. FC chứa chat oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử các nhóm hydroxy phenol dé bị oxi hóa, chat oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực
30