Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thăm dò các thông số cho quá trình lên men mật ong giàu acid gluconic - Định hướng ứng dụng trong mỹ phẩm

iiNHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngày, tháng, năm sinh: 02/11/1992 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Nơi sinh: Đồng Nai Mã số: 60 42 02 01 ONG GIÀU ACID GLUCONIC – ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG MỸ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

THĂM DÒ CÁC THÔNG SỐ CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN MẬT ONG GIÀU ACID GLUCONIC - ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

TRONG MỸ PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp HCM, tháng 5 năm 2017

iCông trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG – HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ nhận xét 1: Cán bộ nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM Thời gian bảo vệ: Ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1

2 3 4 5 Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sửa chữa (nếu có)

iiNHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 02/11/1992 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Nơi sinh: Đồng Nai Mã số: 60 42 02 01

ONG GIÀU ACID GLUCONIC – ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Các thí nghiệm tiền đề về tuyển chọn chủng vi sinh cho quá trình lên men mật

ong giàu acid gluconic - Khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và môi trường dinh dưỡng

đến quá trình lên men mật ong với hàm mục tiêu acid gluconic - Khảo sát các biến động trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter BioFlo - Khảo sát các quá trình sau lên men và bước đầu đánh giá độ ổn định chất lượng

của sản phẩm tẩy trang dưỡng da giàu acid gluconic

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Tp HCM, ngày tháng năm 2017

TRƯỞNG KHOA

iiiđến PGS TS Nguyễn Thúy Hương là người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn và truyền đạt cho tôi những phương pháp kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý Thầy Cô đã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Bách Khoa nói chung và quý Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng, đã dùng tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức chuyên ngành cũng như những kĩ năng trong cuộc sống, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận và chương trình học này

Con xin cảm ơn Ba, Mẹ đã nuôi nấng dạy dỗ con nên người Con cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn bên cạnh động viên, luôn bên cạnh con những lúc khó khăn, tạo điều kiện cho con học tập

Xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương- học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 14 đã luôn chia sẻ và nhiệt tình hỗ trợ tôi thực hiện thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 14 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tp Hồ Chí Minh, Ngày Tháng Năm 2017

Trần Thị Ngọc Diệp

ivđịnh hướng ứng dụng trong mỹ phẩm” được tiến hành qua việc lên men mật ong bởi vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus với mục đích thu nhận mật ong giàu acid gluconic, định hướng ứng dụng trong mỹ phẩm Nghiên cứu khảo sát các thông số cho quá trình lên men mật ong thu được kết quả của các yếu tố lần lượt như sau: Tỷ lệ pha loãng mật ong và nước dừa già là 1:4, tỷ lệ giống vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ban đầu là 4%, pH lên men là 4.5, lên men ở nhiệt độ 30oC và thời gian lên men 5 ngày Từ đó, nghiên cứu tiếp tục khảo sát các biến động trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter BioFlo Giá trị acid gluconic đạt cực đại khi lên men trên hệ thống fermenter BioFlo là 128.91 mg/L

v riched in gluconic acid - oriented in cosmetics applications” is conducted by fermenting honey by Gluconacetobacter xylinus for the purpose of obtaining honey that is rich in gluconic acid, oriented in cosmetic applications We study parameters of honey fermentation process, which resulted in the following factors: The dilution ratio of honey and old coconut milk was 1: 4, the proportion of Gluconacetobacter xylinus bacteria at the beginning was 4%, the fermented pH was 4.5, the fermentation was set at 30oC and the duration lasted for 5 days From there, we study the changes in the fermentation process on the BioFlo fermenter system The gluconic acid value reached its maximum when fermented on the BioFlo fermenter system at 128.91 mg/L

vi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

1.2 Các sản phẩm từ mật ong lên men 14

1.2.1 Rượu mật ong (Mead) 14

1.2.2 Mỹ phẩm chăm sóc da 16

1.3 Mật ong lên men và định hướng ứng dụng trong mỹ phẩm 18

1.3.1 Acid gluconic 18

1.3.2 Hệ vi sinh vật và quá trình sinh tổng hợp acid gluconic 21

1.3.3 Ứng dụng của acid gluconic trong mỹ phẩm 27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường nghiên cứu 30

2.1.1 Nguồn giống vi sinh vật 30

2.1.2 Nguyên liệu 30

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32

2.2.2 Bố trí thí nghiệm 33

2.3 Phương pháp phân tích 37

2.3.1 Đếm mật độ tế bào bằng phương pháp đếm gián tiếp 37

2.3.2 Phương pháp định lượng acid gluconic 38

2.3.3 Phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS) định lượng đường khử 39

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định sản phẩm 39

3.1.3 Định lượng một số thành phần chính của mật ong 43

3.2 Khảo sát quá trình lên men 43

3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng giữa mật ong và nước dừa già đến quá trình lên men: 43

3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ban đầu đến khả năng hình thành acid gluconic

45

3.2.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng hình thành acid gluconic 46

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành acid gluconic 48

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng hình thành acid gluconic 50 3.3 Khảo sát các biến động trong quá trình lên men trên hệ thống Fermenter BIO FLO 51

3.4 Bước đầu đánh giá chất lượng sản phẩm mật ong lên men giàu acid gluconic trên hệ thống fermenter 55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Kiến nghị 57

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 1: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS 66

PHỤ LỤC 2: PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN VI KHUẨN Gluconatetobacter xylinus 69

PHỤ LỤC 3: CÁC KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHÁC 70

PHỤ LỤC 4: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG 75

ix DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học chủ yếu trong mật ong (100 g) 5

Bảng 1.2: Các chỉ tiêu hóa lý của mật ong theo TCVN 6

Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng của mật ong 7

Bảng 1.4: Một số khoáng chất, vitamin và nguyên tố hóa học trong mật ong 8

Bảng 1.5: Các đặc tính hóa lý của acid gluconic 19

Bảng 2.1: Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và môi trường dinh dưỡng ban đầu đến quá trình lên men 35

Bảng 3.1: Một số biến động trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter 52

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát các đơn yếu tố ảnh hưởng khả năng sinh acid gluconic 55

Bảng 3.3: Kết quả phân tích các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm mật ong lên men giàu acid gluconic 56

x DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Hàm lượng acid gluconic sinh tổng hợp của các chủng khảo sát 41 Biểu đồ 3.2: A, Mật độ vi sinh vật (log CFU/ml); B, Độ Brix (%); C, pH; D, Hàm lượng acid gluconic (mg/L) của dịch mật ong lên men ở các tỷ lệ pha loãng mật ong với nước dừa già khác nhau 44 Biểu đồ 3.3: A, Mật độ vi sinh vật (log CFU/ml); B, Độ Brix (%); C, pH; D, Hàm lượng acid gluconic (mg/L) của dịch mật ong lên men ở các tỷ lệ giống ban đầu khác nhau 46 Biểu đồ 3.4: A, Mật độ vi sinh vật (log CFU/ml); B, Độ Brix (%); C, pH sau lên men; D, Hàm lượng acid gluconic (mg/L) của dịch mật ong lên men ở các giá trị pH khác nhau 47 Biểu đồ 3.5: A, Mật độ vi sinh vật (log CFU/ml); B, Độ Brix (%); C, pH; D, Hàm lượng acid gluconic (mg/L) của dịch mật ong lên men ở các điều kiện nhiệt độ lên men khác nhau 48 Biểu đồ 3.6: A, Mật độ vi sinh vật (log CFU/ml); B, Độ Brix (%); C, pH; D, Hàm lượng acid gluconic (mg/L) của dịch mật ong lên men ở các mốc thời gian lên men khác nhau 50

xi DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 2.1: Phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng acid gluconic và mật độ quang OD tại bước sóng 340nm 38 Đồ thị 3.1: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus…….43 Đồ thị 3.2: Biến động mật độ vi sinh vật trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter 52 Đồ thị 3.3: Biến động hàm lượng đường khử trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter 53 Đồ thị 3.4: Biến động pH trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter 54 Đồ thị 3.5: Biến động hàm lượng acid gluconic trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter 54

xii DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sản phẩm Mead 15

Hình 1.2: Mỹ phẩm chăm sóc da từ mật ong 16

Hình 1.3: A, Công thức cấu tạo của glycolic acid (AHA); B, công thức cấu tạo của gluconic acid (PHA) [70, 72] 17

Hình 1.4: Công thức cấu trúc của acid gluconic [70] 18

Hình 1.5 : Con đường Gluconate [70] 20

Hình 1.6: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành acid gluconic bởi A niger [70] 21

Hình 1.7: Con đường sinh tổng hợp acid gluconic từ glucose bởi vi khuẩn Pseudomonas và vi khuẩn acetic 23

Hình 1.8: Hình thái vi khuẩn Gluconacetobacter 26

Hình 1.9: Hai con đường oxy hóa D- glucose tạo thành acid gluconic ở vi khuẩn acetic [82] 27

Hình 1.10: Chu kỳ sống của tế bào da [79] 28

Hình 1.11: Sản phẩm mỹ phẩm có thành phần chính là acid gluconic 29

Hình 2.1: Nguyên liệu mật ong hiệu Vina Ong 30

Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32

Hình 2.3: Thiết bị lên men fermenter BioFlo 110 36

Hình 2.4: Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS 39

Hình 3.1: Đặc điểm đại thể và vi thể vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus 42

Hình 3.2: Sản phẩm mật ong lên men giàu acid gluconic- định hướng ứng dụng trong mỹ phẩm 56

1 MỞ ĐẦU Mật ong là một chất ngọt tự nhiên do ong sản xuất từ dịch ngọt của cây và dịch tiết của côn trùng Ong lấy các dịch ngọt này và cho thêm các chất do chúng tiết ra, đồng thời làm giảm hàm lượng nước, biến đổi các dịch ngọt thành mật ong để làm thức ăn dự trữ trong tổ ong [6]

Acid gluconic là một thành phần của acid polyhydroxy (PHA) [70] Acid gluconic cũng là thành phần quan trọng trong nhiều loại mỹ phẩm hiện nay Acid này có tác dụng nới lỏng mối liên kết giữa các tế bào da chết, từ đó làm bong chúng ra khỏi bề mặt da (hiện tượng tẩy tế bào chết), thúc đẩy sản xuất collagen nhằm tái tạo và tăng tính đàn hồi, giảm nếp nhăn và giúp làn da có vẻ đẹp tươi trẻ hơn [68] Hiện nay thị trường đang hướng tới các sản phẩm mỹ phẩm từ thiên nhiên và thay thế việc bổ sung acid gluconic vào sản phẩm bằng việc sử dụng các sản phẩm lên men tạo acid gluconic

Mật ong lên men giàu acid gluconic là một sản phẩm mỹ phẩm vừa để tẩy trang (acid gluconic) và dưỡng da khai thác các dưỡng chất có trong mật ong và các sản phẩm hình thành trong quá trình lên men mật ong [79]

Hiện nay, mỹ phẩm dưỡng da từ mật ong lên men đã có mặt tại một số quốc gia trên thế giới như Nhật Bản và Hàn Quốc và được rất nhiều người tin dùng [8] Tuy nhiên, dòng sản phẩm dưỡng da tẩy trang từ mật ong lên men này hiện chưa có ở thị trường Việt Nam cũng như chưa có bài báo nào công bố về các thông số và quá trình lên men mật ong nhằm tạo dòng mỹ phẩm này Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ THĂM DÒ CÁC THÔNG SỐ CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN MẬT ONG GIÀU ACID GLUCONIC – ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM” nhằm các mục tiêu và nội dung sau:

Mục tiêu của đề tài: Đề tài được tiến hành nhằm khảo sát các thông số cho quá trình lên men mật ong với hàm mục tiêu là acid gluconic Từ đó bước đầu tạo sản phẩm mỹ phẩm tẩy trang, dưỡng da giàu acid gluconic

2 Nội dung nghiên cứu:

1 Các thí nghiệm tiền đề về tuyển chọn chủng vi sinh cho quá trình lên men mật ong giàu acid gluconic

2 Khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men mật ong với hàm mục tiêu acid gluconic

3 Khảo sát các biến động trong quá trình lên men trên hệ thống fermenter BioFlo

4 Khảo sát các quá trình sau lên men và bước đầu đánh giá độ ổn định chất lượng của sản phẩm tẩy trang dưỡng da giàu acid gluconic

3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về mật ong

1.1.1 Sản phẩm mật ong 1.1.1.1 Giới thiệu chung

Mật ong là một chất ngọt tự nhiên do con ong sản xuất ra từ các dịch ngọt của cây và dịch côn trùng tiết ra Ong lấy các dịch ngọt này và cho thêm các chất do chúng tiết ra, đồng thời làm giảm hàm lượng nước, biến đổi các dịch ngọt thành mật ong để làm thức ăn dự trữ trong tổ ong [8]

Mật ong là sản phẩm chính của đàn ong Sự đa dạng và phong phú của cây nguồn mật đã tạo nên nhiều loại mật ong với màu sắc và mùi vị đặc trưng khác nhau

Theo TCVN về mật ong tự nhiên, mật ong được phân loại theo nguồn gốc thực vật gồm 3 loại:

+ Mật ong hoa: Tùy theo lượng mật hoa do ong khai thác chủ yếu từ một hay nhiều loại hoa mà ta có thể phân loại mật ong hoa theo nguồn gốc mật hoa như sau:

− Mật đơn hoa (mật ong hoa nhãn, mật ong hoa vải, mật ong hoa táo, mật ong hoa bạch đàn ) là loại mật ong do ong đi thu hoạch chủ yếu từ một loại hoa Các loại mật đơn hoa có màu sắc và mùi vị đặc trưng cho từng loại Để sản xuất mật đơn hoa, người ta phải nuôi ong ở những khu vực chỉ có một loài hoa duy nhất để ong làm mật Trong thực tế, do khó để kiểm soát khu vực thu hoạch của ong, mật đơn hoa thường sẽ có một lượng nhỏ mật từ một số loài hoa khác

− Mật đa hoa (mật ong hoa rừng, mật ong vải nhãn, mật ong chôm chôm- cà phê ) là loại mật ong do ong thu hoạch từ nhiều nguồn hoa như mật hoa rừng tổng hợp, mật ở nơi có nhiều cây ăn quả nở hoa cùng một lúc,…

+ Mật ong dịch lá (mật ong cao su, mật ong đa ) là loại mật ong khai thác từ mật dịch lá, búp non của cây

+ Mật ong hỗn hợp (mật ong cao su – vải, mật ong cà phê – bạch đàn – táo – đay ) là loại mật ong do ong khai thác từ cả mật của dịch lá và mật của hoa

Mật ong giàu năng lượng và có giá trị dinh dưỡng cao 1 kg mật ong cho 3150 –3350 Kcal [5] Vì thế đây là một sản phẩm có thể được sử dụng làm thức ăn bổ

4 dưỡng cho con người, đặc biệt là người già và trẻ em Bên cạnh đó, mật ong cũng có mặt trong nhiều ngành sản xuất như chế biến thực phẩm, y học và sản xuất mỹ phẩm Trong chế biến thực phẩm, người ta dùng mật ong hoặc có thể kết hợp với một loại nguyên liệu khác để làm ra các loại nước giải khát Trong y học, mật ong được dùng để làm thuốc chống ho, viêm phế quản, thuốc điều trị bệnh đường tiêu hóa như viêm dạ dày, ruột, viêm gan… Với xu thế sử dụng các sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc từ tự nhiên, mật ong là một trong những nguyên liệu sáng giá có mặt trong thành phần của nhiều loại mỹ phẩm như kem dưỡng da, sữa dưỡng thể, dầu gội đầu…

1.1.1.2 Tính chất vật lý và thành phần hóa học a Tính chất vật lý

Mật ong là chất lỏng, có dạng từ đặc sánh đến kết tinh Hiện tượng kết tinh của mật ong là do thành phần đường glucose có trong mật ong Ngoài ra, sự kết tinh mật ong còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ, cây nguồn mật, thời gian tinh luyện thành mật ong Mật ong được tinh lọc sớm thì kết tinh ít Hiện tượng kết tinh ở mật ong hoàn toàn không ảnh hưởng tới chất lượng của mật Ở một số nước, người ta còn phải nhập các loại mật ong dễ kết tinh để sản xuất mật ong phết bánh mì Tuy nhiên, mật ong kết tinh khi đóng chai miệng nhỏ thì khó lấy ra, cần phá kết tinh bằng cách ngâm trong nước nóng 60 – 700C hoặc đun cách thủy ở nhiệt độ 40-600C cho đến khi mật tan Lưu ý, không nên đun trực tiếp mật ở nhiệt độ cao trong thời gian dài

Mật ong có màu sắc và mùi vị đặc trưng cho từng loại hoa mà ong lấy mật Như mật hoa bạch đàn có màu nâu đỏ, mùi nếp lên men; mật hoa táo có mùi thơm dịu, mùi vàng chanh; mật hoa bạc hà có mùi thơm hắc… Độ trong của mật ong phụ thuộc vào cây nguồn mật và phương pháp khai thác mật

Để xác định loại và chất lượng mật ong, người ta dựa vào độ tán xạ ánh sáng của mật ong Hàm lượng nước trong mật ong dễ dàng được đo bằng khúc xạ kế Thông thường, chỉ số khúc xạ của mật ong khoảng 1.504 nếu hàm lượng nước là 13% và 1.474 nếu hàm lượng nước là 25% Mật ong cũng có ảnh hưởng đến sự phân cực của ánh sáng Đường fructose làm quay mặt phẳng phân cực về chiều âm trong khi

5 đường glucose quay mặt phẳng phân cực về chiều dương Chiều quay tổng thể có thể được dùng để tính tỉ lệ của hai loại đường trên có trong mật ong [7]

Do có hàm lượng đường hòa tan cao nên mật ong có tính hút ẩm và hút mùi Lượng nước mật ong hấp thụ phụ thuộc vào độ ẩm tương đối của không khí Bên cạnh đó, trong mật ong có sự hiện diện của nấm men Khi lượng nước trong mật ong tăng cao, mật ong lên men, sinh ra khí CO2 làm cho mật ong bị chua, chất lượng mật giảm đáng kể

Không như các chất lỏng khác, mật ong có tính dẫn nhiệt rất kém Tinh thể mật ong tan chảy dẫn đến hiện tượng caramel hóa cục bộ một cách dễ dàng nếu bị đun ở nhiệt độ quá cao hay nhiệt độ không được phân bố đều Tuy nhiên, lại cần mất một khoảng thời gian dài hơn để làm tan chảy tinh thể mật ong ở nhiệt độ nóng chảy Việc lựa chọn nhiệt độ cao để làm tan chảy mật ong tuy có nhanh hơn nhưng lại có ảnh hưởng tới hương vị, mùi thơm hoặc các tính chất khác của mật ong Vì thế, việc làm tan chảy mật ong kết tinh thường được thực hiện ở nhiệt độ thấp trong khoảng thời gian ngắn

Mật ong có tính acid do mật ong có chứa nhiều loại acid hữu cơ Do đó không nên sử dụng đồ đựng mật bằng kim loại vì mật có thể bị biến chứng và gây ngộ độc cho người sử dụng

b Thành phần hóa học Mật ong bao gồm 200 chất khác nhau trong đó carbohydrate là thành phần chính, sau đó là khoáng, protein, vitamin, lipid, acid hữu cơ, amino acid, hợp chất phenolic và các phytochemical khác

Bảng 1.1: Thành phần hóa học chủ yếu trong mật ong (100 g) Thành phần Hàm lượng (g) Biên độ dao động (g)

a Các chỉ tiêu cảm quan Màu sắc và mùi vị của mật ong không ảnh hưởng tới thành phần dinh dưỡng của mật ong Tuy nhiên, nó ảnh hưởng tới giá thành mật ong Nhìn chung, người tiêu dùng ưa chuộng mật ong có màu sáng và mùi thơm dịu hơn

b Các chỉ tiêu hóa lý Chất lượng mật ong được đánh giá thông qua các chỉ tiêu hóa lý chính như tỷ lệ nước, đường khử, đường sucrose, Hydroxymethylfurfural (HMF), chỉ số diastase và các acid…

Bảng 1.2: Các chỉ tiêu hóa lý của mật ong theo TCVN

7 1.1.2 Giá trị mật ong

Việc sử dụng mật ong tự nhiên như thực phẩm và thuốc chữa bệnh đã tồn tại từ thời xa xưa Ngày nay, nhu cầu sử dụng mật ong với tác dụng nâng cao sức khỏe ngày càng tăng Mật ong có giá trị nhiều nhất trong lĩnh vực thực phẩm và y học

1.1.2.1 Trong thực phẩm - Thành phần dinh dưỡng của mật ong: Thành phần chủ yếu của mật ong là các loại đường và nước (bảng 1.3) Ngoài ra, nó còn chứa nhiều loại vitamin và khoáng chất, bao gồm các vitamin B (bảng 1.4) Các thành phần khác của mật ong gồm acid amin, inhibine kháng sinh phong phú, protein, chất chống oxy hóa phenol và vi chất dinh dưỡng [7] Các chất đường trong mật ong ngọt hơn và cung cấp nhiều năng lượng hơn so với các chất làm ngọt nhân tạo [7 - 9] Fructose là loại đường chiếm nhiều nhất trong mật ong (bảng 1.3)

Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng của mật ong

Khoảng Trung bình Khoảng Trung bình

 Monosaccharide Fructose 30 – 45 38.2 28 – 40 31.8 Glucose 24 – 40 31.3 19 – 32 26.1  Disaccharide

Sucrose 0.1 – 4.8 0.7 0.1 – 4.7 0.5 Các loại khác 2.0 – 8.0 5.0 1.0 – 6.0 4.0  Trisaccharide

Erlose 0.5 – 6.0 0.8 0.1 – 6.0 0.1 Melezitose < 0.1 0.3 – 22 4.0 Các loại khác 0.5 – 1.0 0.5 0.1 – 6.0 3.0 Khoáng chất 0.1 – 0.5 0.2 0.6 – 2.0 0.9

8 Amino acid, protein 0.2 – 0.4 0.3 0.4 – 0.7 0.6

Giá trị pH 3.2 – 4.5 3.9 4.5 – 6.5 5.2

Tính theo g/100g mật ong [7, 8] Bảng 1.4: Một số khoáng chất, vitamin và nguyên tố hóa học trong mật ong Khoáng chất Hàm lượng Vitamin Hàm lượng Natri (Na) 1.6-17 Thiamin (B1) 0.00-0.01 Canxi (Ca) 3-31 Riboflavin (B2) 0.01-0.02 Kali (K) 40-3500 Niacin (B3) 0.10-0.20 Magie (Mg) 0.7-13 Acid pantothenic (B5) 0.02-0.11 Phốt pho (P) 2-15 Pyridoxine (B6) 0.01-0.32 Selen (Se) 0.002-0.01 Acid folic (B9) 0.002-0.01 Đồng (Cu) 0.02-0.6 Acid ascorbic (C) 2.2-2.5 Sắt (Fe) 0.03-4 Phyllochinon (K) 0.025 Mangan (Mn) 0.02-2

Crom (Cr) 0.01-0.3 Kẽm (Zn) 0.05-2

Nguyên tố Hàm lượng Nguyên tố Hàm lượng Nhôm (Al) 0.01-2.4 Chì (Pb) 0.001-0.03 Asen (As) 0.014-0.026 Lithium (Li) 0.225-1.56 Bari (Ba) 0.01-0.08 Molybdenum (Mo) 0-0.004 Boron (B) 0.05-0.3 Nickel (Ni) 0-0.051 Brôm (Br) 0.4-1.3 Rubidium (Rb) 0.040-3.5 Cadmium (Cd) 0-0.001 Silicon (Si) 0.05-24 Clo (Cl) 0.4-56 Strontium (Sr) 0.04-0.35 Cobalt (Co) 0.1-0,35 Sulphur (S) 0.7-26 Fluoride (F) 0.4-1.34 Vanadi (V) 0-0.013 Iodide (I) 10-100 Zirconium (Zr) 0.05-0.08

Tính theo mg/100g mật ong [8], [12 - 16]

9 Những chất này có tầm quan trọng về dinh dưỡng và sức khỏe Một số vitamin được tìm thấy trong mật ong bao gồm acid ascorbic, acid pantothenic, niacin và riboflavin; cùng với các khoáng chất như canxi, đồng, sắt, magiê, mangan, phốt pho, kali và kẽm Danh mục chi tiết các loại vitamin, khoáng chất, vi chất dinh dưỡng khác và các nguyên tố được tìm thấy trong mật ong được đưa ra trong bảng 1.4

- Nguồn chất chống oxy hóa: Sự hiện diện của các gốc tự do và gốc tự do oxy hóa (reactive oxygen species, ROS) là nguyên nhân gây ra rối loạn chức năng tế bào, sinh bệnh học của chuyển hóa và bệnh tim mạch cũng như lão hóa Việc sử dụng các loại thực phẩm và các chất chống oxy hóa có thể bảo vệ cơ thể chống lại những thay đổi bệnh lý, từ đó ngăn ngừa sự phát sinh bệnh các bệnh trên và các bệnh mãn tính khác Các nghiên cứu của Al-Wailli và Schramm cùng cộng sự (2003) đã chỉ ra rằng mật ong có chứa một số hợp chất quan trọng, bao gồm các chất chống oxy hóa [19, 20] Thành phần định tính và định lượng của mật ong (bao gồm cả các chất chống oxy hóa thành phần và các phytochemical khác) phản ánh nguồn hoa phong phú cũng như các loại mật ong khác nhau Màu sắc của mật ong cũng ảnh hưởng đến chất chống oxy hóa của nó, cụ thể là mật ong có màu tối hơn thì có hàm lượng chất chống oxy hóa cao hơn so với mật ong sáng màu [21] Trong phân tích về các thành phần phytochemical của mật ong đơn hoa Cuba, Alvarez-Suarez và đồng nghiệp (2010) kết luận rằng mật ong Cuba chứa phenolic quan trọng, nồng độ chất flavonoid và carotenoid có khả năng chống oxy hóa cao [22] Schramm và cộng sự (2003) cũng kết luận con người có thể được bảo vệ khỏi các tác hại của các gốc tự do và ROS Việc bảo vệ thông qua sự hấp thụ chất chống oxy hóa từ thực phẩm giàu chất chống oxy hóa, điển hình như mật ong Trong các báo cáo nghiên cứu trên có hai phương pháp điều trị mật ong kiều mạch được dùng cho 37 người lớn khỏe mạnh với tỷ lệ 1.5 g/ kg trọng lượng cơ thể, với xi-rô ngô như kiểm soát, kết quả cho thấy tổng plasma phenolic và plasma chống oxy hóa tăng lên (p <0.05) Do đó, giả định được đưa ra rằng chất phenolic chống oxy hóa từ mật ong đã qua quá trình chế biến có ý nghĩa sinh học đã được củng cố và ủng hộ, đồng thời mật ong làm tăng hoạt động chống oxy hóa của huyết tương Do đó, các nhà nghiên cứu trên ủng hộ sự thay thế mật ong trong một số thực phẩm như chất

10 làm ngọt truyền thống nhằm tăng cường hệ thống bảo vệ chống oxy hóa ở người lớn khỏe mạnh [18]

1.1.2.2 Trong y học - Huyết học và miễn dịch Mật ong đã được tìm thấy là có lợi cho những người bị thiếu máu Ajibola và cộng sự (2007) đã thực hiện nghiên cứu ghi nhận cải thiện nồng độ hemoglobin (thành phần sắt có trong mật ong đã đóng một vai trò quan trọng trong việc này), tăng số lượng hồng cầu và hematocrit ở những người ăn mật ong [9] Trong một thí nghiệm khác, Chepulis (2007) cũng ghi nhận sự tăng huyết học và phản ứng miễn dịch ở chuột được cho ăn 10% ngọt mật ong chế độ ăn uống bổ sung [23] Các tác giả lưu ý số tế bào lympho và thực bào bạch cầu trung tính ở chuột ăn mật ong là cao hơn mẫu đối chứng Điều này phù hợp với nghiên cứu trước đó đã kết luận prebiotic có thể tăng cường chức năng miễn dịch [24, 25] và mật ong được biết đến có chứa các prebiotic, oligosaccharide [9, 26]

- Sức khỏe răng miệng Sử dụng mật ong có thể cải thiện sức khỏe răng miệng Molan (2001) cho rằng mật ong với mức độ hoạt động kháng khuẩn có khả năng làm giảm nguy cơ sâu răng [27] Ngoài tác dụng bảo vệ răng khỏi sâu răng của mật ong, Molan và cộng sự (2004) cũng cho thấy sự ảnh hưởng của mật ong đối với sức khỏe răng miệng trong việc ngăn ngừa mảng bám răng, viêm lợi, chu [27] Các nghiên cứu khác của Decaix (1976), Steinberg và cộng sự (1996), Sela và cộng sự (1998), Edgar và cộng sự (1974) cũng cho thấy mật ong không có cariogenic hoặc ít hơn rất nhiều so với sucrose [28-31], do đó mật ong không gây sâu răng Kết quả nghiên cứu của Grobler và cộng sự (1994) trên kính hiển vi điện tử cho thấy mật ong không gây xói mòn men răng hay bất kì sự suy giảm cấu trúc nào của men răng Kết quả này được đưa ra sau nửa giờ sử dụng mật ong Trong khi đó, việc sử dụng các loại nước ép trái cây gây xói mòn men răng chỉ sau một thời gian rất ngắn sau sử dụng Lời giải thích cho việc ít cariogenic của mật ong là do trong mật ong có chứa các thành phần như canxi, florua, phốt pho và các thành phần khác Tóm lại, có thể kết luận rằng mật ong có tác dụng bảo vệ răng miệng

11 - Hệ tiêu hóa

Mật ong hiện đang được ủng hộ trong việc sử dụng để phòng, chữa bệnh điều trị một số rối loạn tiêu hóa như loét, viêm dạ dày và viêm dạ dày ruột [33-40] Tiềm năng của mật ong trong việc ức chế hoạt động của Helicobacter pylori - nguyên nhân gây viêm dạ dày và loét dạ dày tá tràng đã được ghi nhận [41-43] Ở thí nghiệm trên chuột được thực hiện bởi Ali (1995), Gharzouli và cộng sự (2001), mật ong có tác dụng bảo vệ hệ tiêu hóa chống lại các tổn thương trong dạ dày do rượu, amoniac, aspirin và indomethacin [33-38] Hai cơ chế được đề xuất để giải thích cho tác dụng bảo vệ này của mật ong Thứ nhất là do các tính chất chống oxy hóa của mật ong Mật ong đã được tìm thấy có tác dụng duy trì hoặc gia tăng hàm lượng các chất phi protein sulfhydyl (như glutathione) trong mô dạ dày bị loét [33-36] Quan sát tương tự đã được thực hiện khi mật ong Anzer được sử dụng trước khi điều trị nhằm ngăn chặn N-ethylmaleimide (NEM)- nguyên nhân gây tổn thương gan ở chuột [44] Những phát hiện này hàm ý rằng sự suy giảm nồng độ glutathione là nguyên nhân chính gây tổn thương gan do NEM, và tác động bảo vệ gan của mật ong Anzer có thể được trung gian qua các quá trình nhạy cảm sulfhydryl Các tác giả kết luận rằng mật ong có đặc tính chống oxy hóa

Cơ chế thứ hai là mật ong kích thích các dây thần kinh cảm giác trong dạ dày để đáp ứng với capsaicin [33, 36] Cơ chế này liên quan đến việc giảm chỉ số loét, tính thấm thành mạch và các hoạt động cơ bắp của dạ dày [40] Baltuskevicius và cộng sự (2001) cũng đã giải thích hiện tượng này bằng cách nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng việc sử dụng mật ong bồ công anh có tác dụng giảm acid dạ dày hơn 50% [45] Mật ong còn có khả năng chữa bệnh tiêu chảy do vi khuẩn gây ra cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Mật ong cũng đã được tìm thấy có lợi trong việc duy trì lượng đường trong máu Trong mật ong, có rất ít nước có sẵn để thúc đẩy sự tăng trưởng của vi khuẩn và nấm men Ngoài ra, nồng độ acid tự nhiên của mật ong ức chế một số tác nhân gây bệnh vì nó có một lượng hydrogen peroxide và các chất khác góp phần vào tác dụng kháng khuẩn của nó [11]

- Nhãn khoa

12 Việc sử dụng mật ong để điều trị các bệnh về mắt cũng đã được công nhận Người cổ đại sử dụng mật ong từ Attica [47] và mật ong sen Ấn Độ [48] như một loại thuốc chữa bệnh cho mắt Người dân địa phương Ấn Độ vẫn tiếp tục sử dụng mật ong như thuốc nhỏ mắt để chữa các bệnh về mắt cho đến ngày nay [49-51] Người dân Mali sử dụng mật ong như phương pháp trị liệu chống bệnh sởi Mật ong được sử dụng để ngăn chặn tác động gây sẹo giác mạc xảy ra như một biến chứng của nhiễm trùng bệnh sởi [52] Đây là một thành công lớn được báo cáo từ việc ứng dụng mật ong trong các thử nghiệm lâm sàng trên 102 bệnh nhân bị rối loạn về mắt khác nhau như viêm bờ mi, viêm kết mạc và viêm giác mạc - hiện nay vẫn không đáp ứng với điều trị thông thường [53] Sau khi ứng dụng mật ong cho mí mắt dưới như thuốc mỡ tra mắt, kết quả cho thấy 85% các trường hợp bệnh nhân được cải thiện rõ rệt và không có sự suy giảm nào trong 15% trường hợp còn lại Tuy nhiên, việc đặt mật ong vào mắt sẽ gây ra cảm giác châm chích thoáng qua và đỏ mắt, nhưng điều này không đủ điều kiện để dừng việc điều trị cho 102 bệnh nhân trên Việc sử dụng mật ong trong lĩnh vực nhãn khoa ở châu Á và Đông Âu cũng đã được báo cáo bởi Molan (1999) [10] Tại trường Cao đẳng Y tế Ấn Độ, một bác sĩ phẫu thuật nhãn khoa đã điều trị thành công vi khuẩn gây viêm loét giác mạc bằng việc sử dụng mật ong [54] Một số tài liệu đề cập đến việc sử dụng mật ong Meier để điều trị mắt xả mủ [54] Tác giả người Nga Mozherenkov và cộng sự (1984) đã quan sát tính kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt động chống viêm của mật ong trong việc điều trị bỏng mắt gây ra bởi các tác nhân hóa học và nhiệt, cũng như viêm kết mạc, và nhiễm trùng giác mạc [55] Việc điều trị được thực hiện bằng cách bôi trực tiếp mật ong không pha loãng lên mắt hoặc pha loãng mật ong với nước với tỷ lệ khoảng 50% mà không làm giảm hiệu lực [10]

- Sự trao đổi chất và tim mạch Mật ong đã được chứng minh cải thiện tình trạng các yếu tố rủi ro của trao đổi chất và bệnh tim mạch ở bệnh nhân Không giống như các loại đường tinh chế, bệnh nhân tiểu đường có thể ăn đường fructose một cách an toàn, không gây nguy hiểm Theo Costa-Neto (1999) báo cáo của Santos và Antonini, bộ lạc Pankararé của Brazil thậm chí còn sử dụng mật ong để điều trị bệnh đái tháo đường, viêm phế quản, bệnh

13 do nấm, đau cổ họng và các bệnh khác [56,57] Một thí nghiệm gần đây đã được thực hiện Theo đó, những con chuột đực và cái được cho ăn bổ sung với mật ong hoặc đường (golden syrup, GS) trong 12 tuần từ 7 ngày tuổi để so sánh phản ứng trao đổi chất của chúng, và xem xét liệu mật ong có là chất bảo vệ chống lại hội chứng chuyển hóa (metabolic syndrome, MetS) MetS là một loại bệnh với biểu hiện béo phì vùng bụng, tăng đường huyết, tăng huyết áp và rối loạn mỡ máu, do đó làm tăng khả năng mắc bệnh tiểu đường, thận và tim [58,59] Ở chuột đực, GS làm tăng lên đáng kể nồng độ trong máu của chất chuyển hóa (glucose và triglycerides, TGS) (p <0.05); dẫn đến tăng béo phì nội tạng (p <0.001), tăng cholesterol máu, tăng insulin máu, gan to và gan nhiễm mỡ Các bệnh tim mạch và các yếu tố gây bệnh chuyển hóa không tồn tại ở những con chuột được ăn mật ong trong thử nghiệm này Nghiên cứu đã kết luận mật ong có tác dụng bảo vệ tim mạch và chống Mets [kết quả chưa được công bố] Kết quả này cũng khẳng định các kết luận rút ra từ nghiên cứu trước đó rằng việc dùng mật ong để thay thế carbohydrate tinh chế là có lợi Nghiên cứu trước đó từ các phòng thí nghiệm khác và thử nghiệm lâm sàng tiếp tục khẳng định sự trao đổi chất và ý nghĩa sức khỏe đối với tim mạch của việc ăn mật ong bằng cách ghi lại các kết quả khả quan như sau: giảm nồng độ huyết tương của các yếu tố nguy cơ bao gồm cholesterol toàn phần [12,13]; cholesterol có lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) [12,13,60]; triglycerides (TGs) [12,17]; glucose của bệnh nhân bình thường và bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường [12,13]; protein phản ứng C (C-reactive protein, CRP) [12,13]; trong khi các chỉ số sức khỏe tăng cao trong máu là lipoprotein tỷ trọng cao (HDL cholesterol) [12,13,18] Ngoài ra, những nghiên cứu khác ghi nhận hàm lượng chất chống oxy hóa trong huyết tương ở chuột được ăn mật ong cao hơn so với chuột không ăn mật ong, đồng thời nguy cơ mắc bệnh tim mạch ở chuột được ăn mật ong giảm đáng kể so với chuột không ăn mật ong

- Hóa trị liệu và điều trị vết thương Mật ong có tính sát trùng, phù hợp để điều trị bỏng, vết thương phẫu thuật bị nhiễm trùng và loét Glenys Round - chuyên gia về ung thư và Julie Betts tại Bệnh viện Waikato, New Zealand (2005) đã báo cáo kết quả tuyệt vời của phương pháp điều trị cho các bệnh nhân với vết thương do nấm, loét chân và lở loét bằng cách sử

14 dụng chỉ số UMF (Unique Manuka Factor) để xác định các hoạt chất kháng khuẩn có trong mật ong manuka [61] Theo các chuyên gia, việc áp dụng các băng mật ong đã được sử dụng ở những bệnh nhân (bao gồm cả những người bị ung thư qua da), sau thất bại của việc chữa bệnh từ phương pháp điều trị thông thường bao gồm xạ trị Ajibola (1995) đã điều trị thành công vết thương phẫu thuật thực nghiệm ở dê lùn Nigeria với mật ong hoa Ông quan sát thấy có sự tạo biểu mô và sự co bóp tăng đáng kể của các vết thương được điều trị bằng mật ong so với những vết thương không được điều trị bằng mật ong Một số nghiên cứu khác cũng đã sử dụng mật ong với mục đích tương tự tại các trường hợp phẫu thuật cho con người và động vật thí nghiệm [62-67]

- Tính kháng khuẩn Mật ong tự nhiên là một kháng sinh phổ rộng lớn rất mạnh mà hầu hết các vi khuẩn đa kháng thuốc được tìm thấy nhạy cảm Alvarez-Suarez và cộng sự (2010) khẳng định điều này trong báo cáo của họ và kết luận tính kháng khuẩn hiện diện trong tất cả các loại mật ong [68] Các nghiên cứu cho thấy sự hình thành hydrogen peroxide có thể đóng một vai trò quan trọng như các sản phẩm tự nhiên kháng khuẩn để giảm thiểu các tác động xâm lấn của bệnh nhiễm khuẩn trong mật ong đơn hoa Cuba Mặc dù các loài mật ong Cuba khác nhau về giá trị thành phần hóa học, nhưng tất cả đều biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn chống cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm bao gồm Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Escherichia coli [68]

1.2 Các sản phẩm từ mật ong lên men 1.2.1 Rượu mật ong (Mead)

a Giới thiệu chung Mead là một loại thức uống có cồn truyền thống với nồng độ cồn từ 8-18% theo thể tích và được sản xuất từ việc lên men hỗn hợp mật ong hòa tan Theo công thức truyền thống , Mead đơn thuần chỉ là hỗn hợp mật ong với nước lên men theo các tỉ lệ 1:0.5; 1:1; 1:2; 1:3 Với mỗi tỷ lệ khác nhau sẽ thu được một loại sản phẩm khác nhau Theo thời gian, người ta thay nước thành các loại nước ép trái cây và cho thêm vào các gia vị, thảo mộc Các loại Mead phổ biến như: Metheglin (có bổ sung

15 gia vị hoặc thảo mộc), Melomel (Mead có chứa nước ép trái cây), Cyser (Mead với nước ép táo), Pyment (Mead với nước ép nho)…

Trong điều kiện phát triển ngành công nghiệp thức uống có cồn ngày nay, Mead là một lựa chọn tiềm năng để thương mại hóa, đem đến nhiều lựa chọn hơn cho người tiêu dùng cũng như đem lại nguồn thu nhập lớn đối với ngành nghề nuôi ong Mặc dù là loại thức uống có cồn lâu đời nhất trên thế giới, Mead vẫn còn được sản xuất chủ yếu bằng kinh nghiệm Thời gian lên men còn dài cũng như chất lượng sản phẩm thu được vẫn chưa đồng bộ Vì vậy, muốn thu được nguồn lợi từ Mead, mối quan tâm chính là việc rút ngắn thời gian lên men bằng cách lựa chọn chủng nấm men phù hợp và tối ưu các điều kiện lên men

Hình 1.1: Sản phẩm Mead b Hệ vi sinh vật lên men

Tương tự như sản xuất rượu, bia, champagne, nấm men được sử dụng trong sản xuất Mead thường là chủng Saccharomyces cerevisiae Chúng sẽ chuyển hóa đường (như glucose và fructose) tạo thành ethanol (C2H5OH), carbon dioxide (CO2) và một số sản phẩm phụ khác Nấm men được sử dụng có thể có nguồn gốc từ tự nhiên như C113 (Navrátil et al., 2001), BRL-7 (Qureshi and Tamhane, 1986) và UCD522 (Mendes – Ferreira et al., 2010) hoặc các chủng nấm men thương mại như Premier cru (Pereira et al., 2009) và ENSIS LE5 (Roldán et al., 2011) Việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên trong việc sản xuất các loại thức uống có cồn cũng có nhược điểm đó là chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát được chất lượng giống vi sinh vật ban đầu khi đưa vào lên men Ở những nơi sản xuất Mead theo

16 phương thức truyền thống, người ta vẫn dùng vi sinh vật tự nhiên để tiến hành lên men Do đó, chất lượng sản phẩm của họ phần lớn phụ thuộc vào kinh nghiệm

Điều kiện lên men: do việc sản xuất Mead đòi hỏi nồng độ đường cao, việc lên men có khuynh hướng chậm và đòi hỏi chủng nấm men, pH, nhiệt độ và các điều kiện tăng trưởng khác phải là tối ưu

1.2.2 Mỹ phẩm chăm sóc da 1.2.2.1 Giới thiệu chung Mật ong là một sản phẩm không chỉ được dùng làm thực phẩm mà còn được dùng làm mỹ phẩm chăm sóc da vì trong thành phần của mật ong có chứa các chất khoáng, vitamin và các acid hữu cơ cần thiết cho cơ thể Với xu hướng sử dụng các loại mỹ phẩm không độc hại, gần gũi với thiên nhiên, mật ong lên men được xem là một sản phẩm tiềm năng và được mọi người tin dùng

Acid gluconic là một thành phần của acid polyhydroxy (PHA), có mặt trong nhiều loại mỹ phẩm, có tác dụng nới lỏng mối liên kết giữa các tế bào chết, từ đó làm bong chúng ra khỏi bề mặt da gọi là hiện tượng tẩy tế bào chết [72] Acid gluconic chiếm một hàm lượng lớn trong mật ong và đặc biệt không gây kích ứng da do được sản xuất từ tự nhiên Tuy nhiên, do yêu cầu cao về kĩ thuật nên các sản phẩm mỹ phẩm từ mật ong lên men vẫn chưa được phổ biến với người tiêu dùng

Hình 1.2: Mỹ phẩm chăm sóc da từ mật ong

17 1.2.2.2 Acid polyhydroxy (PHA) PHA – acid polyhydroxy là thế hệ mới của acid alphahydroxy (AHA) PHA là những acid hữu cơ chứa hai hoặc nhiều nhóm hydroxyl trong phân tử Các nhóm hydroxyl và carboxyl được gắn vào nguyên tử cacbon của một vòng no Tất cả các nhóm hydroxyl trong PHA là trung tính, chỉ có nhóm cacboxyl cho tính acid Mặc dù các nhóm hydroxyl có thể gắn liền với một số vị trí của chuỗi carbon, tuy nhiên cả AHA và PHA phải có ít nhất một nhóm hydroxyl được gắn vào vị trí alpha [72]

Hình 1.3: A, Công thức cấu tạo của glycolic acid (AHA); B, công thức cấu tạo

của gluconic acid (PHA) [70, 72] Nhiều PHA là chất chuyển hóa nội sinh hoặc các sản phẩm trung gian từ quá trình chuyển hóa carbohydrate trong các mô cơ thể Cả hai acid galactonic và galactonolactone có nguồn gốc từ galactose, đó là một thành phần quan trọng của glycosaminoglycan Acid gluconic và glucono delta-lacton là những chất chuyển hóa quan trọng hình thành trong con đường pentose phosphate từ glucose trong sinh tổng hợp của ribose cho acid ribonucleic Glucono delta-lacton đã được nghiên cứu rộng rãi và thương mại hóa để trở thành thành phần chăm sóc da trong các PHA

Ngoài những lợi ích tương tự AHA như khả năng chống lão hóa và làm mịn da, PHA còn tăng cường chức năng bảo vệ lớp sừng và dưỡng ẩm với tính chất giữ độ ẩm Điều này làm tăng cường khả năng tương thích da và sử dụng lý tưởng cho hầu hết các loại da, kể cả da nhạy cảm và da khô PHA cũng có chức năng bảo vệ da nhờ vào đặc tính chống oxy hóa của nó PHA như glucono delta-lacton hoặc acid lactobionic có thể được sử dụng kết hợp với các sản phẩm khác, các thành phần hoặc các phương pháp như laser và microdermabrasion nhằm cung cấp lợi ích bổ sung để điều trị hoặc tăng cường hiệu quả điều trị cho làn da

18 1.2.2.3 Cơ chế tác động của PHA lên da Càng lớn tuổi, đặc biệt khi bước qua tuổi 30, chu trình thay da tự nhiên sẽ chậm hơn khiến cho quá trình lão hóa diễn ra nhanh hơn Do đó những tế bào chết còn sót lại sẽ làm cho làn da bị xỉn màu, bong tróc và khô cứng hơn bình thường PHA được chứng minh làm giảm liên kết giữa các tế bào trên bề mặt da kích thích tẩy da chết, từ đó làm lớp bề mặt da trở nên tươi trẻ hơn nhờ sự phân bố bình thường của sắc tố da (melanin) giúp làm sáng da [72]

1.3 Mật ong lên men và định hướng ứng dụng trong mỹ phẩm 1.3.1 Acid gluconic

Acid gluconic là một acid hữu cơ yếu, được phát hiện vào năm 1870 bởi Hlasiwetz và Habermann Acid gluconic có mặt trong các loại quả, rượu vang, trà Kombucha và đặc biệt là mật ong Ngày nay, acid gluconic và các sản phẩm muối gluconate đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghệ hóa học, thực phẩm, dược phẩm, dệt, luyện kim, thuộc da, vật liệu xây dựng Ngoài việc tổng hợp bằng con đường hóa học, sản xuất acid gluconic bằng con đường vi sinh đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều thập kỷ qua, trong đó quá trình lên men thu nhận acid gluconic bằng A niger được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất trong sản xuất công nghiệp

Hình 1.4: Công thức cấu trúc của acid gluconic [70]

19 Bảng 1.5: Các đặc tính hóa lý của acid gluconic Đặc tính tự nhiên Acid hữu cơ yếu, không ăn mòn, không mùi,

không độc, không bay hơi, ít kích thích da Kích thước phân tử 196.16

Độ tan Có khả năng hòa tan trong nước Độ chua (nếu xem độ chua của acid

citric là 100)

29-35

[70] Acid gluconic được hình thành bởi phản ứng dehydrogen glucose nhờ enzyme glucose oxidase Đầu tiên, gốc –CHO ở C-1 của β-D-glucose (C6H12O6) bị oxi hóa tạo thành glucono-δ-lactone (C6H10O6) và hydrogen peroxide (H2O2) Sau đó, glucono-δ-lactone bị thủy phân tạo thành gluconic acid dưới sự tác động của enzyme thủy phân lactone hoặc tự phát Trong khi đó, hydrogen peroxide phân ly thành nước và khí oxi dưới tác động của enzyme peroxidase Acid gluconic là sản phẩm trung gian trong con đường gluconate

Một số ứng dụng của acid gluconic, glucono-δ-lactone và các muối gluconate: - Acid gluconic: Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, acid gluconic hạn chế sự đông tụ các sản phẩm từ sữa; là chất tẩy rửa các lon chứa bằng nhôm; là tiền chất quan trọng để tổng hợp vitamin C và là thành phần trong các loại mỹ phẩm chăm sóc da

20 - Glucono-δ-lactone: Là phụ gia trong bột nướng bánh, chất làm chậm chua trong chế biến sản phẩm từ thịt; chất làm đông protein đậu nành trong sản xuất đậu phụ; làm đông phô mát và giúp cải thiện độ ổn nhiệt của sữa

- Natri gluconate: được bổ sung vào xi măng, sử dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy

- Calcium gluconate: là chất dinh dưỡng cho động vật - Sắt gluconate: chữa trị bệnh thiếu máu; làm phân bón cho cây cảnh

Hình 1.5 : Con đường Gluconate [70]

21 1.3.2 Hệ vi sinh vật và quá trình sinh tổng hợp acid gluconic 1.3.2.1 Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp acid gluconic

Việc sản xuất acid gluconic công nghiệp bắt đầu vào năm 1923, sau đó Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ đã đưa ra công nghệ sản xuất natri gluconate theo phương pháp bán liên tục sử dụng chủng A niger NRRL 67 Nhiều loại nấm mốc thuộc chi Pencillium, Aspergillus, vi khuẩn và nấm men cũng có khả năng sinh acid gluconic trên môi trường có glucose Tuy nhiên, việc sản xuất ở quy mô công nghiệp thường chỉ được thực hiện với A niger do lượng acid sinh ra hiệu quả

a Sinh tổng hợp acid gluconic từ nấm mốc Aspergillus niger Sự sinh tổng hợp acid gluconic bởi A niger được trình bày trong hình dưới đây:

Hình 1.6: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành acid gluconic bởi A niger [70] Khi có mặt ion Ca2+, A niger sinh tổng hợp đồng thời glucose oxidase và catalase và làm thay đổi con đường chuyển hóa glucose từ quá trình đường phân thành quá trình oxi hóa trực tiếp dưới sự xúc tác của enzyme Tại đây, glucose oxidase có chứa hai gốc FAD ( Flavin Adenine Dinucleotide) sẽ loại bỏ hai nguyên tử hydro từ glucose để tạo ra FADH2 và glucono-δ-lactone FADH2 tiếp tục phản ứng với O2 tạo ra H2O2 và sản phẩm này dưới sự xúc tác của catalase sẽ sản sinh ra nước và O2 Ở A.niger, cả hai enzyme đều là glucose oxidase và catalase đều là enzyme nội bào

Bên cạnh hai enzyme kể trên, A niger còn sản sinh ra lactonase và mutarotase Trong quá trình sản xuất, sự tích tụ glucono-δ-lactone có thể làm ảnh hưởng xấu đến glucose oxidase và việc sản xuất acid gluconic trở nên gián đoạn Việc hình thành lactonase sẽ góp phần thủy phân glucono-δ-lactone nhanh hơn Tuy nhiên, phản ứng này đòi hỏi pH gần như trung tính, vì thế ta có thể khắc phục bằng cách bổ sung thêm

22 CaCO3 hoặc NaOH Bên cạnh đó, sự hình thành enzyme mutarotase nhằm để thúc đẩy tốc độ phản ứng

Hai thông số ảnh hưởng tới việc sản xuất acid gluconic là sự hiện diện của O2

và pH trong môi trường nuôi cấy O2 là một trong những chất nền trong phản ứng oxi hóa glucose do glucose oxidase sử dụng phân tử O2 nhằm biến đổi sinh học glucose Trong sản xuất acid gluconic, nồng độ O2 hòa tan có nhu cầu cao O2 thông thường được lấy từ không khí bên ngoài môi trường, trong một số nghiên cứu người ta sử dụng O2 tinh khiết áp suất cao Sakurai và cộng sự (1989) đã cung cấp O2 áp suất cao ở xấp xỉ 6 bar và duy trì nồng độ O2 hòa tan ở 150 ppm trong nuôi cấy cố định hệ nấm sợi A niger Họ đã nhận ra rằng việc sử dụng O2 áp suất cao thu được acid gluconic có chất lượng cao hơn so với việc nuôi cấy ở điều kiện thông thường pH là yếu tố thứ hai có ảnh hưởng tới sự sản xuất acid gluconic Dãy pH cho sự tổng hợp nên acid gluconic ở nấm khoảng 4.5-7.0 Trong đó, pH 5.5 đối với A niger là tối ưu Nghiên cứu của Franke (1963) cho thấy hoạt tính của enzyme glucose oxidase đạt 5% và 35% tại pH lần lượt là 2.0 và 3.0 Hoạt tính đạt 100% tại pH 5.6

b Sinh tổng hợp acid gluconic từ nấm men Nhiều nghiên cứu đă được tiến hành, sử dụng Aureobasidium pullulans để sản xuất acid gluconic Các yếu tố được nghiên cứu phục vụ cho quá trình lên men liên tục gồm: pH, O2, nhiệt độ, thành phần môi trường, độ bão hòa không khí…Độ chuyển hóa glucose cao nhất 94% và sản phẩm đạt 87.1% tại pH tối ưu là 6.5 Tại pH 4.5 và 5.0 thu được sản phẩm ít, tương ứng là 67.8% và 20.7% Nhiệt độ thích hợp để lên men thu acid gluconic ở nấm men trong khoảng 29-310C Nếu tăng nhiệt độ lên 10C (cụ thể là 320C) thì sinh khối và năng suất sẽ giảm đáng kể [8]

c Sinh tổng hợp acid gluconic từ vi khuẩn Vi khuẩn acetic và Pseudomonas savastanoi là những vi khuẩn đầu tiên được ứng dụng vào quá trình sinh tổng hợp acid gluconic Khác với nấm mốc, trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn tiết ra glucose dehydrogenase nhằm oxi hóa glucose thành acid gluconic Sau đó, sản phẩm tiếp tục bị oxy hóa thành acid 2-ketogluconate bởi 2-ketogluconate dehydrogenase Acid gluconic sinh ra và tham gia vào con đường

23 chuyển hóa pentose phosphate Vì thế, khi nồng độ đường glucose cao hơn 15 mM, con đường pentose phosphate sẽ chiếm ưu thế và dẫn đến lượng acid gluconic giảm

Gluconobacter oxydans là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, chuyển hóa glucose thành acid gluconic bằng hai con đường khác nhau Thứ nhất là con đường pentose phosphate, thực hiện phản ứng phosphoryl hóa rồi mới thực hiện phản ứng oxi hóa Con đường thứ hai là con đường oxi hóa trực tiếp glucose như đã trình bày ở trên

Khả năng của Pseudomonas và Gluconobacter trong việc sản xuất gluconolactone và acid gluconic đă được khai thác và sản xuất thương mại lactone

Hình 1.7: Con đường sinh tổng hợp acid gluconic từ glucose bởi vi khuẩn

Pseudomonas và vi khuẩn acetic 1.3.2.2 Giống vi khuẩn Gluconacetobacter và quá trình oxy hóa D-glucose tạo acid gluconic

a Giới thiệu chung về vi khuẩn Gluconacetobacter Phân loại Gluconacetobacter

Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales Bộ phụ: Pseudomonadiace Họ: Acetobacteraceae Giống: Gluconacetobacter [76]

Họ Acetobacteraceae bao gồm các giống Gluconacetobacter, Acidomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Asaia và Kozakia Trong đó, giống Gluconacetobacter

24 và Acetobacter có khả năng tổng hợp cellulose hiệu quả nhất Vì thế, đây là hai giống tiêu biểu được ứng dụng rộng rãi nhất trong các chủng vi khuẩn acetic

Vi khuẩn Gluconacetobacter có thể được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên Đặc biệt, vi khuẩn này dễ dàng phân lập từ giấm, thạch dừa, trà kombucha do chúng đóng vai trò chính trong các hệ lên men này

Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, kích thước khoảng 0.3 – 0.6 x 1.0 – 8.0 µm thay đổi tùy loài Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên tăng trường ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng cellulose, váng này có bản chất là hemicellulose nên bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric

Khi phát triển trên môi trường cực đoan, Gluconacetobacter biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính đáng kể

Nhóm vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng tốt ở nồng độ pH thấp Trong quá trình hoạt động và biến dưỡng, chúng sinh ra acid acetic, nồng độ acid acetic sinh ra có thể trên 4.5% Tuy nhiên, khi acid acetic sinh ra vượt quá mức giới hạn cho phép sẽ gây ức chế lại chính hoạt động của Gluconacetobacter

Gluconacetobacter có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy, trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và tâm có màu sẫm hơn, rìa mép khuẩn lạc nhẵn Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, Gluconacetobacter phát triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy Trong môi trường lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp váng đục trên bề mặt, sau 36 – 48 giờ sẽ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày [77]

Đặc điểm sinh lý Gluconacetobacter oxy hóa ethanol thành acid acetic, acid acetic sẽ tiếp tục bị oxy hóa thành CO2 và nước Chúng có khả năng tổng hợp cellulose, cho phản ứng

25 catalase dương tính nên tạo bọt khí trong dung dịch lên men Hầu hết Gluconacetobacter không tăng trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu Chúng có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic và acid glucuronic, chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetol [77]

Đặc điểm sinh trưởng Đặc điểm nổi bật nhất của vi khuẩn Gluconacetobacter là khả năng sinh cellulose Lớp màng cellulose sinh ra sẽ ngăn cản sự tiếp xúc của tế bào vi khuẩn với oxy gây ảnh hưởng đến khả năng biến dưỡng tế bào Tuy nhiên lớp màng này có tác dụng giữ nước, từ đó giúp vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV

Gluconacetobacter có thể sử dụng được một hay nhiều nguồn carbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn Cụ thể, chủng G hansenmi BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất còn chủng G xylinus TFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn Gluconacetobacter có thể chuyển hóa glucose thành acid acetic, acid gluconic và acid glucuronic Đây cũng chính là nguyên nhân làm cho pH môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy

Theo Hestrin (1947), Gluconacetobacter có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, tối ưu nhất là pH trong khoảng từ 5 đến 5.5 Nhiệt độ sinh trường thích hợp từ 12oC đến 35oC, Gluconacetobacter không phát triển ở nhiệt độ cao ngay cả trong điều kiện môi trường dinh dưỡng tối ưu Đặc biệt, Gluconacetobacter có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10% [73]

Khi nuôi cấy Gluconacetobacter trên môi trường thạch, ban đầu khuẩn lạc non và sinh khối ít nên mọc riêng lẻ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 – 5 ngày Khi tế bào già, sinh khối tăng nên các khuẩn lạc mọc dính lại thành cụm, màu đục hơn và tập trung theo đường cấy giống Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên môi trường nuôi cấy thường được bổ sung thêm acid acetic hoặc acid citric nhằm hạn chế sự nhiễm khuẩn đồng thời tăng hiệu suất tổng hợp cellulose [73]

26 Hình 1.8: Hình thái vi khuẩn Gluconacetobacter b Sự oxy hóa D-glucose thành acid gluconic từ Gluconacetobacter Đối với vi khuẩn acetic nói chung, D-gluconate có thể được tổng hợp qua 2 con đường Ở con đường thứ nhất, D-glucose bị oxy hóa trực tiếp tại chu chất nhờ hoạt động của enzyme glucose dehydrogenase trên màng tế bào [83-86] Ở con đường thứ nhất này, glucose bị oxy hóa thành glucono-δ-lacton và sau đó thành D-gluconate Acid này có thể được tiếp tục bị oxy hóa thành 2-keto-D-gluconat (2-KGA) và 2, 5-diketo-D-gluconate bởi một flavin-dependent gluconate-2-dehydrogenase (GA2DH) và 2-keto-D-gluconate dehydrogenase (2KGDH) tương ứng [83] Ngoài ra, D-gluconate cũng có thể bị oxy hóa thành 5 ketogluconic acid (5 KGA) bởi PQQ-dependent gluconate-5-dehydrogenase (GA5DH) trên màng tế bào [87]

Con đường thứ hai xảy ra trong tế bào chất Đầu tiên, glucose được đưa vào tế bào và sau đó chuyển thành D-gluconate bởi NADP+-dependent glucose dehydrogenase, sau đó sản phẩm tiếp tục được sử dụng đem vào chu trình pentose phosphate Trong tế bào chất, D-gluconate cũng có thể bị oxy hóa thành 2-KGA hoặc 5-KGA bởi 2-keto-D-gluconate reductase (2KGR) và 5-keto-D-gluconate reductase (5KGR) tương ứng

27 Hai con đường oxy hóa D- glucose tạo thành gluconic acid ở vi khuẩn acetic được thể hiện ở hình 1.8

Hình 1.9: Hai con đường oxy hóa D- glucose tạo thành acid gluconic ở vi khuẩn

acetic [82] 1.3.3 Ứng dụng của acid gluconic trong mỹ phẩm Cấu tạo của làn da gồm 3 lớp chính lần lượt là thượng bì, trung bì và hạ bì (chân bì) Chu kỳ sống của tế bào da trải qua 4 giai đoạn chính Đầu tiên, các tế bào da mới được sản sinh ở lớp trong cùng của da (lớp đáy) Sau đó, chúng di chuyển lên bề mặt da Từ đó, chúng phát triển và trải qua nhiều sự thay đổi cả về hình dạng và kích thước Cuối cùng, các tế bào chết sẽ bị bong tróc ra Một chu kỳ sống của da có thời gian từ 28 đến 45 ngày Tuy nhiên thời gian chu kỳ sống của tế bào da cũng bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác như tuổi tác, bất thường về gene, môi trường sống, ánh nắng mặt trời, các chất kích thích như rượu, bia, thuốc lá Những yếu tố này làm chậm quá trình tái tạo da và khiến cho tế bào da chết càng khó bong tróc, lưu lại một lớp dày trên bề mặt da khiến da mất nước, hạn chế sự tái tạo tế bào mới, dẫn đến da sớm xuất hiện các dấu hiệu lão hóa như nếp nhăn, sạm, nám, đốm nâu, tàn nhang và khô sần [79]