PHÂN HIỆU TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP TẠI TỈNH ĐỒNG NAI ĐƠN VỊ: KHOA NÔNG HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ NCKH CẤP CƠ SỞ Tên nhiệm vụ: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHIẾT XUẤT TỎI VỚI
TỔNG QUAN
Tỏi
Tỏi, hay còn gọi là Allium sativum, là một loại cây thân thảo sống hàng năm thuộc họ hành (Alliaceae), có chiều cao từ 30-40cm Thân cây ngắn, hình tháp, với nhiều ánh tỏi to nhỏ không đều xếp chồng lên nhau quanh một trục lõi, vỏ ngoài mỏng có màu trắng hoặc hơi vàng Lá tỏi cứng, hình dải, dài từ 15-50cm và rộng từ 1-2,5cm, có rãnh khía và mép lá hơi ráp Hoa tỏi mọc thành tán ở ngọn thân, với cánh hoa phát triển trực tiếp từ củ tỏi Mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ, sau này sẽ phát triển thành tép tỏi, và các tép này nằm chung trong một bao tạo thành củ tỏi, nằm dưới mặt đất.
Tỏi phát triển tốt trong khí hậu mát với nhiệt độ lý tưởng từ 18-20°C Cây tỏi cần được cung cấp đủ nước, nếu không sẽ dẫn đến tình trạng còi cọc và củ nhỏ Tỏi có vị cay, tính ấm, mang lại nhiều lợi ích như giải cảm, giải độc, tiêu đờm, lợi tiểu, hạ khí, trừ giun và thông quan (Đỗ Huy Bích và cs, 2006).
Tỏi, có nguồn gốc từ Trung Á, hiện nay đã trở nên phổ biến toàn cầu, từ vùng nhiệt đới xích đạo đến cả hai bán cầu Tại Việt Nam, tỏi được trồng rộng rãi từ Bắc vào Nam, với hai loại chính là tỏi củ to và tỏi củ nhỏ Thời gian trồng tỏi thường bắt đầu từ tháng 1-2 và thu hoạch vào tháng 5-6.
1.1.2 Thành phần hóa học của tỏi
Trong 100g tỏi có chứa 62,8% nước, 6,3% protein, 0,1% chất béo, 29% hydrat carbon, 0,03mg calcium, 0,31mg P, 1,3mg sắt, 13mg vitamin C (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)
Theo Đỗ Tất Lợi (2004), tỏi chứa ít iod và tinh dầu, với 100kg tỏi có từ 60-200g tinh dầu Thành phần chính của tỏi là allicin, một hợp chất sulfur có khả năng diệt khuẩn mạnh mẽ Allicin không có sẵn trong tỏi mà được hình thành từ chất allin, một loại acid amin, khi tỏi được cắt mỏng hoặc đập dập dưới tác động của men anilaza.
Do đó, càng cắt nhỏ hoặc càng đập nát, hoạt tính càng cao
Allicin tinh khiết là một loại dầu không màu, có khả năng hòa tan trong cồn, benzen và ether Tuy nhiên, tính tan trong nước của allicin không ổn định và dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm, trong khi đó, nó ít bị ảnh hưởng trong môi trường acid nhẹ (Bùi Thị Tho và cs, 2009).
Một ký tỏi có thể tạo ra từ 1 đến 2 gam allicin, nhưng allicin dễ bị biến chất theo thời gian và mất dần hoạt tính Việc đun nấu sẽ làm tăng tốc độ mất chất này, trong khi đun qua lò vi sóng có thể phá hủy hoàn toàn allicin Allicin được biết đến như một chất kháng sinh tự nhiên mạnh, thậm chí còn mạnh hơn penicillin, và nước tỏi pha loãng 125,000 lần vẫn có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Bùi Thị Tho và cs, 2009).
Dịch ép tỏi sống có hiệu quả cao trong việc chống lại các vi khuẩn như E coli, Pseudomonas, Salmonella, Candida, Klebsiella, Micrococcus, Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus (Issa et al, 2012) Việc bổ sung tỏi vào thức ăn không chỉ giúp tăng cường năng suất của gà đẻ mà còn cải thiện chất lượng trứng (Lim và ctv, 2006; Yalcin và ctv, 2006; Khan và ctv, 2007) Ngoài ra, allicin trong tỏi có khả năng làm giảm mức cholesterol trong huyết thanh, triglyceride và LDL (Adler và Holub).
Allicin có tác dụng làm giảm cholesterol toàn phần, ức chế tổng hợp acid béo, ngăn ngừa kết tập tiểu cầu và huyết khối, từ đó hỗ trợ điều trị và phòng ngừa bệnh tim mạch.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc cho gà ăn tỏi giúp giảm hàm lượng cholesterol trong máu (Koch and Lawson, 2000) Tỏi không chỉ làm giảm cholesterol mà còn ức chế đáng kể các enzyme liên quan đến tổng hợp cholesterol trong gan Điều này chứng minh rằng tỏi có vai trò quan trọng trong việc giảm tích tụ cholesterol và tăng cường đáp ứng miễn dịch thông qua các kênh protein và số lượng bạch cầu trong máu (Ari et al.).
Tỏi đã được chứng minh là hiệu quả trong việc điều trị nhiễm giun ở thú y Một nghiên cứu cho thấy chế phẩm bột tỏi và dầu tỏi, khi trộn vào thức ăn cho chó với tỷ lệ 0,1 – 0,2%, đã giúp loại bỏ hoàn toàn ấu trùng giun chỉ trong máu sau 3 – 4 tháng điều trị (Lâm Minh Thuận, 2012).
Diệp hạ châu đắng
Diệp hạ châu đắng có tên khoa học Phyllanthus amarus thuộc họ
Euphorbiaceae, chi Phyllanthus, tên địa phương là cây chó đẻ răng cưa hay chó đẻ thân xanh (Đỗ Huy Bích, 2006)
Cây thân thảo cao từ 50-70cm, có thân nhẵn và màu lục, ít phân cành Lá mọc so le, xếp thành hai dãy như lá kép hình lông chim, với gốc lá tròn và đầu lá tù hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm và mặt dưới mốc mốc Hoa đơn tính mọc ở kẽ lá, không có cánh hoa, màu lục nhạt; hoa đực có cuống ngắn và nằm dưới hoa cái, trong khi hoa cái có cuống dài Quả nang hình cầu, nhẵn, hơi dẹt, chia thành 3 mảnh vỏ, mỗi mảnh có 2 van chứa 2 hạt; hạt hình tam giác, đường kính khoảng 1mm, với cạnh dọc và vằn ngang.
Diệp hạ châu là cây ưa sáng và ẩm, nhưng không chịu được ngập úng Cây này phát triển tốt trên nhiều loại đất, đặc biệt là đất tơi xốp, giàu mùn và dinh dưỡng, có độ ẩm và thoát nước tốt Độ pH lý tưởng cho cây là từ 5-6,5, không thích hợp với đất quá chua hoặc kiềm Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của cây là từ 25-30°C, với vị đắng ngọt và tính mát.
Bộ phận lá diệp hạ châu chứa nhiều hoạt chất có tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là bảo vệ gan cho những người tiêu thụ nhiều bia rượu, giúp giảm nguy cơ nhiễm độc gan và tăng men gan (GACP-WHO, 2020) Tại Việt Nam, diệp hạ châu mọc hoang ở nhiều nơi như bụi cỏ, ven đường và ruộng vườn Cây được thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa hè và thu, sau đó được rửa sạch, cắt khúc ngắn và có thể sử dụng tươi hoặc phơi khô ở nơi râm mát, hoặc ép lá thành bánh (Dược điển Việt Nam).
Theo quyết định của Bộ Y Tế năm 2015, diệp hạ châu đắng là loại dược liệu ưu tiên phát triển và bảo tồn tại Việt Nam Loại cây này được quy hoạch trồng quy mô lớn ở nhiều khu vực, bao gồm Đồng bằng sông Hồng với các tỉnh như Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Hải Dương, Nam Định và Thái Bình Ngoài ra, vùng Bắc Trung Bộ với các tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa cũng được ưu tiên phát triển trồng diệp hạ châu đắng, cùng với vùng duyên hải Nam Trung Bộ gồm Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận.
Hình 1.2 Diệp hạ châu đắng
Hàm lượng các dược chất trong diệp hạ châu tự nhiên khá thấp, lá khô chứa các chất hypophyllathin (0,05 %), phyllanthin (0,35 %) (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006)
Nhóm lignan trong cây diệp hạ châu đắng chứa các hoạt chất với đặc tính dược lý quan trọng, nổi bật nhất là niranthin, có khả năng ức chế hiệu quả kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của virus viêm gan B (HBV) Các hợp chất physanthin và hypophylanthin cũng có mặt trong các cây thuộc chi Phylanthus, giúp tăng cường loại thải uric acid trong máu và bảo vệ gan khỏi các chất độc như carbon tetrachloride (CC14) và ethanol Ngoài ra, niranthin còn có tác dụng kháng viêm và giảm đau hiệu quả.
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của diệp hạ châu
Lignan Phyllanthin, hypophyllanthin, phyltetralin, nirtetralin, niranthin
Ellagitannin Phyllanthusiin D, amariinic acid, elaeocarpusin, repandusinic acid A, geraniinic acid B
Tannin Geraniin, amariin, gallocatechin, corilagin, 1,6- digalloyglucopyranoside
Alkaloid của quinolizidine Phyllanthine (=methoxy-securinine), securinine, norsecurinine, isobubbialine, epibubbialine
Gallic acid, ellagic acid, dotriacontanyl docosanoate, triacontanol, oleanolic acid, ursolic acid
Dẫn xuất chroman 4,4,8-Trimethoxy chroman
1.2.3 Tác dụng diệp hạ châu
Gan là nhà máy giải độc của cơ thể, bảo vệ bằng chất chống oxy hóa glutathionine và các enzyme trung hòa độc tố Khi chất độc tích tụ quá nhiều, tế bào gan bị tổn thương, gây viêm gan cấp tính Dấu hiệu nhận biết tình trạng này là nồng độ enzyme gan tăng cao trong huyết tương.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng diệp hạ châu có khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi các tác nhân độc hại như ethanol (Pramyothin và cộng sự, 2007), paracetamol (Udomuksorn và cộng sự, 2000) và galactosamine (Syamasundar và cộng sự, 1985; Kongstan, 2000).
Theo Ngô Đức Trọng (2008), nhiều nghiên cứu gần đây về các loài Phyllanthus đã phát hiện ra các hợp chất như lignan, flavonoid và tannin thủy phân, cho thấy khả năng bảo vệ gan, làm sạch kháng nguyên HBsAg và ức chế mạnh HIV transcriptase ngược.
Diệp hạ châu có tác dụng diệt khuẩn và diệt nấm nhờ vào thành phần acid phenolic và flavonoid Hoạt chất coderacin được chiết xuất từ cây này có khả năng tiêu diệt một số loại vi khuẩn.
Theo nghiên cứu của Ranilla và cộng sự (2011), chiết xuất diệp hạ châu có khả năng kháng khuẩn hiệu quả đối với Helicobacter pylori mà không gây hại cho các vi khuẩn có lợi trong cơ thể con người.
Cây diệp hạ châu đắng được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý như viêm thận, phù thủng, sỏi thận, suy dinh dưỡng ở trẻ em, viêm ruột, kiết lị, viêm gan, điều kinh, lọc máu, điều huyết, ung nhọt, đinh râu, lở ngứa, và cả các trường hợp bị rắn rết cắn (Đỗ Huy Bích và cs, 2006).
Bệnh Ornithobacterium rhinotracheale (ORT)
Bệnh hô hấp cấp tính trên gà do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale thuộc họ Flavobacteriaceae gây ra Vi khuẩn ORT có hình dạng trực khuẩn, Gram âm, ngắn với kích thước từ 0,2 - 0,9 µm và dài từ 1-3 µm, không có khả năng di động (Vandamme P và cs, 1994).
Khuẩn lạc của vi khuẩn ORT có kích thước nhỏ bằng đầu đinh ghim, màu xám đến xám trắng, lồi với rìa sắc gọn, không gây dung huyết và không di động Vi khuẩn này phát triển tốt nhất ở 37°C trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, với thời gian ủ từ 48 đến 72 giờ có bổ sung 7,5 – 10% CO2 ORT có thể được phân lập trên môi trường nuôi cấy thông thường, môi trường không chọn lọc hoặc trên thạch Chocolate agar, nhưng không phát triển trên thạch MacConkey, thạch Endo, thạch Drigalski hoặc Simmone citrate.
Chủng ORT thể hiện phản ứng catalase âm tính và oxidase dương tính Chúng có khả năng phân giải các loại đường như fructose, galactose, glucose, lactose và maltose, nhưng không phân giải được sucrose Ngoài ra, ORT có khả năng phân giải urê nhưng không có khả năng phân giải muối nitrate.
Các mẫu nuôi cấy ORT dễ bị nhiễm các vi khuẩn như E.coli và Proteus sp., gây khó khăn trong việc xác định vi khuẩn ORT Để cải thiện khả năng xác định, cần bổ sung 10 μg/ml gentamycin vào môi trường thạch máu, vì gentamycin được chứng minh là kháng sinh hiệu quả đối với các chủng ORT (Back et al, 1997) Vi khuẩn ORT phát triển tốt trong các môi trường lỏng như BHI (Brain heart infusion broth), PB (Pasteurella broth) và Todd Hewitt broth.
Vi khuẩn ORT nhạy cảm hoàn toàn với kháng sinh Amoxicillin-acid clavulanic (20/10Mg) (Trần thị Bích Liên và cs, 2014)
1.3.3 Sức đề kháng của vi khuẩn
Vi khuẩn ORT có thể bị bất hoạt hiệu quả bởi dung dịch acid Formic và glyoxyl 0.5%, cũng như các thuốc sát trùng chứa aldehyde (20% glutaraldehyde) với liều 0.5% sau 15 phút tiếp xúc (Hafez et al, 2003) Tuy nhiên, vi khuẩn này có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp vào mùa đông.
Hình 1.3 Khuẩn lạc ORT trên môi trường thạch máu sau 48 giờ nuôi cấy
(Nguyễn Thị Lan và cs, 2016)
Hình 1.4 Hình thái vi khuẩn ORT dưới kính hiển vi
Nguồn: http://chicucthuydnai.gov.vn/Tint%E1%BB%A9c/tabid/138/isd_news_news/517/Default
Vi khuẩn ORT gây bệnh trên các loài gia cầm gồm gà, gà tây, vịt (Hafez, 2002) Bệnh ORT gặp trên gà mọi lứa tuổi
Vi khuẩn ORT lây lan qua tiếp xúc trực tiếp với chất tiết đường hô hấp và gián tiếp qua các nguồn như vỏ trứng, nước uống, dụng cụ chăn nuôi và xe vận chuyển Ngoài ra, vi khuẩn này còn có thể truyền dọc qua trứng, gây bệnh cho động vật.
Vi khuẩn ORT được biết đến là tác nhân gây bệnh phổ biến ở nhiều loài gia cầm, bao gồm gà, gà tây, ngỗng, bồ câu, chuột lang, chim cút, đà điểu, mòng biển, vịt và gà lôi, quạ (Hafez, 2002).
1.3.5 Các yếu tố nguy cơ của bệnh
Vi khuẩn ORT gây ra các triệu chứng hô hấp nghiêm trọng, làm giảm khả năng ăn uống và chậm tăng trưởng ở động vật Để phát huy khả năng gây bệnh, ORT cần liên kết với các yếu tố tiên phát ảnh hưởng đến hệ thống hô hấp, bao gồm các virus như Turkey rhinotracheitis virus (TRTV) và virus gây bệnh Newcastle Các yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh lý hô hấp.
Virus Newcastle (NDV) và virus viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) cùng với các bệnh do vi khuẩn như E coli, Bordetella avium và Chlamydophila psittaci là những nguyên nhân chính gây bệnh ở gia cầm Yếu tố môi trường, bao gồm quản lý đàn kém, thông thoáng không đủ, mật độ đàn cao, nồng độ amoniac cao, cũng như độ ẩm và nhiệt độ không phù hợp, có vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng gây bệnh của vi khuẩn ORT Stress, độ thông thoáng, mật độ đàn và nồng độ amoniac có thể làm gia tăng nguy cơ nhiễm trùng thứ cấp Đặc biệt, bệnh do vi khuẩn ORT thường xảy ra sau khi gà đã hoặc đang mắc các bệnh khác.
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch đã chứng minh rằng khi gà nhiễm virus Newcastle, vi khuẩn ORT sẽ phát triển theo, xâm nhập vào túi khí và phổi, làm bệnh trở nên nghiêm trọng hơn Ngược lại, nếu gà không bị nhiễm virus, tình trạng sức khỏe của chúng sẽ được cải thiện.
Nghiên cứu của van Empel và Hafez (1999) cho thấy việc tiếp xúc với khí dung ORT tại Newcastle chỉ gây ra tổn thương túi khí nhẹ, và sau 2 ngày không còn dấu hiệu nhiễm khuẩn.
Việc vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mô là bước quan trọng trong quá trình gây nhiễm trùng và kích hoạt hệ miễn dịch của cơ thể Vi khuẩn ORT sử dụng các protein màng ngoài (OMP) để kết dính vào tế bào khí quản trong bệnh lý gia cầm, tương tự như vai trò của OMP ở nhiều vi khuẩn khác như Heamophilus ducreyi, Actinobacillus pleuropneumoniae và Hemophilus influenzae Các OMP của vi khuẩn ORT cũng tham gia vào việc nhận diện thụ thể Vi khuẩn ORT serotype A có ba loại OMP chính với trọng lượng phân tử lần lượt là 45, 53 và 70 kDa Nofouzi và cộng sự đã chỉ ra rằng OMP 53 kDa có khả năng kích thích kháng thể và ức chế sự bám dính của vi khuẩn ORT cao nhất, chiếm đến 78% so với các OMP khác và toàn bộ tế bào vi khuẩn Do đó, OMP 53 kDa có tiềm năng trở thành kháng nguyên để phát triển vắc-xin tái tổ hợp chống lại vi khuẩn ORT.
Neuraminidase (sialidase) là yếu tố độc lực quan trọng của một số mầm bệnh ở gia cầm Nghiên cứu của Kastelic và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng hoạt động enzym neuraminidase (NEAC) trên vi khuẩn ORT có khả năng phân tách acid sialic từ glycoprotein ở gà và gà tây rất mạnh mẽ NEAC tách axit sialic từ SAa (2-6) gal của protein huyết thanh vật chủ, bao gồm immunoglobulin G (IgG) và transferrin Ngoài ra, vi khuẩn ORT cũng khử muối glycoproteins trong chất nhầy của gà và gà tây với các gốc SAa (2-3) Những phát hiện này có thể giúp hiểu rõ hơn về sự tương tác giữa vi khuẩn ORT và vật chủ tự nhiên, từ đó phát triển các biện pháp phòng bệnh hiệu quả hơn.
Vi khuẩn ORT có khả năng lây lan theo hai hướng: theo chiều ngang qua các hạt khí dung và theo chiều dọc qua trứng Việc trứng được vận chuyển toàn cầu góp phần làm tăng tốc độ lây lan của vi khuẩn ORT trong ngành chăn nuôi gia cầm.
Có sự liên quan giữa các vùng địa lý và sự phân bố các serotype của vi khuẩn ORT Trong 18 kiểu huyết thanh của ORT phân lập từ gà và gà tây, serotype A chiếm ưu thế với 97% và được phân lập thường xuyên nhất (61%) Các chủng serotype A và C từ gà, cũng như serotype B, D và E từ gà tây, có độc lực tương tự, cho thấy không có chỉ định vật chủ đặc hiệu cho bất kỳ serotype nào Trên gà tây, serotype A thường được tìm thấy ở gà con, trong khi các serotype khác chủ yếu xuất hiện ở gà tây lớn hơn 8 tuần tuổi.
1.3.8 Triệu chứng và bệnh tính
Dấu hiệu lâm sàng xảy ra từ 2 đến 4 ngày sau nhiễm trùng (Van Empel và cs,
Bệnh do vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn Escherichia coli được mô tả lần đầu tiên vào năm 1885, bởi Bác sĩ nhi khoa người Đức, Theodor Escherich (Nguyễn Quang Tuyên, 2008)
Vi khuẩn E coli được xác định là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở cả người và động vật, với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune (Levine, 1987) Loại vi khuẩn này thường xuất hiện sớm trong đường ruột của trẻ sơ sinh và động vật, chỉ sau 2 giờ sau khi sinh E coli chủ yếu cư trú ở ruột già, hiếm khi có mặt ở dạ dày hay ruột non, và trong một số trường hợp, còn được phát hiện ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ thể (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997).
1.4.1 Đặc điểm vi khuẩn E coli
Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là trực khuẩn hình que ngắn, Gram âm, không sinh bào tử
E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15 – 24oC, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp là 7,4 Vi khuẩn
E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường
Môi trường nước thịt có đặc điểm là khuẩn lạc phát triển mạnh, tạo ra sự đục ngầu và cặn lắng ở đáy ống màu tro nhạt Đôi khi, môi trường này còn hình thành màng xám nhạt và tỏa ra mùi hôi khó chịu giống như mùi phân.
Theo Phạm Hồng Sơn (2008), trên môi trường thạch thường, ở nhiệt độ
Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 độ C, khuẩn lạc hình thành có hình tròn, dạng S, ướt, không trong suốt, màu tro trắng và hơi lồi, với đường kính từ 2-3mm Khi để lâu, khuẩn lạc sẽ phát triển rộng ra và xuất hiện thêm các khuẩn lạc khác.
Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc phát triển tốt, một số chủng gây bệnh gây dung huyết
Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen
Trong môi trường Endo, E coli tạo ra khuẩn lạc màu đỏ Trong khi đó, trên môi trường EMB, E coli hình thành khuẩn lạc màu tím đen Ngoài ra, trong môi trường Istrati, E coli phát triển khuẩn lạc có màu vàng.
Môi trường Simmon citrat: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục
Môi trường gelatin: E coli không làm tan chảy gelatin
Không mọc trên môi trường Muller Koffman, lục Malasi
E coli thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn và được đặc trưng bởi các tính chất như có enzym β-galactosidase và β-glucoronidase Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 44 – 45oC trên môi trường tổng hợp Lên men đường lactose, mannitol, sinh hơi, sinh axit và sinh Indol từ Tryptophan Tuy nhiên, một số chủng có thể phát triển ở 37 o C chứ không phát triển ở 44 – 45 o C và một số thì không sinh hơi Vi khuẩn E coli không sinh oxidase hoặc thủy phân ure Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn E coli có khả năng lên men và sinh hơi từ các đường như lactoza, glucoza, galactoza, mantoza, arabinoza, xyloza, ramnoza, mannitol và fructoza trong môi trường đường Trong khi đó, đối với các môi trường như saccaroza, rafinoza, salixin, esculin, dunxit và glyxerol, khả năng lên men của vi khuẩn có thể khác nhau Cụ thể, chủng Bacterium coli commune không lên men saccaroza, trong khi ba chủng khác là B coli communior, B lactis và B cloacae lại có khả năng lên men saccaroza.
Dextrin, amidin, glycogen, inosit, and xenobiotics do not undergo fermentation The organism exhibits positive reactions for indole production and Methyl Red (MR), while showing negative results for Voges-Proskauer (VP) and Simmons Citrate tests Additionally, it tests negative for hydrogen sulfide (H2S) and reduces nitrate to nitrite, with a positive result for lysine decarboxylase.
Hầu hết các loại gia cầm đều nhạy cảm với vi khuẩn E coli, và mọi độ tuổi đều có nguy cơ mắc bệnh Bệnh này chủ yếu lây lan qua đường tiêu hóa (Lertwilai và cs, 2018).
1.4.5 Triệu chứng và bệnh tích
Thời gian ủ bệnh từ 1-3 ngày và gây nhiễm trùng huyết từ 5-7 ngày sau khi nhiễm bệnh E coli gây xuất huyết ruột, gây ra hiện tượng tiêu chảy
Trứng gà nhiễm E coli có thể dẫn đến tỷ lệ chết cao ngay khi nở, cùng với việc gia tăng tình trạng viêm rốn và túi lòng đỏ ở những con gà sống sót, khiến chúng trở nên còi cọc Gà mái đẻ bị nhiễm E coli thường gặp phải các vấn đề như viêm ống dẫn trứng, viêm lỗ huyệt và viêm phúc mạc (Lertwilai và cs, 2018).
Bệnh tích điển hình trong nhiễm trùng huyết bao gồm gan có màu xanh lục, lách sưng to và tắc nghẽn, cùng với viêm màng ngoài tim thường xuất hiện.
Dựa vào các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích các phương pháp cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh
1.4.7 Phòng và điều trị bệnh
Phòng bệnh bằng biện pháp áp dụng an toàn sinh học trong trại nuôi và tiêm vaccin phòng bệnh
Vi khuẩn E coli có thể được điều trị bằng kháng sinh thông dụng, nhưng do tính đề kháng nhanh, chúng cũng kháng nhiều loại thuốc Theo nghiên cứu của Nguyễn Trọng Phước (1997), E coli mẫn cảm với gentamycin, nitrofuration và norfloxacin, nhưng đề kháng mạnh với sulfamide, erythromycine, trimethoprim, penicillin, lincomycin và vancomycin Nghiên cứu của Võ Thị Trà An và cộng sự (2010) trên 100 gốc vi khuẩn từ heo cho thấy độ mẫn cảm kháng sinh giảm dần như sau: ceftazidime (93%), amoxicillin/clavulanic acid (73%), norfloxacin (66%), gentamycin (40%), chlophenicol (34%), kanamycin (33%), trimethoprim/sulfamethoxazol (29%), cephalexin (25%), ampicilin (21%), tetracycline (20%) và colistin (7%).
Tồn dư kháng sinh và đề kháng kháng sinh trong chăn nuôi
Tình trạng đề kháng kháng sinh có thể lây truyền giữa động vật và con người qua tiếp xúc trực tiếp, cũng như thông qua việc tiêu thụ thực phẩm như trứng, sữa, thịt và rau củ chứa vi khuẩn hoặc gen kháng Bên cạnh đó, môi trường cũng góp phần làm gia tăng nguy cơ đề kháng khi các gen kháng từ vi khuẩn trên người hoặc động vật được chuyển giao, hoặc khi kháng sinh dư thừa được thải vào đất (Dewwulf, 2018).
Tồn dư kháng sinh là hiện tượng kháng sinh còn sót lại trong thực phẩm, có khả năng ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng khi sử dụng các sản phẩm này (FAO, 2021).
Việc bổ sung kháng sinh vào thức ăn và nước uống cho gia súc nhằm điều trị và ngăn ngừa bệnh tật có thể thúc đẩy sự tăng trưởng ở động vật Tuy nhiên, điều này cũng dẫn đến nguy cơ tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, gây ra tình trạng đề kháng kháng sinh ở cả người và động vật.
Theo quy định của Bộ Y Tế năm 2013, mức giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm được quy định cho một số kháng sinh Cụ thể, amoxicillin có giới hạn tối đa 50 μg/kg trong thịt heo; chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline có giới hạn lần lượt là 400 μg/kg, 200 μg/kg trong trứng và thịt gia cầm Đối với colistin, giới hạn là 300 μg/kg trong trứng, 150 μg/kg trong thịt gà, 150 μg/kg trong gan gà, và 150 μg/kg trong thịt heo Gentamicin có giới hạn 100 μg/kg trong thịt trâu, bò và thịt heo, trong khi gan heo có giới hạn cao hơn với 2000 μg/kg.
Theo nghiên cứu của Yoshimura và cộng sự (1991), khi bổ sung doxycycline vào nước uống của gà đẻ trong 7 ngày, kháng sinh này có thể tồn tại trong lòng đỏ trứng đến 27 ngày và lòng trắng đến 25 ngày Nghiên cứu của Delaport và cộng sự (1994) cho thấy, khi bổ sung enrofloxacin vào nước uống, kháng sinh này cũng tồn tại trong lòng đỏ và lòng trắng trứng hơn 7 ngày Ngoài ra, Kan và cộng sự (1998) chỉ ra rằng flubendazol, khi bổ sung vào thức ăn, có thể tồn tại khoảng 21 ngày.
Tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật đang làm gia tăng sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Vấn đề này không chỉ gây khó khăn trong việc điều trị bệnh cho con người mà còn tác động tiêu cực đến môi trường.
Theo nghiên cứu của Theo Yamguchi và cộng sự (2015) tại Việt Nam, 11,9% mẫu phân tích cho thấy sự tồn dư kháng sinh Cụ thể, tỷ lệ phát hiện kháng sinh trong thịt gà là 17,3%, thịt heo là 8,8%, và thịt bò là 7,4%.
Sự gia tăng sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi đang dẫn đến sự phát triển đáng lo ngại của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh (Budino và ctv, 2005) Hawkey (2008) cho biết rằng tình trạng này đang gia tăng nhanh chóng ở Châu Á, đặc biệt là tại Việt Nam.
(2012), sự phổ biến của vi khuẩn kháng thuốc tại Việt Nam có thể phát sinh từ việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi.
Một số biện pháp giảm thiểu kháng sinh
An toàn sinh học là biện pháp thiết yếu giúp giảm thiểu sử dụng kháng sinh, ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh từ bên ngoài và giảm áp lực nhiễm bệnh trong đàn Việc áp dụng an toàn sinh học một cách chính xác và có hệ thống có thể hạn chế sự lây lan của các bệnh như Streptococci, PRRS và cầu trùng mà không thể tiêu diệt hoàn toàn (Dewulf, 2018).
Kháng sinh thảo dược là giải pháp an toàn giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Việc áp dụng thảo dược để phòng và chữa bệnh cho gia súc, gia cầm không chỉ hiệu quả mà còn hạn chế tồn dư kháng sinh và hóa chất trong thực phẩm Sử dụng kháng sinh thảo dược góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao chất lượng sản phẩm chăn nuôi.
Tuyên truyền và nâng cao nhận thức về trách nhiệm xã hội của người chăn nuôi, sản xuất, kinh doanh thuốc, cán bộ giám sát và người tiêu dùng là biện pháp thiết thực nhằm giảm thiểu kháng sinh trong chăn nuôi Việc này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về tầm quan trọng của kháng sinh mà còn đưa ra các giải pháp hiệu quả để quản lý và sử dụng kháng sinh một cách hợp lý trong ngành chăn nuôi.
Để giảm thiểu kháng sinh trong chăn nuôi, cần thực hiện các biện pháp như tiêm phòng cho đàn vật nuôi, sử dụng kháng sinh đúng cách và đủ liệu trình Quản lý chăn nuôi bao gồm việc chọn giống, cải thiện chuồng trại và bổ sung dinh dưỡng bằng các sản phẩm tăng cường khả năng tiêu hóa và kích thích hệ miễn dịch cho đàn.
1.7 Một số phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
1.7.1 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng (Broth microdilution method)
Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh trong ống nghiệm dựa trên tác dụng ức chế của chất kháng khuẩn ở nồng độ tối thiểu, ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy Nồng độ kháng khuẩn được pha loãng và đặt trong ống hoặc giếng của khay microtiter chứa môi trường lỏng Môi trường lỏng lý tưởng cho sự phát triển của vi khuẩn là Mueller Hinton với các ion Magie và Canxi hoặc Nutrient broth (NB).
Kết quả nghiên cứu được xác định dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường canh dinh dưỡng với các nồng độ khác nhau của chất kháng khuẩn Độ đục của môi trường, phản ánh sự phát triển của vi khuẩn, sẽ thay đổi tùy thuộc vào nồng độ chất kháng khuẩn trong ống Giá trị MIC được xác định bằng cách ghi nhận nồng độ pha loãng thấp nhất của chất kháng khuẩn mà vi khuẩn không phát triển, tương tự như môi trường trong ống đối chứng dương chỉ chứa môi trường và chất kháng khuẩn (Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2009).
Giá trị MBC (Minimum Bactericidal Concentration) được xác định là nồng độ tối thiểu có khả năng tiêu diệt 99,9% vi khuẩn nhờ vào hoạt tính kháng khuẩn (Chen, 2011) Để hỗ trợ sự phát triển của một số vi khuẩn khó tính, thạch Mueller Hinton thường được bổ sung 5% máu bò, cừu hoặc ngựa (Peterson và cs, 1992) Sau 24 giờ, sử dụng que cấy vòng vô trùng để cấy từ các ống nghiệm không làm đục môi trường lên thạch dinh dưỡng Giá trị MBC được xác định tại ống nghiệm có nồng độ thấp nhất mà vi khuẩn không hiện diện trên thạch (Chen).
1.7.2 Phương pháp khuếch tán trên thạch (Agar diffusion method)
Phương pháp khuếch tán qua thạch sử dụng đĩa giấy, lần đầu tiên được B A Thompson mô tả vào năm 1950, đã chứng minh hiệu quả trong nghiên cứu công nghệ sinh học và y dược Hiện nay, các nhà khoa học đã cải tiến phương pháp này để trở nên nhanh chóng và đơn giản hơn, như việc sử dụng lỗ thạch thay vì đĩa giấy và cấy trải vi khuẩn thay cho việc trộn lẫn vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy.
Môi trường được sử dụng trong phương pháp này bao gồm các loại môi trường cho phép hầu hết vi khuẩn phát triển, đồng thời cho phép chất kháng khuẩn dễ dàng khuếch tán Một số loại môi trường tiêu biểu là thạch Mueller – Hinton (MHA) (John và cs, 2011), Tryticase – Soy – Agar (TSA) (Nguyễn Ngọc Hải cs, 2009), và Nutrient Agar (NA) (Flora và cs, 2008).
Kết quả của phương pháp dựa trên việc đo lường kích thước các vòng kháng khuẩn theo milimet (mm) được đọc sau 18 giờ (Bauer, Kirby, Sherris,
& Turck, 1966) và sử dụng tiêu chuẩn vòng kháng khuẩn của CLSI để đối chiếu (Wayne, 2007)
1.7.3 Phương pháp pha loãng trong thạch
Phương pháp pha loãng trong môi trường thạch ít khi được áp dụng trong chẩn đoán thú y tại Hoa Kỳ, với mục tiêu xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Phương pháp này sử dụng các đĩa thạch Mueller Hinton, trong đó các nồng độ kháng khuẩn khác nhau được hòa trộn, mỗi đĩa tương ứng với một nồng độ thử nghiệm Thông thường, nồng độ pha loãng là pha loãng cấp 2 Để hỗ trợ sự phát triển của một số vi khuẩn khó tính, thạch Mueller Hinton thường được bổ sung 5% máu bò, cừu hoặc ngựa (Peterson và cs, 1992).
Giá trị MBC (Minimum Bactericidal Concentration) được xác định là nồng độ tối thiểu của chất kháng khuẩn có khả năng diệt 99,9% vi khuẩn (Chen, 2011) Để xác định giá trị này, sau 24 giờ, vi khuẩn được cấy từ huyền dịch vào môi trường thạch dinh dưỡng và ủ ở 37°C trong 24 giờ để phát triển Giá trị MBC được xác định là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn mà tại đó vi khuẩn không còn hiện diện trên môi trường thạch (CLSI, 2015).
1.8 Một số nghiên cứu về tỏi và diệp hạ châu, tỏi
Theo nghiên cứu của Lê Thị Huyền Trang (2012), các dịch chiết tỏi cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ vi khuẩn E coli, với vòng vô khuẩn trung bình lớn nhất đạt 26,2 mm từ dịch chiết tỏi tím Phan Rang, trong khi tỏi Lý Sơn có vòng vô khuẩn nhỏ nhất là 20,5 mm Ngược lại, các mẫu dịch chiết gừng và nghệ không có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn E coli.
Sử dụng các chế phẩm thảo dược tự nhiên như gừng, tỏi và nghệ trong thức ăn cho gà không chỉ tăng sức đề kháng mà còn cải thiện tỷ lệ đẻ trứng và trọng lượng gà, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế Nghiên cứu cho thấy gà đẻ sử dụng hỗn hợp này có tỷ lệ đẻ trứng cao hơn 4,5-6,3% so với gà không sử dụng Đối với gà nuôi thịt 12 tuần tuổi, việc bổ sung chế phẩm và rau muống giúp cải thiện sức sinh trưởng từ 2-4% và trọng lượng tăng từ 26-79 gram/ngày Hơn nữa, trộn tỏi, nghệ và gừng vào thức ăn còn giúp gà tăng tốc độ phát triển và khả năng chuyển hóa thức ăn, cải thiện khả năng hấp thu dinh dưỡng.
Nghiên cứu của các nhà khoa học tại đại học Novi Sad (Serbia) cho thấy tỏi có tác dụng tích cực trong việc thúc đẩy tăng trọng cho gà khi được bổ sung vào thức ăn trong vòng 6 tuần (Issa và cs, 2012).
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với vi khuẩn E coli gây bệnh, bao gồm cả các chủng E coli kháng ampicillin và kanamycin Kết quả cho thấy vi khuẩn E coli bị ức chế hiệu quả bởi dịch chiết tỏi chiết xuất từ 7 dung môi khác nhau.
Một số nghiên cứu về tỏi và diệp hạ châu, tỏi
NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2022 đến tháng 11/2023
Xác định khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ tỏi với vi khuẩn ORT ở các nồng độ khác nhau
Xác định khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ diệp hạ châu với vi khuẩn E coli ATCC 25922 ở các nồng độ khác nhau
Chiết xuất tỏi trên vi khuẩn ORT và chiết xuất diệp hạ châu đối với E coli
Dược liệu: Tỏi, diệp hạ châu
Dụng cụ, thiêt bị, vật tư : máy hấp, máy sấy, đĩa petri, que cấy, cồn, rượu, môi trường MHA, máy đo OD, vi khuẩn ORT, E coli ATCC 25922
2.5 Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chiết xuất tỏi với vi khuẩn ORT Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chiết xuất diệp hạ châu với vi khuẩn E coli ATCC 25922
2.6.1 Đánh giá tính kháng khuẩn của dịch chiết tỏi với vi khuẩn ORT
Dịch ép tỏi nguyên chất: Cân 100g tỏi đã lột vỏ, rửa sạch để ráo nước, giã nhỏ rồi ép lấy dịch, lọc qua giấy lọc, dùng ngay trong ngày
Dịch chiết tỏi với rượu được thực hiện bằng cách ngâm 100g tỏi trong 200ml rượu 30 độ theo tỉ lệ 1:2 trong 3 ngày Sau đó, hỗn hợp này được pha chế thành 4 nồng độ khác nhau là 12,5%, 25%, 50% và 100%.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ tỏi với vi khuẩn ORT ở các nồng độ khác nhau
Xác định khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ diệp hạ châu với vi khuẩn E coli ATCC 25922 ở các nồng độ khác nhau
Đối tượng nghiên cứu
Chiết xuất tỏi trên vi khuẩn ORT và chiết xuất diệp hạ châu đối với E coli
Dược liệu: Tỏi, diệp hạ châu
Dụng cụ, thiêt bị, vật tư : máy hấp, máy sấy, đĩa petri, que cấy, cồn, rượu, môi trường MHA, máy đo OD, vi khuẩn ORT, E coli ATCC 25922
2.5 Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chiết xuất tỏi với vi khuẩn ORT Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chiết xuất diệp hạ châu với vi khuẩn E coli ATCC 25922
2.6.1 Đánh giá tính kháng khuẩn của dịch chiết tỏi với vi khuẩn ORT
Dịch ép tỏi nguyên chất: Cân 100g tỏi đã lột vỏ, rửa sạch để ráo nước, giã nhỏ rồi ép lấy dịch, lọc qua giấy lọc, dùng ngay trong ngày
Dịch chiết tỏi với rượu được thực hiện bằng cách ngâm 100g tỏi trong 200ml rượu 30 độ theo tỉ lệ 1:2 trong 3 ngày Sau thời gian ngâm, dịch chiết được pha ra với các nồng độ 12,5%, 25%, 50% và 100% Tổng cộng có 4 nồng độ dịch chiết tỏi với rượu để khảo sát.
Trước khi tiến hành chiết xuất, các dược liệu cần được rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước chảy, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng và để ráo trong môi trường thoáng khô Đồng thời, tất cả dụng cụ tách chiết thô sơ phải được tiệt trùng để giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn và nấm mốc.
Chuẩn bị đĩa giấy tẩm thảo dược
Để thực hiện thí nghiệm, sử dụng đĩa giấy không tẩm kháng sinh và bổ sung dịch chiết tỏi với rượu ở các nồng độ 12,5%, 25%, 50%, 100% cùng với dịch chiết nguyên chất Đĩa giấy cần được tiệt trùng bằng phương pháp hấp autoclave trong 15 phút ở nhiệt độ 121°C Sau đó, đặt các đĩa giấy này lên đĩa petri đã tiệt trùng và nhỏ lần lượt 30 µl dịch chiết thảo dược vào từng đĩa Cuối cùng, các đĩa này được đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 10 phút cho đến khi khô (Lê Thị Huyền Trang, 2012).
Để chuẩn độ vi khuẩn, sử dụng que cấy vô trùng lấy từ 3 – 4 khuẩn lạc và cho vào ống nước muối sinh lý vô trùng Tiến hành vortex để đạt nồng độ vi khuẩn khoảng 10^8 CFU/ml, đo OD tại 625 nm trong khoảng 0,08 – 0,13, tương đương với độ đục McFarland 0,5 (Irith và cs, 2008).
Để làm khô mặt thạch, thạch đĩa cần được làm ấm ở nhiệt độ 37 oC Sử dụng tăm bông vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn đã chuẩn bị, sau đó ép nhẹ tăm bông vào thành ống nghiệm để tránh tình trạng tăm bông quá ướt Tiến hành quét tăm bông đều lên môi trường theo ba hướng chéo nhau 60 độ nhằm phân bố mật độ vi khuẩn một cách đồng đều.
Sử dụng kẹp vô trùng để gắp các đĩa giấy tẩm thảo dược lên bề mặt môi trường MHA đã cấy vi khuẩn Để các đĩa môi trường có chứa giấy tẩm kháng sinh và dịch chiết thảo dược ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút, nhằm tạo điều kiện cho kháng sinh và thảo dược khuếch tán hiệu quả Sau đó, đặt các đĩa cấy vào tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Kết quả được đọc bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn, so sánh với vòng vô khuẩn sử dụng kháng sinh Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.
Chỉ tiêu theo dõi Đường kính vòng vô khuẩn của chiết xuất tỏi trên các vi khuẩn
2.6.2 Đánh giá tính kháng khuẩn của cao diệp hạ châu với vi khuẩn E coli ATCC 25922
Để chuẩn độ vi khuẩn, sử dụng que cấy vô trùng lấy 3 – 4 khuẩn lạc cho vào ống nước muối sinh lý vô trùng Sau đó, vortex để đạt nồng độ vi khuẩn khoảng 10^8 CFU/ml, đo OD tại 625 nm (0,08 – 0,13) với độ đục tương đương Mc Farland 0,5 (Irith và cs, 2008) Tiếp theo, pha loãng nồng độ vi khuẩn xuống còn khoảng 10^4 CFU/ml bằng nước muối sinh lý vô trùng (CLSI, 2015).
Kháng sinh được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm amoxicillin và doxycycline Doxycycline được pha loãng bằng nước cất vô trùng, trong khi amoxicillin được pha loãng bằng dung môi phosphate buffered với pH=6 và được vortex để tan hoàn toàn Sau khi tan, dung dịch được lọc qua màng lọc vô trùng 0,22 µm và được bảo quản trong các ống chứa ở tủ lạnh với nhiệt độ -18°C Nồng độ của các kháng sinh chuẩn là 1280 µg/ml.
Từ các ống kháng sinh chuẩn ban đầu, tiến hành pha loãng nồng độ kháng sinh theo cấp số 2 để tạo ra một dãy 10 nồng độ giảm dần Nồng độ cao nhất là 128 àg/ml, tiếp theo là 64 àg/ml, 32 àg/ml, 16 àg/ml, 8 àg/ml, 4 àg/ml, 2 àg/ml, 1 àg/ml, 0,5 àg/ml và cuối cùng là 0,25 àg/ml.
Chuẩn bị pha loãng cao diệp hạ châu
Sử dụng cân phân tích để cân chính xác 15g cao diệp hạ châu, hòa tan vào 0,2 ml nước cất vô trùng và định mức lên 15 ml Tiến hành sử dụng vortex và đun cách thủy để đảm bảo cao tan đều Dung dịch cao thô sau đó được pha loãng theo cấp số 2 (Irith và cs, 2008) bằng nước cất vô trùng, tạo thành dãy dung dịch với nồng độ giảm dần: 1000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml, 15,625 mg/ml, 7,813 mg/ml, 3,906 mg/ml, và 1,953 mg/ml.
Môi trường MHA được pha loãng bằng nước cất và tiệt trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 15 phút Mỗi đĩa petri chứa 13,4 ml dung dịch, trong đó có 12 ml MHA và 1,4 ml dung dịch cao Mỗi đĩa tương ứng với một nồng độ cao đã được pha loãng chuẩn bị trước (CLSI, 2015).
Các dãy kháng sinh amoxicillin và doxycycline đã được pha loãng và tiến hành đổ tương tự như các đĩa bổ sung cao diệp hạ châu Ngoài ra, cần chuẩn bị hai đĩa đối chứng E1 và E2, trong đó E1 phải có vi khuẩn mọc để xác nhận sự phát triển của vi khuẩn, còn E2 để đảm bảo môi trường sử dụng là vô trùng.
Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của chiết xuất diệp hạ châu
Sau khi chuẩn bị các đĩa môi trường chứa chất kháng khuẩn (kháng sinh hoặc chiết xuất diệp hạ châu), sử dụng tăm bông để dàn đều vi khuẩn ở nồng độ quy định lên bề mặt thạch, đồng thời thực hiện thí nghiệm với đối chứng âm Đĩa được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Sau thời gian ủ, kết quả được đọc và giá trị MBC được xác định là nồng độ thấp nhất trên đĩa thạch mà vi khuẩn không còn hiện diện (Chen, 2011) Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ tin cậy.
2.7 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel và Minitab 19, phân hạng ANOVA bằng trắc nghiệm Turkey test.
Phương pháp xử lý số liệu
Mẫu dịch chiết tỏi thu được từ thí nghiệm được sử dụng để đánh giá khả năng diệt khuẩn các gốc ORT bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Bảng 3.1 Kích thước vòng vô khuẩn khi thử nghiệm với các dịch chiết ở các nồng độ khác nhau (mm)
Nồng độ của chiết xuất tỏi Giấy kháng sinh Đối chứng
Tỏi/rượu (12,5%) Doxy Amox/ clav R
3 29,33 ab ±2,08 22,66 bc ±0,58 19,33 cd ±2,31 14,33 de ±3,06 7,67 ef ±6,66 35,67 a ±2,08 22,66 bc ±1.16 -
4 20,67 bc ±3,01 17 cd ±1,00 10 de ±3,00 6,67 ef ±5,86 - 27 ab ±1,73 29,67 a ±1,53 -
Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng chỉ sự khác biệt có ý nghĩa với P < 0,05 Các gốc vi khuẩn được mã hóa là ORT 1 (3/10/15), ORT 2 (2/4/14), ORT 3 (23/12/16), và ORT 4 (29/04/14) Các loại dịch chiết tỏi bao gồm: tỏi NC (dịch chiết tỏi nguyên chất), tỏi/rượu 100% (dịch chiết tỏi trong rượu không pha loãng), tỏi/rượu 50% (dịch chiết tỏi trong rượu pha loãng 50%), tỏi/rượu 25% (dịch chiết tỏi trong rượu pha loãng 25%), và tỏi/rượu 12,5% (dịch chiết tỏi trong rượu pha loãng 12,5%) Ngoài ra, các kháng sinh được đề cập là doxy (Doxycycline) và amox/clav (Amoxicillin/clavulanic acid), cùng với R (rượu).