Báo cáo th cđbtv n9 ct4

Sau khi ly trích DNA, nồng độ và độ tinh khiết của DNA cần được kiểm tra trước khi sử dụng cho các ứng dụng khác nhau, như PCR và các ứng dụng khác.. Các sản phẩm này bao gồm lyso

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SHPT

Nhóm sinh viên thực hiện : NHÓM 9

Tp Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT BẰNG SHPT

Giảng viên hướng dẫn:

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Trần Châu Anh 21126900

Trịnh Ngọc Khánh 21126373

Võ Huỳnh Thảo Vy 20126176

Tp Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 3

DANH SÁCH CÁC BẢNG 4

DANH SÁCH CÁC HÌNH 6

Bài 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Bệnh Đen xơ mít 1

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Pantoea stewartii 2

1.3 Phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn 2

1.4 PCR và Điện di tổng số Vi khuẩn Pantoea stewartii 3

1.5 Primer đặc hiệu cho Pantoea stewartii 4

Bài 2 LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS BUFFER 6

2.1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị 6

2.2 Phương pháp thực hiện 6

2.3 Kết quả 6

Bài 3 ĐIỆN DI TỔNG SỐ 8

3.1 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 8

3.2 Phương pháp thực hiện 8

3.2.1 Qui trình điện di DNA tổng số 8

3.2.2 Phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA 8

3.3 Kết quả 9

Bài 4 CHẠY PCR VỚI PRIMER CHUYÊN BIỆT 1 11

4.1 Vật liệu và phương pháp 11

4.1.1 Vật liệu 11

4.1.2 Phương pháp 11

4.2 Kết quả 11

Bài 5 CHẠY PRIMER CHUYÊN BIỆT 2 VÀ SO SÁNH KẾT QUẢ 13

5.1 Vật liệu và phương pháp 13

5.1.1 Vật liệu 13

5.1.2 Phương pháp: 13

5.2 Kết quả 14

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Tran

g

Bảng 3.1 Thành phần của phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA 8

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA 9

Bảng 4.1 Thành phần master mix 11

Bảng 4.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 11

Bảng 5.1 Thành phần master mix 13

Bảng 5.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 13

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tran

g

Hình 1.1 Con đường xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh 2

Hình 2.1 Kết quả thực hiện ở bước 1, 2, 3 7

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 9

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 16S 10

Hình 4.1 Kết quả điện đi quan sát dưới đèn UV 12

Hình 5.1 Kết quả điện di quan sát dưới đèn UV 14

Bài 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh Đen xơ mít

Là một trong các loại cây mang lại giá trị cao cho người nông dân, cây mít là một trong những cây quan trọng trong việc xóa đói giảm nghèo hiện nay ở Việt Nam nói riêng và một số nước Đông Nam Á nói chung Ở Việt Nam, sản xuất mít trọng điểm: Tây Nguyên, Đông nam Bộ, đồng bằng sông Cửu Long (Tiền Giang, Vĩnh Long, Long An, Đồng Tháp, Hậu Giang)

Với năng suất bình quân vào khoảng 20 tấn/ha.Theo Giám đốc Trung tâm Dịch

vụ nông nghiệp huyện Cai Lậy Nguyễn Thị Lạc, trong 9 tháng năm 2024, mít Thái trên địa bàn luôn có giá Thời điểm đầu tháng 10/2024, mít Thái loại 1 khoảng 38.000 đồng/kg, loại 2 có giá khoảng 21.000 đồng/kg Với giá này, sau khi trừ chi phí, nông dân thu lãi từ 150 triệu đồng đến 200 triệu đồng/ha, cao gấp nhiều lần so với trồng lúa năng suất cao nhưng thu nhập bấp bênh trước đây

Nhưng để trồng được mít nhất và mít nhì các nhà nông cần phải quản lý dịch bệnh

và có kỹ thuật canh tác tốt Đặc biệt vào mùa mưa sâu và dịch bệnh thường lan nhanh Bệnh nghiêm trọng nhất gây giảm chất lượng và giảm giá mít gặp phải hiện nay là bệnh

xơ đen

Nguyên nhân chính của bệnh Đen xơ mít là do vi khuẩn gây hại mạnh trên trái mít vào mùa mưa, thời gian xâm nhập ngay tư khi hình hành hoa cái đến lúc thụ phấn Vi khuẩn xâm nhập vào trái theo nước mưa bằng hai con đường: qua nướm hoa cái mở ra nhận phấn xâm nhập vào trái, đi vào vòi nhụy và đến bầu noãn Và con đường thứ hai là giữa trái đơn có khoảng hở, vi khuẩn và nấm theo nước mưa đi vào Nhưng tác nhân chính vẫn là vi khuẩn

Hình 1.1 Con đường xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh.

A: Khoảng lõm giữa các múi mít là nơi chứa nước mưa (mũi tên), B: Khoảng hở giữa các múi mít là nơi vi khuẩn xâm nhập (mũi tên).

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Pantoea stewartii

Vi khuẩn này là một loại vi khuẩn hiếu khí, Gram âm, sắc tố màu vàng, tạo chất nhầy, không hình thành bào tử, hình que kích thước 0,4-0,8 x 0,9-2,2 µm Một số chủng phát triển ở 4°C, một số ở 37°C Khuẩn lạc trên thạch nấm men-dextrose-canxi cacbonat

có màu vàng và lồi Khuẩn lạc trên thạch nutrient dextrose có màu vàng kem đến vàng

cam Pantoea stewartii tạo ra các polysaccharide ngoại bào có liên quan đến khả năng

gây bệnh, tức là độc lực

1.3 Phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn

Ly trích DNA là một quá trình quan trọng trong nghiên cứu di truyền và công nghệ sinh học Nó cho phép chúng ta thu được DNA từ các mẫu sinh học khác nhau, bao gồm việc lấy DNA từ tế bào, mô, máu, thức ăn, hoặc các mẫu khác Các phương pháp ly trích DNA khác nhau có thể được sử dụng tùy thuộc vào loại mẫu và mục đích của nghiên cứu Tuy nhiên, các bước tiền xử lý mẫu và tinh chế DNA cần được thực hiện cẩn thận và đầy đủ để đảm bảo chất lượng của DNA thu được Sau khi ly trích DNA, nồng độ

và độ tinh khiết của DNA cần được kiểm tra trước khi sử dụng cho các ứng dụng khác nhau, như PCR và các ứng dụng khác

Enzym ly giải tế bào tạo điều kiện cho sự phân hủy hoặc hòa tan tế bào thông qua

ly giải Các sản phẩm này bao gồm lysozyme, nuclease, DNase và protease cho các mục đích sử dụng, bao gồm chiết xuất protein, phân đoạn dưới tế bào, phân lập bào quan và các ứng dụng khác trong phòng thí nghiệm

Lysozyme được sử dụng để phân giải tế bào vi khuẩn Lysozyme làm bất hoạt vi khuẩn thông qua quá trình thủy phân các liên kết glucosidic trong peptidoglycan của

thành tế bào Cụ thể, lysozyme thủy phân liên kết β-1,4 giữa axit N-acetylmuramic và dư lượng 2-acetyl-amino-2-deoxy-D-glucose trong thành tế bào vi khuẩn, dẫn đến hiện tượng ly giải tế bào

1.4 PCR và Điện di tổng số Vi khuẩn Pantoea stewartii

Polymerase chain reaction (PCR)

Sự ra đời của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã làm thay đổi hoàn toàn khoa học sinh học kể từ khi nó được phát hiện lần đầu tiên PCR là một quá trình đơn giản và được sử dụng rộng rãi trong đó một lượng nhỏ DNA có thể được khuếch đại thành nhiều bản sao Có ưu điểm quy trình thực hiện đơn giản dễ hiểu, cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn

Thành phần phản ứng PCR

PCR có thể được thực hiện bằng cách sử dụng DNA nguồn từ nhiều loại mô và sinh vật, bao gồm máu ngoại vi, da, tóc, nước bọt và vi khuẩn

Mỗi xét nghiệm PCR đều cần có DNA khuôn mẫu, mồi, nucleotide và DNA polymerase DNA polymerase là enzyme chính liên kết các nucleotide riêng lẻ với nhau

để tạo thành sản phẩm PCR Các nucleotide bao gồm bốn bazơ – adenine, thymine, cytosine và guanine (A, T, C, G) – có trong DNA Các mồi trong phản ứng chỉ định sản phẩm DNA chính xác cần được khuếch đại Các mồi là các đoạn DNA ngắn có trình tự xác định bổ sung cho DNA mục tiêu cần được phát hiện và khuếch đại Chúng đóng vai trò là điểm mở rộng để DNA polymerase xây dựng

Chu trình nhiệt phù hợp với phản ứng PCR

Các thành phần được đề cập ở trên được trộn trong ống nghiệm hoặc đĩa 96 giếng

và sau đó được đặt trong một máy cho phép các chu kỳ khuếch đại DNA lặp lại diễn ra trong ba bước cơ bản Về cơ bản, máy là một máy chu trình nhiệt Nó có một khối nhiệt

có lỗ, trong đó các ống nghiệm hoặc đĩa chứa hỗn hợp phản ứng PCR được đưa vào Máy tăng và giảm nhiệt độ của khối theo các bước riêng biệt, chính xác và được lập trình sẵn Đầu tiên, dung dịch phản ứng được đun nóng trên điểm nóng chảy của hai sợi DNA bổ sung của DNA mục tiêu, cho phép các sợi tách ra, một quá trình được gọi là biến tính Sau đó, nhiệt độ được hạ xuống để cho phép các đoạn mồi cụ thể liên kết với các phân đoạn DNA mục tiêu, một quá trình được gọi là lai hóa hoặc gắn kết Việc gắn kết giữa các đoạn mồi và DNA mục tiêu chỉ xảy ra nếu chúng bổ sung theo trình tự (ví dụ: A liên kết với G) Nhiệt độ được tăng lên một lần nữa, tại thời điểm đó, DNA polymerase có thể

kéo dài các đoạn mồi bằng cách thêm các nucleotide vào sợi DNA đang phát triển Với mỗi lần lặp lại của ba bước này, số lượng phân tử DNA được sao chép sẽ tăng gấp đôi

Điện di sản phẩm PCR

Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích sản phẩm PCR là sử dụng điện di gel agarose, phương pháp này tách các sản phẩm DNA dựa trên kích thước và điện tích Điện di gel agarose là phương pháp dễ nhất để trực quan hóa và phân tích sản phẩm PCR Nó cho phép xác định sự hiện diện và kích thước của sản phẩm PCR

Quan sát kết quả sau khi điện di dưới đèn UV, gồm có các dải băng sáng có thể chứa các đối tượng mục tiêu cần Để xác định chính xác cần giải trình tự gen

1.5 Primer đặc hiệu cho Pantoea stewartii

Primer 16S rRNA

Việc so sánh trình tự gen 16S rRNA cho phép phân biệt giữa các sinh vật ở cấp độ chi trên tất cả các ngành vi khuẩn chính, ngoài việc phân loại các chủng ở nhiều cấp độ, bao gồm cấp độ loài và phân loài

Giải trình tự rRNA 16S là một dạng giải trình tự khuếch đại, một loại giải trình tự

bộ gen nhắm vào các vùng có tính đặc hiệu cao trong bộ gen Gen 16S rRNA là một gen nhỏ được bảo tồn, mã hóa cho tiểu đơn vị 16S của ribosome

Tham khảo trình tự primer đặc hiệu cho loài Pantoea stewarti (theo TCVN

12371-1: 2019)

Cặp mồi 1

PST-1: 5’ CCT CAC ACC ATC GGA TGT G -3’

PST-R: 5’ ATG AGG TTA TTA ACC TCA CCA- 3’

- Với chu trình nhiệt:

95 °C trong 5 phút

94 °C trong 30 giây

58 °C trong 30 giây Lặp lại 30 chu kì

72 °C trong 30 giây

72 °C trong 7 phút

- Đọc kết quả:

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose 1,5 %

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 263 bp

Cặp mồi 2

ES16-1: 5’GCG AAC TTG GCA GAG AT -3’

ESIG2c-R: 5’ GCG CTT GCG TGT TAT GAG- 3’

- Với chu trình nhiệt:

95 °C trong 4 phút

94 °C trong 30 giây

55 °C trong 30 giây Lặp lại 30 chu kì

72 °C trong 45 giây

72 °C trong 7 phút

- Đọc kết quả:

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose 1,5 %

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 920 bp

Bài 2 LY TRÍCH DNA VI KHUẨN BẰNG LYSIS BUFFER

2.1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị

Vật liệu: Dung dịch tăng sinh vi khuẩn gây bệnh

Hóa chất: STE 10% (0.1M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.5), 0.001m EDTA), Lysis buffer (EDTA : Tris-HCl : β mecap : SDS : NaCl), CI (Chloroform: Isoamyl alcohol, tỷ lệ 24:1), Chloroform (tỷ lệ 3:1), Isopropanol, Ethanol 70%, Hỗn hợp buffer (TE buffer, Elution buffer)

Dụng cụ: Micropipet + đầu tip, ống eppendorf 1.5 ml, Đá gel giữ lạnh hóa chất Thiết bị: Máy ly tâm, máy vortex

2.2 Phương pháp thực hiện

Bước 1 Thu cặn khuẩn Hút 1ml dịch tăng sinh khuẩn trong môi trường LB vào

tube 1.5ml Ly tâm 10000 vòng/ 3 phút → Loại bỏ dịch nổi Lặp lại 2 lần

Bước 2 Thêm 400 µl STE 10% (0,1M NaCl; 0,05M Tris-HCl (pH 7,5); 0,001m

EDTA) Vortex đều Ly tâm 10000 vòng/ 3 phút Lặp lại 2 lần

Bước 3 (Bỏ phần dịch nổi) Thêm 400 µl Lysis buffer (EDTA : Tris-HCl : β

mecap : SDS : NaCl) Voretx đều Ủ 65 trong 1 giờ Cách 20 phút vào đảo ống tube 1℃ lần

Bước 4 Thêm 300 µl CI (Chloroform: Isoamyl alcohol với tỷ lệ 24:1), sau đó đảo

đều Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút

Bước 5 Hút 300 µl dịch nổi qua tube mới Sau đó, add vào tube mới 100 µl

Chloroform (tỷ lệ 3:1) Ly tâm 13000 vòng/ 18 phút

Bước 6 Hút 200 µl dịch nổi vào tube mới Thêm vào tube 100 µl Isopropanol,

đảo nhẹ cho đồng nhất mẫu Ủ lạnh trong 30 phút Ly tâm 13000 vòng/ 13 phút

→ Bỏ dịch nổi thu cặn

Bước 7 Rửa tủa bằng 480 µl Ethanol 70% Lặp lại 2 lần Ly tâm 13000 v/ 10

phút Bỏ dịch nổi Để khô tự nhiên

Bước 8 Thêm 50 µl hỗn hợp (TE buffer, Elution buffer) Bảo quản -20℃

2.3 Kết quả

Sản phẩm sau khi ly trích là dung dịch trong suốt không màu Cần thực hiện kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng kỹ thuật đo quang phổ hấp thụ khi bắt đầu thực hiện các

bước nghiên cứu tiếp theo nhằm đảm bảo trong sản phẩm không chứa các hỗn hợp khác (protein, hóa chất không mong muốn)

Hình 2.1 Kết quả thực hiện ở bước 1, 2, 3 Ống tube tăng sinh khuẩn (ở bước 1), trước (a) và sau (b) khi bỏ dịch nổi; Ống tube chứa STE + cặn khuẩn (ở bước 2), trước (c) và sau (d) khi vortex, (e) cặn lắng ở đáy sau khi ly tâm; (f) ống tube chứa Lysis buffer (ở bước 3)

trước khi ly tâm.

b)

Bài 3 ĐIỆN DI TỔNG SỐ

3.1 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất

Vật liệu: DNA đã ly trích ở bài 2

Thiết bị, dụng cụ: bồn điện di, máy PCR, máy ly tâm, bao tay ,tupe, pipet, … Hoá chất: Dream Taq, Agarose, Lysis Buffer, PCI, CI, GelRed, Loading dye, …

3.2 Phương pháp thực hiện

3.2.1 Qui trình điện di DNA tổng số

Điện di với thuốc nhuộm GelRed theo tỷ lệ 3 µl DNA, 1 µl GelRed và 0,5 µl Loading dye Quá trình điện di thực hiện trên gel agarose 1% tại hiệu điện thế 100 V trong 25 phút

Bước 1 Cho 0,3 g agarose vào 30 ml dung dịch TBE 0,5X, đun trong máy

Microwave đến khi agarose tan hoàn toàn

Bước 2 Làm nguội dung dịch tới khoảng 60 oC rồi đổ vào khuôn đã lắp lược trước, đợi cho gel đông hoàn toàn

Bước 3 Rút lược ra, đặt gel vào bồn điện di.

Bước 4 Vortex mẫu, hút 3µl DNA trộn với hỗn hợp 1 µl GelRed và 0,5 µl

Loading dye

Bước 5 Điện di trong 25 phút.

Bước 6 Đọc kết quả dưới tia UV, chụp gel lưu lại kết quả.

3.2.2 Phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA

Bảng 3.1 Thành phần của phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA

Thành phần Thể tích hút (µl)

MyTaq Master Mix 5,0

Primer Forward 0,5

Primer Reverse 0,5

Nuclease-Free water 3,0

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA

Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kì

Tiền biến tính 95 3 phút 1

35

3.3 Kết quả

Quan sát trên hình 1, nhận thấy được rằng các nhóm đều xuất hiện band DNA Mặc dù có độ đậm nhạt khác nhau giữ các nhóm (có thể liên quan đến quá trình tách lọc DNA bước đầu) nhưng vẫn đảm bảo có DNA chất lượng đạt điều kiện để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 16S – rRNA

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số.

(1) – (9): Mẫu ly trích DNA tổng số của các nhóm lần lượt từ 1 – 9.

*Lưu ý: Do hỏng 1 giếng khi thao tác bơm mẫu nên bơm thêm 1 giếng, tổng là 10 giếng.

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 16S

– rRNA (1): Thang chuẩn DNA; (2): Đối chứng âm; (3) – (12):

Mẫu của các nhóm từ 1 – 9.

*Lưu ý: Do hỏng 1 giếng khi thao tác bơm mẫu nên bơm thêm 1 giếng, tổng là 10 giếng.

Các nhóm đều xuất hiện band chứng tỏ đã ly trích được DNA

Kết quả điện di 16S – rRNA, ở giếng 2 không xuất hiện band cho thấy thao tác tốt,

ổn định không tạp nhiễm qua các giếng khác Từ giếng thứ 3 trở đi band gần như đều nhau có thể thấy được sự đồng đều trong quá trình chạy điện di, cũng như rõ ràng về mức

độ của band mục tiêu

Bài 4 CHẠY PCR VỚI PRIMER CHUYÊN BIỆT 1

4.1 Vật liệu và phương pháp

4.1.1 Vật liệu

Dụng cụ: pipet, đầu tuýp, eppendorf, cồn, giấy lau

Hóa chất: H2O, primer-F, primer-R, buffer, taq, DNA vi khuẩn Pantoea stewartii.

Thiết bị: máy vortex, máy PCR, bồn điện di

4.1.2 Phương pháp

Bước 1 Vortex mẫu DNA.

Bước 2 Hút 1,5 µl DNA vào 8,5 µl master mix.

Bảng 4.1 Thành phần master mix

Thành phần Thể tích (µl)

Bước 3 Chạy PCR.

Bảng 4.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Tiền biến tính 95oC 3 phút 1

Biến tính 95oC 30 giây

35 Bắt cặp 61oC 30 giây

Kéo dài 72oC 30 giây

Bước 4 Hút 5 µl mẫu sau khi phản ứng PCR với 1 µl Gel Red theo tỉ lệ 5:1, mix

đều

Bước 5 Bơm vào giếng bồn điện di, điện di 100V trong vòng 25 phút.

4.2 Kết quả

Qua kết quả nhận thấy nhóm em đã không có sự xuất hiện band sáng DNA, có thể

có các trường hợp sau: trong quá trình hút DNA vô master mix em đã không mix đều