Báo cáo thực hành quá trình thiết bị và công nghệ nội dung thu nhận ptotein tổng số và tinh sạch bằng sắc ký cột

Do có hoạt tính phân giải nhanh H2O2 nên catalase có khả năng ức chế sự phân giải của tế bào thần kinh, apoptosis, viêm, lão hóa và một loạt các khối u; hỗ trợ phân phối thuốc nội bào và

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

  

-BÁO CÁO THỰC HÀNH

QUÁ TRÌNH THIẾT BỊ VÀ CÔNG NGHỆ

Nội dung: Thu nhận ptotein tổng số

và tinh sạch bằng sắc ký cột

Giảng viên hướng dẫn: PGS Nguyễn Thị Hồng

Loan ThS Ngô Thị Trang

Mục lục

I Mục tiêu… 1

II Cơ sở lý thuyết 2

1 Enzyme catalase… 2

2 Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose… 2

3 Xác định hàm lượng protein… 2

4 Xác định hoạt tính catalase… 2

5 Điện di gel SDS-PAGE… 3

III Vật liệu và phương pháp 3

1 Vật liệu 3

2 Phương pháp… 4

a Chuẩn bị dịch chiết gan bò 4

b Tinh sạch catalase 5

c Xác định hàm lượng protein… 5

d Xác định hoạt tính catalase… 6

e Xác định khối lượng phân tử của catalase 7

IV Kết quả và thảo luận 7

V Kết luận 11

VI Tài liệu tham khảo 11

I Mục tiêu

Tinh sạch enzyme catalase có trong dịch chiết của gan bò bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion

II Cơ sở lý thuyết

1 Enzym catalase

Catalase là enzyme có mặt ở hầu hết các sinh vật hiếu khí bao gồm thực vật, động vật và vi sinh vật Enzyme là một trong những thành phần trung tâm của các quá trình khử độc, ngăn chặn nhanh chóng sự hình thành phản ứng hydroxyl bằng cách xúc tác sự phân hủy H2O2 thành H2O và O2 Catalase điển hình hoạt động trong khoảng pH 5 - 10, tối ưu tại pH 6 - 8 và

ổn định ở nhiệt độ từ 10 - 30 oC

Catalase từ các nguồn khác nhau chủ yếu là một tetramer với khối lượng phân tử (KLPT) từ 220 đến 270 kDa và đã được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghệ sinh học khác nhau Do có hoạt tính phân giải nhanh H2O2 nên catalase có khả năng ức chế sự phân giải của tế bào thần kinh, apoptosis, viêm, lão hóa và một loạt các khối u; hỗ trợ phân phối thuốc nội bào và sử dụng trong định lượng cholesterol Theo một số công

bố gần đây, sự giảm của catalase có thể đóng vai trò trong quá trình bạc tóc sớm ở người H2O2 tự nhiên được tạo ra bởi các hoạt động trao đổi của cơ thể và catalase có vai trò phân giải chúng rất nhanh Do vậy, nếu hàm lượng catalase giảm đi, nó sẽ không thể phân hủy hết H2O2, dẫn đến tóc bị tẩy trắng từ bên trong Nhận định này vẫn đang được làm sáng tỏ với hy vọng phát triển các phương pháp chữa bạc tóc dựa trên việc bổ sung catalase.

Ở Việt Nam, bò là gia súc khá phổ biến và có vai trò quan trọng trong nông nghiệp; các nghiên cứu cũng cho thấy lượng catalase có nhiều trong gan của động vật (Chatterjee et al., 1990, Nakamura et al., 2000, Prakash

et al., 2002) Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết catalase từ gan bò và tiến hành định lượng định tính protein với mục tiêu

tạo được chế phẩm enzyme có độ tinh sạch cao và hoạt tính tốt, phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng sau này

2 Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose

Sắc ký trao đổi ion là kỹ thuật rất phù hợp dựa trên sự khác nhau trong tính tích điện của protein để phân tách protein trong một hỗn hợp protein Phương pháp này thường được sử dụng như là bước đầu tiên trong quá trình tinh chế enzyme Nguyên tắc phân tách dựa trên sự trao đổi thuận nghịch của các ion giữa các ion có trong mẫu và các ion có sẵn trong nhựa trao đổi ion Chủ yếu, quá trình phân tách trao đổi ion diễn ra trong một cột được phủ bằng chất trao đổi Gel Q-Sepharose là nhựa sắc ký trao đổi ion với nhóm chức amin bậc bốn (Q) [-CH2-N+(CH3)3] được gắn vào Nhóm Q đóng vai trò là chất trao đổi anion mạnh, bị ion hóa hoàn toàn trong vùng pH rộng Được sử dụng để cố định enzyme, kháng thể, các protein và peptide khác thông qua liên kết cộng hóa trị với cột

3 Xác định hàm lượng protein

Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280nm của các protein Tại bước sóng này, các amino acid có vòng thơm sẽ hấp thụ cực đại Từ giá trị OD ở bước sóng 280nm của các mẫu, sử dụng protein albumin huyết thanh bò làm chuẩn với hệ số A280 = 0.66 tương ứng 1 mg/ml để tính ra hàm lượng protein trong mẫu

4 Xác Định hoạt tính protein catalase

Catalase phân giải theo phương trình:

Cho catalase phân giải H202, H202 hấp thụ cực đại, đặc hiệu tại bước sóng 240 nm, khi có hoạt tính của catalase sẽ cho độ hấp thụ giảm dần tại bước sóng này

Một đơn vị hoạt độ catalase được định nghĩa là lượng enzyme phân giải được 1 µmol H trên phút tại 25 C, với lượng H ban đầu là 3,05202 o 202

µmol

5 Điện di gel SDS-PAGE

Điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE) là kỹ thuật được sử dụng để phân tách các protein, đôi khi là để phân tách DNA/RNA trong mẫu để định tính và định lượng Trong đó, điện di đứng trên gel poly-acrylamide có sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất

Nguyên lý hoạt động của SDS-PAGE: Kỹ thuật SDS-PAGE cho phép protein phân tách dựa trên chiều dài mạch polypeptide hay nói cách khác

là dựa trên khối lượng phân tử Để làm được điều này, cần sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS) để protein chuyển về cấu trúc bậc 1 và tạo điện tích

âm tỷ lệ thuận theo khối lượng (mass-to-charge ratio) Điện tích âm tỷ lệ thuận theo khối lượng sẽ giúp loại bỏ ảnh hưởng của điện tích đến quá trình điện di

Hệ thống gel phân tách protein bằng SDS-PAGE sử dụng 2 thành phần: gel cô giúp để tập trung protein thành 1 vạch duy nhất (cùng điểm xuất phát) và gel tách dùng để phân tách các protein, nồng độ của gel tách được

sử dụng sẽ khác nhau tùy vào kích thước protein cần phân tách

Gan bò đã được thu nhận từ chợ ở Hà Nội và bảo quản cho đến khi sử dụng

III Vật liệu và phương pháp

1 Vật liệu

a Nguyên liệu

Gan bò đã được thu nhận từ chợ ở Hà Nội và bảo quản cho đến khi sử dụng

b Hóa chất

- Đệm Tris-HCl 20mM, pH 8,0 có 50 mM NaCl (Đệm A)

- Đệm Tris-HCl 20mM, pH 8,0 có 800 mM NaCl

- Ethanol 70%

- H2O2 0,036% (w/v)

- Polyacrylamide 30%

- Tris-HCl pH 8,8 và pH 6,8

- APS 10%

- SDS 10%

- TEMED

- Đệm chạy điện di SDS

- CBB 0,5 %

- Đệm mẫu

c Dụng cụ

- Ống ly tâm 15ml, 50ml

- Ống eppendorf

- Pipette

- Đầu côn

- Bình tam giác

d Thiết bị

- Máy đo quang phổ

- Bể điện di đứng protein

- Máy ly tâm

- Thiết bị tạo gradient nồng độ muối

2 Phương pháp

Về cơ bản, catalase từ gan bò được thu nhận và tinh sạch theo quy trình của Nadeem et al (2015) với một số cải tiến

a Chuẩn bị dịch chiết gan bò.

Gan của bò được cắt nhỏ nghiền bằng tay với N lỏng đến khi đồng 2

nhất, hoà trong đệm A (tỷ lệ đệm nghiền chiết 1g gan bò: 5ml đệm) N

lỏng sẽ giúp đảm bảo mẫu vật luôn tươi và đệm A làm cân bằng nồng

độ để protein được ổn định

Ly tâm dịch nghiền với tốc độ 12.000 vòng/phút, 4 C trong 30 phúto

thu dịch chiết trong (ghi lại tổng thể tích)

Tủa protein trong dịch chiết gan bò bằng ethanol 70%, trộn đều, để lạnh tại 4 C trong 15 phút, thu tủa bằng ly tâm tại 4 C trong 20 phút;o o

hoà tủa bằng 5 ml đệm A (Nếu tủa không tan hết có thể bổ sung thêm đệm A đến tối đa 10 ml để thu được dịch chiết lỏng chứa protein từ gan bò

b Tinh sạch catalase bằng sắc ký gel Q-sepharose

Dịch thẩm tích được cho lên cột Q-sepharose đã được cân bằng bằng 10 lần thể tích đệm A, tốc độ ~50 ml/h để tạo môi trường và cân bằng cột cho đến khi đạt độ pH thích hợp và độ dẫn điện ổn định Sau đó, tiến hành đưa hỗn hợp protein lên cột với tốc độ 20-30 ml/h, tải của gel 20mg protein/ml gel Các protein tích điện dương trái dấu với môi trường trao đổi ion được giữ lại tạm thời trên cột Rửa cột bằng đệm A với tốc độ 30-50ml/h Rửa cho đến khi OD280<0,05 Sau khi rửa các phân đoạn protein không gắn đi cột, các phân đoạn gắn cột được rửa chiết bằng gradient với đệm A có NaCl từ 50 mM đến

800 mM Nếu protein có giá trị pI gần với pH hơn sẽ bị rửa trôi ở nồng

độ muối thấp, và nếu protein có giá trị pI thấp hơn nhiều với pH sẽ bị rửa ở nồng độ muối cao

c Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định bằng cách sử dụng định luật Lambert Beer với hệ số hấp thụ của catalase ở bước sóng 280 nm là 40,75 M-1cm-1 Hàm lượng protein trong mẫu được tính bằng công thức

Hàm lượng protein (mg/ml) =

d Xác Định hoạt tính protein catalase

Hoạt độ của catalase được xác định dựa trên khả năng phân giải cơ chất H ở nhiệt độ 37 C sử dụng máy quang phổ khả biến ở bước202 o

sóng 240 nm Cho catalase phân giải H2O2, H2O2 hấp thụ cực đại, đặc hiệu tại bước sóng 240 nm,

khi có hoạt tính của catalase sẽ cho độ hấp thụ giảm dần tại bước sóng này

Một đơn vị hoạt độ của catalase phân giải 1 µmol của H202 trong một phút ở 25 C với lượng H2O2 ban đầu là 3,05 μmol o

Các bước tiến hành: tổng thể tích phản ứng là 300 µl bao gồm

nồng độ cuối cùng và thể tích của các chất sau:

- Dùng pipet hút 290 µl của H202 0,036% (w/v) pha trong đệm kaliphosphate 50 mM pH 7,0

- Đặt cuvet vào máy quang phổ và đo tại bước sóng 240 nm đến khi số đọc ổn định (nồng dộ H202 phù hợp cho xác định hoạt tính catalase sẽ có số đọc tại A240 nm trong khoảng 0,52 đến 0,55; ghi lại

số đọc)

- Bổ sung 10 µl mẫu có hoạt tính của catalase và đo ngay lập tức

số đọc của máy quang phổ tại 240 nm tại hai thời điểm 0 phút và 3 phút Nồng độ enzyme phù hợp sẽ cho denta (A240 nm 0 phút - A240

nm 3 phút) dao động khoảng 0,05

- Hoạt độ riêng của catalase được tính theo công thức:

U/ml enzyme = [denta (A240 nm 0 phút - A240 nm 3 phút)* độ pha loãng của mẫu*3,05] / (A240 nm của cơ chất*3*0,01)

U/mg = [U/ml enzyme] / [nồng độ protein (mg/ml)]

Hoạt độ riêng của catalase được tính theo công thức:

Hoạt độ (U/ml) =

Hoạt độ (U/mg) =

e Xác định khối lượng phân tử của catalase

Khối lượng phân tử của catalase được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS không biến tính với các nồng độ gel khác nhau 6–9% (Sean, 1999) Các protein mẫu được cấp

và thang marker chuẩn

Pha gel polyacrylamide 12%:

Thành phần Gel Tách (12%) Gel cô (4%)

Bảng 1 Thành phần gel điện di

- Biến tính mẫu: Cho 6 µl dye vào 24 µl mẫu lần lượt , biến tính ở 100°C trong 5 phút, rồi cho vào tủ lạnh 1 phút

- Đổ running buffer 1x vào trong bể máy điện di

- Cho 25 µl mẫu vào giếng

- Lắp máy, chạy điện di

- Lần 1: 100V, 15 phút

- Lần 2: 150 V, 75 phút

- Nhuộm CBB, lắc trong 30 phút

- Rửa Destaining , rửa qua đêm

IV Kết quả và thảo luận

Bảng 2 : Kết quả đo OD, tính toán hàm lượng protein và hoạt tính của catalase

Phân đoạn E17 cho Hoạt độ(U/ml) lớn nhất, được kỳ vọng là phân đoạn chứa nhiều catalase nhất Phân đoạn E27 cũng cho đỉnh Hoạt độ(U/ml) tuy nhiên lại không trùng với đỉnh đo nồng độ ở 280 nm Trong khoảng phân đoạn E11 – E19, phân đoạn E17 có

độ hấp thụ ở 280 nm cao nhất, điều này trùng với đỉnh của hoạt tính , nên có khả năng cao E17 chứa catalase Tương quan giữa hoạt độ riêng, độ hấp thụ ở 280nm và nồng độ NaCl được thể hiện trong Hình 1

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 100 200 300 400 500 600 700

Phân đoạn gắn cột(E)

Hình 1 Sắc kí đồ các phân đoạn tinh sạch catalase từ dịch gan bò qua cột trao đổi anion Q-sepharose- độ hấp thụ protein tại bước sóng A280 nm

Kết quả điện di SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch qua các bước (hình 2) cũng cho thấy sự có mặt của băng protein KLPT khoảng 60 Kda

Hình 2 Kết quả điện di gel SDS-PAGE: Chú thích:

M: Marker

TS: Tổng số

DC: dịch chiết

FT: flow through

Trên bản gel cho thấy, mẫu tổng số không load vào giếng được nên không

có mẫu tổng số trên gel, kết quả cho thấy băng TS không lên do quá trình trộn mẫu protein với đệm mẫu sai tỉ lệ thể tích nên mẫu TS còn quá nhiều cặn dẫn đến khi tra giếng băng không chạy

E16, E20 được tinh sạch hơn và ta thấy băng của catalase ( 60kDa) Các mẫu sau từ E26 đến E44 mờ dần rồi không hiện lên băng vì ko còn protein đế hiện màu Mặc dù ta thấy theo thông số trên bảng tính có E42 đạt giá trị đỉnh nhưng khi lên điện di SDS - PAGE thì mẫu không hiện lên băng điện di Nguyên nhân của trường hợp trên có thể do một chất nào đó có thể hấp thụ được quang phổ A280

V Kết luận

Chúng em đã tinh sạch được catalase từ gan bò bằng phương pháp kết tủa phân đoạn với acetone kết hợp với sắc ký qua cột trao đổi anion Q-sepharose với hoạt độ riêng là 136,5 U/mg protein Catalase tinh sạch có băng protein khoảng

60 kDa trên gel SDS-PAGE tuy nhiên thí nhiệm điện di có nhiều sai số kết quả không như mong đợi và cần phải lặp lại do chưa đảm bảo chuẩn quy trình thí nghiệm

VI Tài liệu tham khảo

(1) Phạm Thu Hương (2017) Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ Bacillus subtilis PY79 Luận văn thạc sĩ, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam

(2) Nguyen Hoang An, Suminda G G D., Nguyen Thi Thu Phuong, Dinh Nho Thai, Nguyen Thi Hong Loan, 2018 Purification of catalase by modified procedure and some properties of enzyme Tap chi Sinh hoc, 40(2): 214–222 https://doi.org/10.15625/0866-7160/v40n2.10893