Tối Ưu hoá quy trình trích ly dịch chiết giàu anthocyanin, polyphenol từ lá tía tô (perilla frutescens l ) và Định hướng Ứng dụng trong mỹ phẩm

Do có nhiều tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người cũng như trong mối quan hệ sinh thái của thực vật với môi trường xung quanh, việc trích ly các hợp chất từ dịchchiết của lá hẹ đư

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH

0O0

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI THAM GIA CUỘC THI "SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC"

NĂM 2024

TỐI ƯU HOÁ QUY TRÌNH TRÍCH LY DỊCH CHIẾT GIÀU

ANTHOCYANIN, POLYPHENOL TỪ LÁ TÍA TÔ

(Perilla frutescens L.) VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

TRONG MỸ PHẨM

Thuộc nhóm ngành: Công nghệ Hóa – Sinh học – Môi trường

(Chuyên ngành: Công nghệ kỹ thuật hoá học)

Năm 2024

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH

TỐI ƯU HOÁ QUY TRÌNH TRÍCH LY DỊCH CHIẾT GIÀU

ANTHOCYANIN, POLYPHENOL TỪ LÁ TÍA TÔ

(Perilla frutescens L.) VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

TRONG MỸ PHẨM

Sinh viên thực hiện: Tạ Thị Hồng Nhung; Nam, Nữ: Nữ; Dân tộc: Kinh

Ngành học: Kỹ thuật Hoá học

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Minh Tuyền; Nam, Nữ: Nữ; Dân tộc: Kinh

Ngành học: Kỹ thuật Hoá học

Lớp, khoa: 12DHHH1, Khoa Công nghệ hóa học Năm thứ: 3/số năm đào tạo:4

Ngành học: Kỹ thuật Hoá học

Lớp, khoa: 12DHHH1, Khoa Công nghệ hóa học Năm thứ: 3/số năm đào tạo:4

Ngành học: Kỹ thuật Hoá học

Lớp, khoa: 12DHHH1, Khoa Công nghệ Hoá học Năm thứ: 3/số năm đào tạo: 4

Ngành học: Kỹ thuật Hoá học

Người hướng dẫn chính: ThS Trần Nguyễn An Sa

Năm 2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC 3

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH ẢNH 5

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT 6

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 8

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 8

1.1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu về cây hẹ 8

1.1.1.1 Tên gọi và đặc điểm thực vật 8

1.1.1.2 Công dụng của lá hẹ 9

1.1.1.3 Tình hình nghiên cứu cây hẹ 9

1.1.2 Tổng quan về polyphenol, anthocyanin và các chất có hoạt tính kháng oxy hóa 10

1.1.2.1 Tổng quan về polyphenol 10

1.1.2.2 Khái quát hợp chất anthocyanin 10

1.1.2.3 Khái quát hợp chất có hoạt tính kháng oxi hoá 12

1.2 Lý do lựa chọn đề tài 12

1.3 Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu 13

1.3.1 Mục tiêu nghiên cứu 13

1.3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

1.3.2.1 Xác định anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai (AOAC 2005.02) 13

1.3.2.2 Xác định polyphenol tổng bằng phương pháp Folin-ciocaltue 14

1.3.2.3 Thử hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp DPPH 14

1.3.2.4 Phương pháp khối lượng xác định độ ẩm theo TCVN 5613:1991 15

1.3.2.5.Phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm 15

1.3.2.6.Xử lý số liệu 15

1.3.3 Nội dung nghiên cứu 15

1.3.3.1 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô (TCVN 5613:1991) 16

1.3.3.2 Khảo sát phổ và xây dựng đường chuẩn acid gallic (xác định hàm lượng polyphenol TPC) 16

1.3.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình trích ly dịch chiết từ lá tía tô16 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

1.4.1 Nguyên vật liệu 16

1.4.2 Hóa chất 17

1.4.3 Thiết bị và dụng cụ 17

1.4.4 Phạm vi nghiên cứu 17

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18

2.1 Xác định độ ẩm của mẫu nguyên liệu 18

2.4 Kết quả khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình trích ly dích chiết giàu anthocyanin và polyphenol từ lá tía tô 20

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 20

2.4.2 Kết quả khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của hệ dung môi đến hàm lượng chlorophyll và polyphenol 21

2.4.3 Kết quả khảo sát sơ bộ ảnh hưởng nhiệt độ, dung môi và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến qui trình trích ly 21

2.4.3.1 Bố trí thí nghiệm 21

2.4.3.2 Kết quả khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyll22 2.4.3.3 Kết quả khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol23 2.5 Tối ưu tối ưu hóa qui trình trích ly dịch chiết ethanol từ lá hẹ bằng phương pháp bề mặt đáp ứng 25

2.6 Thí nghiệm kiểm chứng 29

2.7 Thử hoạt tính kháng oxi hoá của dịch chiết ethanol từ lá hẹ 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

PHỤ LỤC 32

PHỤ LỤC 1 ĐỒ THỊ KHẢO SÁT KHÁNG OXI HOÁ DPPH CỦA CHẤT ĐỐI CHỨNG ACID ASCOBIC 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH ẢNH

Bảng 2.1 Bảng kết quả phân tích độ ẩm mẫu nguyên liệu 18

Bảng 2.3 Bảng kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của hệ dung môi 21

Bảng 2.4 Bảng kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian đến hàm lượng chlorophyll (mg/g) 22

Bảng 2.5 Bảng kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian đến hàm lượng polyphenol (mg/g) 24

Bảng 2.6 Giá trị mã hóa và các mức của ma trận tối ưu 25

Bảng 2.7 Thiết kế thực nghiệm theo mô hình CCD và kết quả thực nghiệm 25

Bảng 2.8 Thiết kế thực nghiệm theo mô hình CCD và kết quả thực nghiệm 29

Bảng 2.9 Kết quả phân tích dịch chiết ethanol từ lá hẹ (dịch chiết thô) 30

Hình 1.1 Cây hẹ (Allium odorum L.)[1] 8

Hình 1.2 Cấu trúc và phổ hấp thu của anthocyanin ở các pH khác nhau (AOAC 2005:02) 14

Hình 1 2 Cơ chế phản ứng khử DPPH [14] 15

Hình 1.3 Nguyên lệu lá hẹ 17

Hình 1.3 Nguyên lệu thân, lá và hoa cây hẹ Hình 2.1.Phổ hấp thu của phức tạo thành giữa chất đối chứng acid gallic và thuốc thử Folin. 18

Hình 2.2 Đường chuẩn acid galic 19

Hình 2.3 Dịch chiết từ lá tía tô 19

Hình 2.4 Phổ hấp thu của dịch chiết từ lá tía tô sau pha loãng pH1 và pH4,5 20

Hình 2.5.Các bước trích ly dịch chiết anthocyanin và polyphenol trong lá tía tô 20

Hình 2.5 Kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của hệ dung môi 21

Hình 2.6 Kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng chlorophyll (mg/g) 22

Hình 2.7 Kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng chlorophyll 23

Hình 2.8 Kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng polyphenol (mg/g) 24

Hình 2.9 Kết quả sát sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng polyphenol 25

Hình 2.10 Tương quan giữa giá trị thực tế và dự đoán 26

Hình 2.11 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm ẩm, hàm lượng chlorophyll và hàm lượng polyphenol 27

Hình 2.12 a Đồ thị minh họa sự phụ thuộc của hàm mục tiêu Y (hàm lượng chlorophyll và hàm lượng polyphenol) vào yếu tố khảo sát 28

Hình 2 13b Điều kiện tối ưu hoá qui trình trích ly dịch chiết ethanol từ lá hẹ 29

Hình 2 14 Phổ hấp thu của dịch chiết ethanol từ lá hẹ 30

Hình 2 15 Phổ hấp thu của dịch chiết ethanol +DPPH và DPPH (thử hoạt tính kháng oxi hoá) 30

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

DPPH (2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl)

MỞ ĐẦU

Cây hẹ, được biết đến là một loại cây quen thuộc với người dân Việt Nam, có tên

khoa học là Allium ramosum L thuộc họ hành tỏi Alliaceae Cây hẹ có rất nhiều công

dụng tốt đối với sức khỏe con người, đặc biệt là cây Hẹ là loại cây có thể trồng ở rất nhiềunơi, sinh trưởng nhanh Trong cây hẹ có chứa sulfur, saponin, vitamin, khoáng chất, một

số chát kháng sinh có khả năng diệt được nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Lá hẹ ngoàicông dụng chế biến món ăn thì còn có thể giúp duy trì cấu trúc của màng tế bào, cải thiệntrí nhớ và đáng chú ý là trong lá hẹ có chứa hợp chất flavonoid rất hiệu quả trong việc hỗtrợ phòng và điều trị các căn bệnh tiểu đường, bệnh về hệ tim mạch Các hợp chất nàycòn góp phần vào chất lượng dinh dưỡng, cảm quan của rau quả về màu sắc, mùi vị và làmột yếu tố quan trọng bảo vệ sức khỏe của con người Chính vì vậy, chúng ngày càngđược thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do các tác dụng kháng oxy hóa,phòng ngừa ung thư và các căn bệnh liên quan đến hệ tim mạch, chống dị ứng, co giật,giảm đau, …Do đó, chúng được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp thựcphẩm, dược phẩm nhằm phục vụ lợi ích của con người

Do có nhiều tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người cũng như trong mối quan

hệ sinh thái của thực vật với môi trường xung quanh, việc trích ly các hợp chất từ dịchchiết của lá hẹ được nhóm quan tâm và tiến hành nghiên cứu khảo sát Cây hẹ là một loạicây mọc phổ biến ở nước ta, nhưng cho đến nay, tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào vềmục đích ứng dụng của dịch chiết lá hẹ được công bố

Vì vậy, việc nghiên cứu tối ưu hóa quy trình trích ly và khảo sát hoạt tính kháng oxyhóa của dịch chiết với dung môi ethanol từ lá hẹ là một trong những hướng nghiên cứuthiết thực và là lựa chọn tối ưu trong hóa học phân tích xanh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài

1.1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu về cây hẹ

1.1.1.1 Tên gọi và đặc điểm thực vật

- Tên tiếng Việt:cửu thái, cửu thái tử, khởi dương thảo (là các vị thuốc)

- Tên khoa học: Allium odorum L.

- Tên đồng nghĩa: Allium tuberosum L

- Họ: Hành tỏi Alliaceae

Hình 1.1 Cây hẹ (Allium odorum L.)[1]

Theo GS.Đỗ Tất Lợi, Cây hẹ (Allium odorum L.) là loại cỏ nhỏ có nguồn gốc hoang

dại ở vùng Trung và Bắc Á, được người Trung Quốc đưa về trồng khoảng 200 năm trướcCông nguyên Từ đó, cây Hẹ được phát triển sang các vùng Đông và Nam Á Ở ViệtNam, cây Hẹ được trồng trong cả nước, từ đồng bằng đến vùng núi [1]

Đặc điểm giải phẫu: thân cỏ nhiều năm, cao 20-50 cm, có mùi hăng Nhiều thânhành nhỏ, màu trắng được bao bên ngoài bởi lớp áo mỏng màu nâu vàng, dạng sợi, nốitiếp thân hành là thân rễ Thân rễ màu nâu, mọc ngang hơi chếch Lá mọc so le thành 2dãy, hơi chụm ở gốc, hình dải, dẹp, đặc, kích thước 15-40μm 0,2-0,7 cm, bẹ lá dài vàmỏng Cụm hoa là tán giả trên trục cụm hoa thẳng đứng dài 30-50 cm Lá bắc tổng baodạng mo, mỏng, xẻ 1 bên hoặc xẻ 2-3 mảnh, ngắn hơn cụm hoa, khô xác và tồn tại Trêncụm hoa có 20-33 hoa, đính thành 3-5 vòng Hoa nhỏ, nụ hình 3 cạnh, màu trắng, đều,lưỡng tính; cuống hoa dài 1-2,5 cm, gốc có lá bắc nhỏ Bao hoa 6 phiến, hình trứng hoặc

trứng ngược, dài 4-5 mm, rộng 2,5-3 mm, rời nhau hoặc dính nhau rất ít ở đáy, xếp trên 2vòng; mỗi phiến có 1 gân giữa màu xanh ở bên ngoài Nhị 6, rời nếu bao hoa rời; trườnghợp hoa có bao hoa dính nhau thì gốc chỉ nhị hợp và dính với bao hoa Chỉ nhị dài 2-2,5mm; bao phấn khi hoa chưa nở có màu xanh, sau khi đã nở có màu vàng, 2 ô, nứt dọc,hướng trong, đính đáy Hạt phấn hình bầu dục hay chữ nhật, có rãnh dọc ở giữa, kíchthước 32,5- 42,5 μm Bầu trên, hình chùy ngược, có 3 thùy, giữa mỗi thùy có rãnh dọc.Mặt ngoài có những nốt nhỏ, 3 ô, mỗi ô 2 noãn, đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy rất ngắnmàu trắng; đầu nhụy không rõ [2]

1.1.1.2 Công dụng của lá hẹ

Theo kinh nghiệm dân gian, hẹ thường được dùng chữa ho của trẻ em, hen suyễnnặng, đau cổ họng, sưng yết hầu, còn dùng chữa các bệnh kiết lỵ ra máu, làm thuốc bổgiúp trong tiêu hóa kém, mồ hôi trộm, tốt cho gan, thận, chữa bệnh di tinh, đi tiểu nhiềulần, tiểu ra máu, tiêu chảy, viêm mũi, viêm tai giữa, viêm tuyến tiền liệt Lá hẹ cũng hiệuquả trong điều trị lỵ amip Theo tài liệu cổ hẹ có vị cay, ngọt, tính ôn vào hai kinh can vàthận, có tác dụng bổ can thận, làm ấm lưng gối, dùng làm thuốc chữa tiểu tiện nhiều lần,đái són, đái dầm [1]

Nước ép lá tươi và thành phần bay hơi của cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối

với Streptococcus hemolyticus, Salmonella tryphi, Shigella flexneri, Shigella shiga, Coli

bethesda, Bacillus subtilis Hoạt chất odorin có tác dụng ức chế mạnh Staphyllococcus aureus Lá hẹ tươi có tác dụng diệt trùng roi âm đạo sau 30 phút tiếp xúc Nước ép lá hẹ

lọc bỏ cặn, tiêm tĩnh mạch cho chuột nhắt trắng với liều 0,1-0,5 ml/10 g thân trọng, xuấthiện triệu chứng choáng, vật vã, co giật và chuột chết sau nửa giờ Hẹ được dùng làm gia

vị và làm thuốc Theo kinh nghiệm dân gian, lá và thân hành chữa ho trẻ em, hen suyễn,tiêu hoá kém, giun kim, lỵ amip, mồ hôi trộm Liều dùng hàng ngày: 20-30 g Hạt Hẹchữa bệnh dương ủy, di mộng tinh, đái són, đái đàm, đau lưng, mỏi gối, khí hư với liều 4-

12 g mỗi ngày [2]

1.1.1.3 Tình hình nghiên cứu cây hẹ

Theo Đỗ Tất Lợi, trong lá và rễ người ta nghiên cứu thấy các hợp chất sunfua,saponin và chất đắng, Năm 1948, Shen – Chi – Shen (Trung Quốc) đã báo cáo chiếtđược từ dò cây hẹ (củ hẹ) một hợp chất được đặt tên là odorin ít độc với động vật cao cấp,

nhưng lại có tác dụng kháng sinh đối với vi trùng Staphylococus aureus và Bacillus coli

Theo Trung dược chí, 1993, thân hành hẹ chứa allicin, methylallicin; lá chứa hợp chấtsulfid, linalol [1]

Ở Việt Nam, năm 2019, Huỳnh Thị Ngọc Ni đã nghiên cứu thành phần hóa học và

khả năng kháng oxi hóa của tinh dầu lá hẹ (Allium Odorum L.) ở Phú Yên Kết quả

nghiên cứu cho thấy (viết tóm tắt kết quả bài báo vào) [3]

Trên thế giới và Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về dịch chiết từ lá Hẹđược công bố

1.1.2 Tổng quan về polyphenol, anthocyanin và các chất có hoạt tính kháng oxy hóa 1.1.2.1 Tổng quan về polyphenol

Polyphenol là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tồn tại trong thực vật đượcchứng minh là có khả năng chống oxy hóa vô cùng hiệu quả Polyphenol có thể bảo vệ cơthể, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau do gốc tự do gây ra Đặc điểm chungcủa chúng là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzen) chứa một hay hai, ba hoặcnhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Tùy thuộc vào số lượng và vịtrí tương hỗ của các nhóm OH với bộ khung hóa học mà các tính chất lý hoá học hoặchoạt tính sinh học thay đổi [3]

1.1.2.2 Khái quát hợp chất anthocyanin

Chlorophyll (chất diệp lục) là sắc tố màu xanh lá cây được tìm thấy trong cây xanh,tảo, cây dương xỉ, rêu và một số loại vi khuẩn Chlorophyll chịu trách nhiệm thu nhậnnăng lượng từ ánh sáng mặt trời cho quá trình quang hợp, tạo ra tinh bột và oxy từ cacbondioxit và nước, và chuyển hóa quang năng thành hóa năng [4]

Chlorophyll là chất có hoạt tính hoá học cao, vừa có tính acid, vừa có tính kiềm, cótính chất lý học quan trọng trong thực hiện chức năng quang hợp Giữa nhân chlorophyll

có nguyên tử Mg tạo nên cấu trúc dạng heme gần giống với hemoglobin ở máu người,cũng gồm 4 nhóm heme gắn với một nguyên tố kim loại Màu xanh có trong lục lạp dochlorophyll a và chlorophyll b với tỉ lệ 3/1 Trong đó chlorophyll a: có màu từ xanh datrời đến xanh lá cây, hấp phụ bước sóng 660-665nm và cholorophyll b có màu từ vàngđến xanh lá cây, hấp phụ bước sóng 642-652nm Chlorophyll a và b khác nhau ở vị trí C

3, loại a chứa nhóm methyl –CH3, loại b chứa nhóm formyl –CHO [5]

Mặc dù các chất màu tổng hợp có sự bền màu và tiện dụng hơn trong quá trình sửdụng cũng như bảo quản, luật pháp hiện nay chỉ cho phép những chất màu có trong danhmục mới được bổ sung vào sản phẩm thực phẩm vì lý do an toàn cho sức khỏe Vì những

lý do này, các sắc tố màu tự nhiên hiện nay rất được quan tâm, một trong số đó làchlorophyll Trong thực phẩm, chlorophyll được sử dụng như phụ gia tạo màu (E140)cho một số sản phẩm như kẹo, nước sốt, gia vị, pho mát, nước giải khát… yêu cầu về chấtmàu tự nhiên này để thay thế cho chất màu nhân tạo ngày một tăng [5]

Trong y học, chlorophyll được sử dụng với mục đích chữa bệnh như: ngăn ngừa vàđiều trị ung thư, giải độc gan, kích thích hệ thống miễn dịch, kháng viêm và da phát ban,thanh lọc máu và độc tố trong cơ thể, làm sạch ruột, chữa lành vết thương … Chúng hìnhthành cấu trúc phức hợp với một số chất gây ung thư như: aflatoxin B1 trong một số loạigia vị và thảo mộc, heterocyclic amine trong thịt nấu chín hoặc polycyclic aromatichydrocacbon trong thuốc lá hay các chất gây ung thư trong các mô nhạy cảm sau đónhững phức hợp này được hấp thụ và tiêu hóa Chlorophyll có thể ức chế sự tích lũycanxi oxalat dihydrate (còn gọi là sỏi thận) Chlorophyll và các dẫn xuất của nó thườngđược sử dụng phổ biến trong các sản phẩm dược phẩm, chúng làm tăng nhanh khả năngchữa lành vết thương đến hơn 25% trong một số nghiên cứu, vì chlorophyll thúc đẩy sựhình thành mô tế bào, ngăn ngừa sự xâm nhập của vi sinh vật Việc sử dụng thuốc mỡ cóchlorophyll cũng có tác dụng làm giảm đau sau vài ngày cũng như cải thiện đáng kể diệnmạo của các mô bị tổn thương, sự chảy mủ hay mùi từ các vết lở loét sau vài ngày xử lývới chlorophyll Tương tự, chlorophyll cũng là hợp chất quan trọng trong điều trị hậuphẫu thuật trực tràng Chlorophyll a và các dẫn xuất của nó như pheophorbide b vàpheophytin b hiện diện trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong phòng chống ungthư bởi hoạt tính kháng oxy hóa và chống đột biến hay bẫy các tác nhân gây đột biến [5].

Ở Tây Ban Nha, năm 2020, Antonio Pérez-Gálvez và Isabel Viera and María Roca

đã thực hiện nghiên cứu về “Carotenoids and chlorophyll as antioxidants” qua nghiêncứu cho đọc giả cái nhìn cơ bản về cấu trúc hóa học cũng như là hoạt tính kháng oxy hóacủa sắc tố caroten và chlorophyll, bên cạnh đó cũng thấy được sự đa dạng về hoạt tính vàtác dụng và sự phức tạp về cơ chế chống oxy hóa của chúng [6]

Năm 2016, Zhuoya Ni, đã tiến hành nghiên cứu “Chlorophyll fluorescence

retrieval method and its application on detecting the early water stress”, kết quả báo cáo

cho thấy về cơ bản thì huỳnh quang của chlorophyll có thể được thu hồi và ứng dụng của

nó ngày càng được phát triển và hoàn thiện, nhưng song song với đó còn một số trở ngại

về cân bằng sinh thái [7]

Ở Việt Nam hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu cũng như là úng dụng hợp chấtchlorophyll vào sản phẩm thương mại Một ví dụ điển hình, năm 2016, nhóm tác giả LêThị Hồng Ánh, Hoàng Thị Ngọc Nhơn, Nguyễn Minh Kiên, Trần Trung Kiên đến từtrường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh đã tiến hành đề tài nghiên cứu

“Nghiên cứu thu nhận bột màu chlorophyll từ rong nước lợ Cheatimorpha SP Đồng

bằng Sông Cửu Long” Kết quả của đề tài mở ra hướng mới cho việc sản xuất chất màu

từ nguồn nguyên liệu rong mền dồi dào nhưng đang còn bị bỏ phí ở nước ta [5]

1.1.2.3 Khái quát hợp chất có hoạt tính kháng oxi hoá

Các chất chống oxi hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặcđảo ngược quá trình oxi hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể Dựa trên nguyên tắchoạt động, các chất chống oxi hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxi hóa bậcmột và các chất chống oxi hóa bậc hai Các chất chống oxi hóa bậc một khử hoặc kết hợpvới các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quátrình oxi hóa Các chất chống oxi hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấpthụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vôhoạt oxi đơn) [8].

Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa: Quá trình oxy hóa là hiện tượng gây ra gỉkim loại, là nguyên nhân làm rau và hoa quả, làm cho chất béo bị ôi thiu, nó làm thay đổihương vị và màu thực phẩm Sinh vật cũng trải qua hiện tượng oxy hóa, nhưng bản thânsinh vật được trang bị để chiến đấu chống lại những thay đổi này: một hệ thống miễn dịchkhổng lồ, với hệ thống enzym và/hoặc hệ thống enzym tái sinh các phức hợp liên quan[8].Ví dụ axit ascorbic (vitamin C) hoặc glutathione [8]

Nhưng hệ thống phòng thủ này đôi khi bị choáng ngợp Đặc biệt là khi có các cuộctấn công với ảnh hưởng của khói thuốc, ô nhiễm, ánh nắng mặt trời, thể chất, cường độcao, [8] Một số trường hợp có thể gây ra sự mất cân bằng miễn dịch:

- Trong điều kiện căng thẳng và sau đó quá trình oxy hóa tăng lên đến mức không thểđiều chỉnh được

- Trong điều kiện dinh dưỡng kém và sau đó là lượng chất chống oxy hóa cung cấpkhông đủ để khôi phục sự cân bằng

Hệ thống các chất chống oxi hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn:bên trong và bên ngoài Các chất chống oxi hóa bên trong bao gồm các protein (ferritine,transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxi hóa (superoxydedismutase, glutathion peroxydase catalase) Các chất chống oxi hóa bên ngoài là các cấu

tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồm vitamin E, vitamin C, cáccarotenoid và các hợp chất phenolic Các chất này có nhiều trong rau và quả − ¿ chúngđược coi là các chất chống oxi hóa tự nhiên Việc sử dụng nhiều rau quả là con đườngđơn gian và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxi hóa và ngănngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxi hóa [9]

1.2 Lý do lựa chọn đề tài

Hẹ (Allium ramosum L.) là một loại rau rất phổ biến, không chỉ được sử dụng trong

ẩm thực như một loại gia vị mà còn có giá trị y học, theo y học cổ truyền, lá hẹ được sửdụng trong các bài thuốc dân gian để giải nhiệt, tiêu độc Theo một số nghiên cứu đãcông bố, hẹ cũng giống như các cây họ hành khác, thân hẹ chứa allicin, methylallicin; lá

hẹ chứa hợp chất sulfid, linalol … được biết đến là có tác dụng kháng viêm, chống ung

thư, chống oxy hóa và giảm cholesterol Mặc dù cây hẹ đã được nghiên cứu khá nhiều vềhoạt tính sinh học của lá, thân và tinh dầu lá hẹ, nhưng quá trình trích ly dịch chiết chứacác chất có hoạt tính sinh học như polyphenol, clorophyll từ lá hẹ chưa được nghiên cứu.

Do đó, nghiên cứu tối ưu hoá qui trình trích ly dịch chiết chứa các chất này lá cấp thiết,

có thể hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ lá hẹ, tăng cường khả năng

sử dụng của Allium ramosum L trong y học và công nghiệp thực phẩm.

1.3 Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu là tối ưu hóa qui trình trích ly dịch chiết giàu anthocyanin,

polyphenol từ lá tía tô (Perilla frutescens L.) bằng phương pháp bề mặt đáp ứng và định

hướng ứng dụng trong mỹ phẩm

1.3.2 Phương pháp nghiên cứu

1.3.2.1 Xác định anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai (AOAC 2005.02)

Theo AOAC 2005:02, anthocyanin có màu thay đổi theo pH, tại pH = 1 cácanthocyanidin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, và tại

pH = 4,5 anthocyanidin tồn tại ở dạng carbinol không màu (Hình 2.1a) Phổ hấp thu của anthocyanin (Hình 2.1b) có cực đại hấp thu ở 520 nm (đệm pH = 1 trong nước), độ hấp

thu tỉ lệ thuận với nồng độ anthocyanin có trong mẫu Để xác định hàm lượnganthocyanidin có trong dung dịch chiết, pha loãng dịch chiết anthocyanidin bằng đệm

pH = 1 và đệm pH = 4,5 trong nước, đo độ hấp thu A ở bước sóng hấp thụ cực đại, so với

độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm, hàm lượng anthocyanin được tính theo công thức (2.2)

và (2.3) [18]

Hàm lượng anthocyanin trong nguyên liệu thô được tính theo công thức 2.2

Anthocyanin (mg/g) = (2.2)Nồng độ anthocyanin trong dịch chiết được tính theo công thức 2.3

Anthocyanin (mg/mL) = (2.3)Trong đó: A = (A520nm – A700nm) pH 1,0 – (A520nm – A700nm) pH 4,5

f: hệ số pha loãng, l = 1cmM: phân tử lượng của anthocyanin (449,2 g/mol)

 (hệ số hấp thu phân tử mol) = 26 900 Lmol-1cm-1

(a) Cấu trúc anthocyanin ở các pH

1.3.2.2 Xác định polyphenol tổng bằng phương pháp Folin-ciocaltue

Phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin – ciocalteu đặc hiệu cho các nhómphenol do tính chất khử của chúng Nguyên tắc của phương pháp này là phản ứng khửcác acid photphomolybdic của các hợp chất phenolic trong môi trường kiềm tạo thànhmột phức màu xanh Dựa và độ hấp thu của phức màu xanh đó để định lượng polyphenoltổng số [11]

Theo báo cáo đã được công bố của tác giả Nguyễn Quốc Thịnh và các cộng sự [16],các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng giữa acid gallic (chất đối chứng) và thuốc thử Folinciocaltue như sau: phức tạo thành có màu xanh hấp thu cực đại ở 753nm, phức bền trongkhoảng pH 7,89 đến 8,67 (tương đương với nồng độ dung dịch Na2CO3 ban đầu là 1,2M(12,7%)), thuốc thử Folin ở nồng độ 0,2M (tương ứng với 10%), phức tạo thành để ổnđịnh sau 60 - 90 phút [12]

1.3.2.3 Thử hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp DPPH

DPPH (2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sànglọc tác dụng chống oxi hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxi hóa thể hiện quaviệc làm giảm màu DPPH, được xác định bằng đo quang ở =517 nm [13]

Hình 1 3 Cơ chế phản ứng khử DPPH [14]

1.3.2.4 Phương pháp khối lượng xác định độ ẩm theo TCVN 5613:1991

Xác định độ ẩm là một chỉ tiêu kiểm soát chất lượng quan trọng trong đánh giá chấtlượng nguyên liệu và sản phẩm Phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu ápdụng phương pháp mất khối lượng do làm khô theo Phụ lục 9.6-Dược điển Việt Nam V

và TCVN 5613:1991 [15]

1.3.2.5.Phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm

Trích ly hỗ trợ siêu âm là phương pháp phổ biến được sử dụng trong chiết xuất cáchợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thực vật Nhiều nghiên cứu đã chứng minhhiệu quả của phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm để chiết các hợp chất sinh học từ thựcvật so với phương pháp chiết truyền thống Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm không chỉ giúptăng cường sự phân mảnh mà còn hỗ trợ giải phóng, khuếch tán và hòa tan các thànhphần bên trong tế bào

Năng lượng của siêu âm có tác dụng làm tăng mạnh tính thẩm thấu và khuếch tánnhờ những tác dụng của siêu âm như sau: làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằngcách phân tán chúng thành những hạt nhỏ; phá vỡ một phần màng tế bào; tăng cường sựxáo trộn của hỗn hợp; có tác dụng làm nóng tại chỗ

Phương pháp này có thể rút ngắn thời gian trích ly, ngoài ra nó không đòi hỏi thiết

bị hoặc kỹ thuật phức tạp điều nằy làm giảm phần lớn chi phí sản xuất so với các phươngpháp khác [16]

1.3.2.6.Xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Design-Exper 6.0.9 (Stat-Ease, Inc Minneapolis, USA) đểthiết kế thí nghiệm tối ưu hóa Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phầm mềm thống kêSPSS kiểm định Tukey được thực hiện sau phân tích ANOVA để đánh giá sự khác nhaucủa các giá trị với mức ý nghĩa p<0,05

1.3.3 Nội dung nghiên cứu

1.3.3.1 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô (TCVN 5613:1991)

Xác định độ ẩm là một chỉ tiêu kiểm soát chất lượng quan trọng, hàm lượng cácchất được tính trên nguyên liệu khô (đã trừ ẩm) Áp dụng phương pháp mất khối lượng

do làm khô (Phụ lục 9.6-Dược điển V) và TCVN 5613:1991, cân chính xác khoảng 1gnguyên liệu (với sai số không vượt quá 0,001g) cho vào chén cân đã được sấy cùng vớinắp đến khối lượng không đổi, cho chén cân và nắp vào tủ sấy, nâng nhiệt độ lên 103±2

oC Sấy mẫu trong 2 giờ, sau đó đậy nắp chén, làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân.Sau khi cân lần thứ nhất sấy lại mẫu ở nhiệt độ trên trong 1h đến khối lượng không đổi[15]

1.3.3.2 Khảo sát phổ và xây dựng đường chuẩn acid gallic (xác định hàm lượng

polyphenol TPC).

Để khảo sát ảnh hưởng của phổ đến phản ứng giữa acid gallic và thuốc thử Folinciocalteu, bố trí thí nghiệm như sau : Hút lần lượt 2,5mL dung dịch thuốc thử Folin 10%,thêm 1mL acid gallic (1-20 ppm) và 1,5mL dung dịch Na2CO3 có nồng độ 1,2M, phảnứng trong 60 - 90 phút, tiến hành quét phổ trong vùng 600 – 850nm để xác định bướcsóng hấp thu phổ cực đại của phức chất tạo thành

Xây dựng đường chuẩn, tiến hành pha dung dịch chuẩn acid gallic có nồng độ1000ppm Sau đó hút một thể tích xác định cho vào ống nghiệm có sẵn 2,5mL thuốc thửFolin 10% sao cho nồng độ chuẩn acid gallic nằm trong khoảng nồng độ của đườngchuẩn, thêm và 1,5mL Na2CO3) (1,2M), lắc đều, để yên cho phức màu ổn định trong 60phút và đem đo ở bước sóng đã tối ưu Dựa vào mật độ quang A đo được tính nồng độthực tế

1.3.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình trích ly dịch chiết từ lá tía tô

Phương pháp được sử dụng để khảo sát lựa chọn trích ly là trích ly hỗ trợ siêu âmvới dung môi được lựa chọn khảo sát là ethanol và nước, thí nghiệm được thực hiện nhưsau: mẫu lá hẹ sau khi xử lý sơ bộ được cắt nhỏ, cân m(g) mẫu cho vào ống nghiệm, thêm

V (mL) dung môi vào, siêu âm, ly tâm thu dịch chiết Các biến khảo sát bao gồm: nồng

độ dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

Dựa vào kết quả khảo sát sơ bộ, phần mềm Design Expert 11 được sử dụng để bố tríthí nghiệm với các thông số được mã hoá X là nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ nguyên liệu/dungmôi; Y là hàm lượng polyphenol, hàm lượng chlorophyll Điều kiện tối ưu thu được làhàm lượng chlorophyll và polyphenol là cao nhất

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.4.1 Nguyên vật liệu