Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thành phần nấm nội cộng sinh trong đất nông nghiệp tại huyện Củ Chi thành phố Hồ Chí Minh

TÓM TẮTĐề tài “Thành phần nắm nội cộng sinh trong đất nông nghiệp tại huyện CủChi, thành phó Hồ Chi Minh” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Chan đoán bệnhhọc thực vật và phòng thí nghi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

Se 2 9 sặc dự s sặc ok oe oko oe ok dị oe oko sự ok ok ok ak ok

TRAN TRONG NGHIA

THANH PHAN NAM NOI CONG SINH TRONG DAT NONG NGHIEP TAI HUYEN CU CHI

THÀNH PHO HO CHÍ MINH

LUẬN VAN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HOC

Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 07/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HÒ CHÍ MINH

TRAN TRỌNG NGHĨA

THÀNH PHẢN NÁM NỘI CỘNG SINH TRONG

ĐÁT NÔNG NGHIỆP TẠI HUYỆN CỦ CHI

THÀNH PHẢN NÁM NỘI CỘNG SINH TRONGDAT NÔNG NGHIỆP TẠI HUYỆN CU CHI

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

TRAN TRỌNG NGHĨA

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS NGUYEN VU PHONG

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

2 Thư ký: TS BIỆN THỊ LAN THANH

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: TS LÊ THỊ DIỆU TRANG

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

4 Phản biện 2: TS NGUYEN XUAN DUNG

Trung tam Công nghệ Sinh học TP.HCM

5 Ủy viên: TS HÀ TRAN MINH DUNG

Trường đại học Tôn Đức Thang

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên Trần Trọng Nghĩa, sinh ngày 12 tháng 04 năm 1995 tại Tây Ninh

Tốt nghiệp PTTH tại trường THPT Lê Quý Đôn, tỉnh Tây Ninh năm 2013Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ chính qui tại Đại học NôngLâm TP.HCM

Từ 2019 đến năm 2023 Cộng tác viên và Nghiên cứu viên tại Viện nghiên cứu

Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

Từ tháng 06/2023 đến hiện tại Nhân viên Nghiên cứu tại Công ty TNHH Nghiêncứu Ung dung Mia đường Thành Thành Công

Tháng 10 năm 2020 theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại trường

đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phó Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: 17, hẻm 29, Lạc Long Quân, khu phố 3, phường 4, TP TâyNinh, tỉnh Tây Ninh.

Điện thoại: 0357002532

Email liên hệ: ttnghia995@gmail.com

il

LOI CAM DOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn nay là trung thực và là một phantrong đề tài “Nghiên cứu sản xuất nắm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza - AM)

nhằm kiểm soát tuyến trùng vả một số nam bệnh gây hại trên rau tại khu vựcTp.HCM” thuộc sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM do TS Trương Phước

Thiên Hoàng làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn được phép công bố với

sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

Xác nhận của chủ nhiệm đề tài Học viên

TS Trương Phước Thiên Hoàng Trần Trọng Nghĩa

1H

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin dành lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, phòng đảo tạoSau đại học, ban chủ nhiệm khoa Khoa hoc Sinh học, quí thầy cô đã tạo cơ hội vàtruyền đạt những kiến thức bồ ích trong suốt quá trình học tập tại trường

Cảm ơn Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường đã tạo điều kiệnthuận lợi cũng như hỗ trợ các trang thiết bị cần thiết để tôi hoàn thành đề tài

Xin đành lời cảm ơn sâu sắc đến PSG TS Lê Đình Đôn và TS Trương PhướcThiên Hoàng đã tận tâm hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cảm ơn chị Đào Uyên Trân Đa đã đồng hành từ giai đoạn tôi hoàn thành khóaluận tốt nghiệp đại học đến hoàn thành luận văn thạc sĩ Cảm ơn anh Trần Bảo Thắng

đã nhiệt tình hỗ trợ giải đáp những khó khăn trong quá trình làm đề tài Cảm ơn các

em Nhi, Như, Thư, Tiên, Quỳnh sinh viên khoa Khoa học Sinh học khóa 17 đã hỗ trợ

tôi thực hiện một số nội dung trong đề tài

Và cuối cùng, xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, cha, mẹ, anh chị

em và những người thân đã động viên và hỗ trợ tinh thần dé tôi có động lực hoanthành luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn

Trần Trọng Nghĩa

1V

TÓM TẮT

Đề tài “Thành phần nắm nội cộng sinh trong đất nông nghiệp tại huyện CủChi, thành phó Hồ Chi Minh” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Chan đoán bệnhhọc thực vật và phòng thí nghiệm Sinh hoc phân tử thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ

Sinh học và Môi trường, thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2022 đến tháng 05/2023

Mục tiêu của nghiên cứu là xác định thành phan nam arbuscular mycorrhiza trong đấttrồng rau khu vực thành phố Hồ Chí Minh nhằm đánh giá thành phần và sự phân bốcủa nắm Arbuscular mycorrhiza trong vùng đất nông nghiệp đặc biệt là đất trồng cây

họ bầu bí và họ đậu Các mẫu đất và rễ được thu thập trong vùng đất trồng cây thuộc

họ bầu bí và họ đậu tại huyện Củ Chi Bảo tử được thu thập theo phương pháp sàng

ướt kết hợp ly tâm trong dung dịch succrose 50% Mẫu rễ cây được nhuộm với dungdịch trypan blue 0,05% trong lactoglycerol Thí nghiệm đánh giá khả năng tái cộngsinh với 5 loại cây trồng được bố trí theo kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên với

5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại ở mật độ 1000 bảo tử/ chậu 5kg giá thé (dat : tribat :

xơ dừa).

Kết quả tat cả các mẫu đất trong vùng nông nghiệp huyện Củ Chi đều có sựxuất hiện của nắm cộng sinh với mật số trung bình chung 82,3 + 9,2 bào tử trong100g đất và tỉ lệ cộng sinh trong rễ dao động khoảng 4,9 + 0,8 - 10,5 + 1,5%, trong

đó đất trồng đậu đũa có mật số bào tử và tỉ lệ cộng sinh cao nhất Tổng số 13 kiểu

hình bào tử đã được định danh thuộc 7 chi và 5 họ nắm dựa vào đặc điểm hình thái.Kết quả giải trình tự vùng SSU rDNA với cap primer AML1/AML2 và LSU rDNAvới cặp primer LSU4f/LSU7r đã thu nhận được 16 trình tự thuộc nhànhGlomeromycota tương đồng với các loài Acaulospora cavernata, Acaulosporamellea Acaulospora_ scrobiculata, Acaulospora spinosa, Claroideoglomus etunicatum, Gigaspora giganta, Gigaspora margarita, Racocetra alborosea,Rhizophagus intraradice, Rhizophagus irerularis Khi tai lây nhiễm nam nội cộngsinh vào 5 loại cây trồng cho thay tat cả đều xuất hiện nam cộng sinh trong rễ ở giaiđoạn 14 ngày sau lây nhiễm và cây họ đậu có tỉ lệ cộng sinh và mật số bào tử cao hơn

cây họ bầu bí ở các giai đoạn theo dõi Đồng thời tất cả 5 loại cây được thí nghiệmđều xuất hiện hình thái cộng sinh của các chi Acaulospora, Gigaspora và Glomus nội

sinh trong rễ trong các giai đoạn theo dõi

Từ khóa: Arbuscular mycorrhiza, AM, cucurbitaceae, fabaceae, soil

VI

The study “Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in agricultural soil in Cu

Chi district, Ho Chi Minh city” was conducted at Alumni-Plant Disease Diagnostic

Clinicry and Molecular Biology laboratory of Research institute of Biotechnnology and Environment of Nong Lam university The study period was January 2022 to May 2023 The objective of the study is to determine the composition of mycorrhizal fungi in agricultural soil in Ho Chi Minh City area in order to evaluate the

composition and distribution of mycorrhizal fungi in the soil on cucurbitaceae and

fabaceae Soil and root samples were collected from the land where the gourds cucurbitaceae and fabaceae were grown in Cu Chi district The spores were separated from the soil by wet sieving combined with centrifugation of a 50% sucrose solution Root samples were stained with 0,05% trypan blue in lactoglycerol solution Experiment to evaluate the symbiosis of 5 plants arranged in a completely randomized block with 5 treatments and 3 replicates with a density of 1000 spores/pot

of 5 kg of substrate The results of all soil samples in the agricultural area of Cu Chi district showed the presence of symbiotic fungi with an average density of 82,3 + 9.2 spores in 100g of soil and the symbiotic ratio in the roots fluctuated about 4,9 + 0,8

— 10,5 + 1,5% in which cowpea soil has the highest spore density and symbiosis rate.

Total of 13 spore phenotypes were identified belonging to 7 genera (Acaulospora, Claroideoglomus, Gigaspora, Scutellospora, Glomus, Rhizophagus, Sclerocystic) in 4 families (Acaulosporaceae, Claroideoglomeracae, Gigasporaceae, Glomeraceae) based on morphological features Sequencing the SSU rDNA region with primers AML1/AML2 and LSU rDNA with primers LSU4f/LSU7r yielded 16 sequences belonging to Glomeromycorta homologous to Acaulospora cavernata, Acaulospora mellea, Acaulospora scrobiculata, Acaulospora _ spinosa, Claroideoglomus etunicatum, Gigaspora giganta, Gigaspora margarita, Racocetra alborosea, Rhizophagus intraradice, Rhizophagus irerularis The results of

reinfection with endosymbiotic fungi in 5 crops showed that all symbiotic fungi

vil

appeared in the roots after 14 days of infection and leguminous plants had a higher symbiotic rate and spore density pregnant women at follow-up periods All 5 plants

appeared symbiotically in the genera Acaulospora, Gigaspora and Glomus in their

roots.

Key words: Arbuscular mycorrhiza fungi, AMF, Cucurbitaceae, Fabaceae, soil.

vill

MỜ ĐẦU sensessesensnnsendinooeniiniksBotgSaG02G500110104011301T0300181-G/BSNGHI.TĐED.GHEDH.GGIDDHEGHUDHEEDE 1Chương 1 TONG QUAN ssreceseeesncrvernverevesseneveouvenrenreneiaccarsnnsveneitvieerusmavsecevuivenetivet 31.1 Tổng quan về nam rễ cộng sinh Mycorrhiza - 22 2 2222+22++2z++2+z2z+22zzex 31.1.1 Khái niệm về nam rễ cộng sinh Mycorrhiza 0 0.c0ccccccceccecsesseeseeceeseeseeseees 31.1.2 Phân loại nam rễ GÔIE SUNN s2 z25665666612016ã10-60-62012E36E08GG38032G0G0.G0423G82)3g00001010 002 3Lele2e]., EGEORIWGOIETHỦ ĐỖ gian tin H0N0 0ET BE HDNNGIIHNHHRGHISNGGHENHGGIENDNEERGEHRHSNRGBSBIGSEONHESSESEB 3

1.1.2.2 Endomycorhizas 5 V£ÂA 4

1.1.3 Đặc điểm, cấu trúc và chức năng của nam rễ cộng sinh Arbuscular

)/0//05901y001257 6

To —— TS -ằằnn-n-n-== 6Lal 82), BscersesaossssoasesnoisiiviAEEESTESSSHGSHSHSNMEISEBSSNSSERNSSDSSB4ĐUSDMHTESISSESNSHUSESSESSHEHESES0SSgST 7

1.1.3.4 Tế bảo phụ tro oo.ccecccccsccsseeseessesseseessessessessessessessessessesseseessessessessessessessessesseeseens 9

II nh on 91.1.4 Nhận điền nắm rễ nội cộng sinẰ e‹.s6cecss2ze<csnsessgebskoigiLeE0L501,6061E2.S80 101.1.5 Các yêu tố ảnh hưởng đến sự hình thành nam rễ cộng sinh AM 131.1.5.1 Tính chuyên biệt của nấm rỄ 2 2 22+212EE2EE2EE2EE22E232221 22222 cze 13

1X

1.5.8 Eetinh sein Ty giỗa nữm ccna sae nnonmrstsl cients 13

1.1.5.3 Anh hưởng nguồn dinh dưỡng đến sự hình thành cộng sinh giữa nam và rễ

1.1.6 Vai trò của nam rễ cộng sinh AM đối với cây trồng -2 225- 151.1.6.1 Tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng 2-22 2222222+2z2E+2EEzz+zzxeex lã1.1.6.2 2 0i 5 161.2 Những nghiên cứu liên quan nam rễ cộng sinh Mycorrhiza - 17Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 212.1 Thời gian và địa diém nghiên cứu - 2-2 2 s+2E+2E+2E+2E£ZE+ZEzEzxzxzzxezex 212.2 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 2-2 5s+2S+2E+2E£2E22E22E2121121212222 xe 212.3 Phuong phap nghién 0u 1 pal2.3.1 Thu thập, phân lập nam rễ nội cộng sinh -2- 22©22222+22++2z+22z+zzz>s2 212.3.1.1 Thu thập mẫu nắm rễ nội One Sin -zaz6:55256280630558L01000E2SES-ĐNSSi-LĐiASEEladiie pal2.3.1.2 Phương pháp phân lập bao tử từ đất -2 2¿22222z+2z+zzxzzzrszxcres 222.3.1.3 Xác định sự hiện điện của nắm cộng sinh trong rễ - 2+ 2+2 2s+2z2- 222.3.2 Dinh danh nắm rễ cộng sinh Arbuscular mycorrhiza 2-22 2252 232.3.2.1 Định danh nắm cộng sinh dựa vào đặc điểm hình thái bào tử - 232.3.2.2 Định danh nam nội cộng sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử 252.3.2.3 Phương pháp xác định dạng xâm nhiễm trong rễ của nam AM 282.3.3 Đánh giá khả năng lây nhiễm và tăng sinh bào tử của nắm AM với 5 loại cây

COIN Pa 2953.4 Phương Hhữn sử ý SỐ HỆHueeseeeneinteserbodoisoibirieesnddBiigtiortoi6cki444060948c001491E 30Chaves 3 KET QUÁ VÀ THÁO TA deeeeenedeednddisoiisrnisnsgindsrnirgiersao 313.1 Thu thập, phân lập nam rễ nội cộng sinh AMF 2¿©22222+22+22zz5+2 313.1.1 Thành phan bao tử nam AM trong đất nông nghiệp tại huyện Củ Chi 333.1.2 Đặc điểm hình thái bao tử nam AM trong đất nông nghiệp huyện Củ Chi 353.1.2.1 Đặc điểm hình thái các bào tử thuộc ho Acaulosporaceae trong đất trồng rau

tại TATU Sh (HE HÍ-eosissssriestrisbrdsitistspstiertestttastiliStöiorEoidr3tftoWrSZEmGSGi003800Trfng9295200103012THGöH/G.2g88050E 35

3.1.2.2 Họ Đặc điểm hình thái các bào tử thuộc ho Claroideoglomeraceae trong dat

trồng rau tại huyện Củ Chi oo cceccece cee ceseesseseseeesessceessesssessesesteeeseeneseseees 38

3.1.2.3 Họ Đặc điểm hình thái các bào tử thuộc ho Gigasporaceae trong dat trồng

rau: lại Huyện GỦ CM ers eres nee ce reer cre te ea emi 393.1.2.4 Đặc điểm hình thái các bao tử thuộc ho Glomeraceae trong đất trồng rau tại

In0/500)80.1000010577 423.1.3 Thành phan nam AM xuất hiện trong rễ cây thu thập tại huyện Củ Chi 483.1.3.1 Đặc điểm nam cộng sinh trong mẫu rễ cây thu thập tại vùng đất nông

fighiệp huy en CŨ: Chl sccscsssssssssessieisksi3613516618381363365E1348858021561300300543i238880.086880.1agi 48

3.1.3.2 Đặc điểm cấu trúc hình thái của chi Glomus trong mẫu rễ thu thập tại huyện

KGUP 2) 0s ee ee 493.1.3.3 Đặc điểm cau trúc hình thái của chi Acaulospora trong mẫu rễ thu thập tại

huyện Gũ CHlsoenecpniecsiidtseGHGELiibitotssiSisEeÀ\8iI28g2H9000S/SSSIGEGHLSRE2REIEEBGRIRLIBGBSEEoES 503.1.3.4 Đặc điểm cau trúc hình thái của chỉ Gigaspora/Scutellospora trong mẫu rễ

thu thập tại huyện Củ C1 - - - 2G 22221222322 1251 1231221123 1221 151121 1121 1 cxkE 50

3.2 Định danh nam AMF dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử - 2-2 523.2.1 Giải trình tự một phần vùng SSU rDNA với cặp primer AMLI/AML2 543.2.2 Giải trình tự một phần vùng LSU rDNA với cặp primer LSU4fLSU7r 563.3 Đánh giá khả năng lây nhiễm và tăng sinh bào tử của nam AM với 5 loại cây

COM eee 59BEET LUẬN VÀ BẾ NGHĨ] srecscacazassnecxecanencnenecrcaiensseancnssoncensssesavsteeseceusessamessontau 62EAE HN RE TH uaegegieeddrrtiinotiotrottiotdifotdtstkdiniisoiartlpsisl 63PHU, Le ágsznngg 61g10 103361130 4846383533580043%183E8380131003300148433E004G88133551888g0igz38- 69

XI

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

: Ngày sau lây nhiễm : Polymerase chain reaction

: Subtending hyphae : Spore wall

: Tỉ lệ cộng sinh

xI

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG Hình 1.1 Mặt cắt ngang của rễ chứa Ectomycorrhiza 2 2¿22z+2s+2sz22++2 4

Hình 1.2 Dạng cộng sinh của Endomycorhizas trong rễ cây - 5

Hình 1.3 Quá trình xâm nhiễm của nắm AM trên rễ cây -2- 22552: 6 Hình 1.4 Cấu trúc bụi trong tế bảo -2- 2-52 52SE22E22E22E2E22E22E2E2E 2E 2Ezxrrev 7 Hình 1.5 Túi của nam rễ cộng sinh AM trong rễ cây 22-2 222222z+2zz2zzze 8 Hình 1.6 Tế bào phụ trợ (TBPT) của Gigaspora và Seufellospora 9

Hình 1.7 Bào tử nắm cộng sinh AM 2- 22 ©2222222E22E222E2EE22222EE2EE 2E zrrcrev 10 Hình 1.8 Cấu trúc bào tử thuộc họ Acaulosporaceae -ccccxceeeeerreeree 10 Hình 1.9 Cau trúc bao tử thuộc họ Gigasporaceae 2-2222222z22zzzzzzxcrev 12 Hình 1.10 Cấu trúc bào tử thuộc họ Glomeracaea 2-2 2+sz+s+zz+zzzxzzzzzz 12 Hình 1.11 Các nghiên cứu phân tử dựa trên marker phân tử về nam AM (7zích dan ,10/2//121132/8,NsaÐSSSnann 18

Hình 1.12 Bộ primer cải tiến khuếch đại DNA Glomeromycota theo Kriiger 19

Hình 2.1 Thước chuẩn dùng cho tính kích thước và vẽ scale bar .- 23

Hinh 2.2 Dinh danh nam cộng sinh theo mô tả của Brundrett va ctv (1996) 24

Hinh 2.3 Dinh danh nam cộng sinh theo mô ta hình that 24

Hình 2.4 Cac dang cộng sinh của AM trong rễ cây 2- ¿522 225+5sz2+>52 28 Hình 3.1 Biểu đồ mật số bào tử (MSBT) và tỉ lệ cộng sinh (TLCS) trong đất trồng 5 loại cây thu thập tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chi Minh 31

Hình 3.2 Kiểu hình bảo tử A.01 của họ Acaulosporaceae -: 2 5- 36 Hình 3.3 Kiéu hình bao tử A.02 của họ Acaulosporaceae -+-5s¿ 36 Hình 3.4 Kiểu hình bao tử A.03 của họ Acaulosporaceae -2-cs2 37 Hình 3.5 Kiểu hình bào tử A.04 của họ Acaulosporaceae - -5s+- 37 Hình 3.6 Cấu trúc của bào tử thuộc họ Acaulosporaceae 2 z-s+cs+s2 38 Hình 3.7 Kiểu hình bào tử Cla.01 của họ Claroideoglomeraceae - 38

Xl

Hình 3.8 Cấu trúc của báo tử thuộc họ Claroideoglomeraceae (Theo INVAM) 39

Hình 3.9 Đặc điểm cấu trúc của bào tử Gigaspora albida thuộc họ Gigasporaceae rep Soe eee 0929010255205) 40 Hình 3.10 Đặc điểm hình thái kiểu hình Gi.01 của họ Gigasporaceae 41

Hình 3.11 Đặc điểm hình thái kiểu hình Gi.02 của họ Gigasporaceae 41

Hình 3.12 Đặc điểm hình thái kiểu hình Gi.03 của họ Gigasporaceae 41

Hình 3.13 Đặc điểm của bào tử Glomus ambisporum của họ Glomeraceae 43

Hình 3.14 Kiéu hình bao tử GI.01 của họ Glomeraceae 2 2522 z+52 44 Hình 3.15 Kiểu hình bào tử GI.02 của họ Glomeraceae 2s s+szz5s2 45 Hình 3.16 Kiểu hình bào tử GI.03 của họ Glomeraceae 2 s+secz+s+: 46 Hình 3.17 Kiêu hình bào tử GI.04 của họ Glomeraceae 2 22252552: 46 Hình 3.18 Kiểu hình bao tử G1.05 của họ Glomeraceae -2- 252 sec: 47 Hình 3.19 Nắm nội cộng sinh trong mau rễ thu thập tại huyện Củ Chi 48

Hình 3.20 Cau trúc của chi Glomus trong mẫu rễ thu thập tại huyện Củ Chi 49

Hình 3.21 Cấu trúc của chi Acaulospora trong mẫu rễ thu thập tại huyện Củ Chi 50 Hình 3.22 Đặc điểm cấu trúc cộng sinh trong rễ của chi Gigaspora/Scutellospora se 51 Hình 3.23 Kết qua điện di san pham PCR với các cặp primer AML1/AML2 53

Hình 3.24 Kết qua điện di san pham PCR với các cặp primer LSU0061/LSU0599 (trai) va LSU4f/LSU7r (phải) (Ladder 1 kb Bioline) - 53

Hình 3.25 Cay phát sinh loài dựa trên trình tự vùng SSU rDNA của các mẫu thu thập trong đất nông nghiệp tại huyện Củ Chi -. 2-52 ©522222252zxs>s2 56 Hình 3.26 Cây phat sinh loài dựa trên trình ty LSU rDNA của các mẫu thu thập trong đất nông nghiệp huyện Củ Chi -2-©22222222222+2ES22E222Ez2xzzzxee 58 Hình 3.27 Lưu trữ và nhân nguồn bao tử nắm nội cộng sinh trong điều kiện nhà lưới söSL436S3L205086555EEESBS4SSSESHLGBLXESISAEG58SSLSSETAXGDNSSHEESRSSSSIESLERGSGERREG4.SS11Đ3862135 EERE 59 Hình 3.28 Bồ trí thí nghiệm đánh giá khả năng tái lây nhiễm nấm AM với 5 loại cây noi 59

Hình 3.29 Nam cộng sinh trong rễ 5 loại cây ở giai đoạn 28 NSLN 61

XIV

DANH SÁCH CÁC BANG

TRANGBang 2.1 Thanh phan phản ứng PCR cho nắm AME 2-52 2522Sz2£S22Ez>s2 26Bảng 2.2 Các cặp primer được sử dụng dé khuếch đại DNA nam AM aBang 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với AML1/AML2 2] Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR với LSU0599/ LSU0061 Di Bang 2.5 Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR với LSU4fLSU7r 28Bảng 3.1 Thành phần bào tử nắm AM trong 100g đất trồng rau tại huyện Củ Chi

Bảng 3.2 Bảng thành phần kiểu hình bảo tử xuất hiện trong đất trồng các loại cây tại

I0 /65086080.10020255 34Bang 3.3 Đặc điểm hình thái của các kiểu hình thuộc họ Acaulosporaceae trong đất

trồng rau tại huyện Củ Chi -¿52¿55222+22E222+2EE2EzExerxrrrsrer 35Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái của các kiểu hình thuộc họ Gigasporaceae trong đất

trồng rau tại huyện Củ Chi . - 2-2 522E22E2£E22E22E22E22E222222222zxe2 40Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái của các kiểu hình thuộc họ Glomeraceae trong đất trồng

PAU tại HUYỆN, CU CHÍ ¡ssaoeseinniintisEL101136 00638 03988383.49858848E580053G80033833ã.48688/083g8:SỬ 43Bang 3.6 Thành phan chi nam xuất hiện trong rễ cây thu thập tại huyện Củ Chi theo

mo ta:cua Brundrett và cv (1996) « pioecdiiindibiddvtdengtt82S03303558405480 :2S08 49 Bang 3.7 Bang phân nhóm bao tử sử dung cho ly trích DNA - 52Bảng 3.8 Kết quả so sánh độ tương đồng cao nhất với các loài tham chiếu trên

genbank của các mẫu dưa trên trình tự gen vùng SSU rDNA 54

Bảng 3.9 Kết quả so sánh độ tương đồng cao nhất với các loài tham chiếu trên

genbank của các mẫu dưa trên trình tự gen vùng LSU rDNA Sử

Bang 3.10 Mật số bao tử trong 100g đất trồng 5 loại cây sau khi lây nhiễm nam AM

XV

MỞ DAU

Đặt vấn đề

Nam rễ nội cộng sinh mycorrhiza là hiện tượng cộng sinh giữa nam và thựcvật phổ biến trong tự nhiên Nam mycorrhiza có vai trò quan trọng trong chuyền hóanguồn P và N cho thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mycorrhiza thiết lập mốiquan hệ thông qua hệ sợi nam và hệ rễ cây trồng, là kết quả của nhiều phản ứng hóasinh và xâm nhiễm từ đó tạo mối quan hệ hỗ trợ cùng nhau phát triển; làm gia tăng

sự sinh trưởng, tăng khả năng hấp thu nước và dinh dưỡng, duy trì độ phì nhiêu củađất, đồng thời còn tăng khả năng chịu hạn, chịu mặn của cây trồng Đây cũng như làmột phần quan trong trong sự da dang hóa sinh học trong hệ sinh thái nông nghiệpvùng nhiệt đới.

Với hơn 65% tổng số diện tích gieo trồng cây hàng năm theo quận huyện tạithành phố Hồ Chí Minh năm 2021 (Niên giám thống kê 2022), huyện Củ Chi cũngđứng đầu trong việc cung cấp lương thực, thực phẩm cho thành phố Hồ Chí Minh.Với tiềm năng kinh tế nông nghiệp, và định hướng sản xuất nông nghiệp công nghệcao đòi hỏi việc tìm kiếm các giải pháp sạch đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng Việcloại bỏ hoàn toàn phân bón hóa học khỏi nền nông nghiệp là không thể nhưng sửdụng phân bón hóa học kết hợp sinh học hợp lý có thể làm giảm lượng phân hóa họctiêu thụ từ đó giúp giảm chi phí đầu tư cũng như giá thành nông sản Dé sản xuất rautốt, canh tác sinh học là một trong những cách mang lại sự ôn định và bền vững chonền nông nghiệp Bên cạnh việc nghiên cứu nam rễ nội cộng sinh mycorrhiza trên

cây lương thực như cây ngô, lúa; cây ăn quả hay các nghiên cứu trên cây công nghiệp

và cây gia vị Các nghiên cứu hệ nam nội cộng sinh mycorrhiza trên vùng đất trồngrau ăn lá và rau ăn quả hiện tại rất ít Từ đó đề tài được thực hiện nhằm điều tra thànhphan va sự phân bố của nấm nội cộng sinh Arbuscular mycorrhiza trong vùng đấtnông nghiệp đặc biệt là đất trồng các loại cây họ đậu và họ bầu bí làm tiền đề cho

việc lựa chọn các dòng nam phù hợp đối với cây trồng để phục vụ công tác sản xuất

phân bón sinh học cải thiện hiểu quả nông nghiệp công nghệ cao

Mục tiêu

Xác định thành phan nam rễ Arbuscular mycorrhiza trên đất nông nghiệp khuvực thành phố Hồ Chí Minh nhằm đánh giá sự đa dang về thành phan và sự phân bốcủa nắm Arbuscular mycorrhiza trong vùng đất nông nghiệp đặc biệt là đất trồng rau

ăn quả họ bầu bí và họ đậu

Nội dung nghiền cứu

Thu thập, phân lập bao tử trong đất và xác định sự hiện điện của nắm nội cộng

sinh trong rễ thu thập tại đồng ruộng huyện Củ Chi

Phân loại nắm Arbuscular mycorrhiza dựa vào đặc điểm hình thái và sinh họcphân tử.

Đánh giá sự tái xâm nhiễm của nam cộng sinh đôi với 5 loại cây thu thập.

Chương 1

TỎNG QUAN

1.1 Tổng quan về nam rễ cộng sinh Mycorrhiza

1.1.1 Khái niệm về nắm rễ cộng sinh Mycorrhiza

Nam rễ cộng sinh là một hiện tượng cộng sinh thực vật phô biến trong tự nhiên,

là hình thức cộng sinh giữa thực vật và nam Thuật ngữ Mycorrhiza được Frank - nhà

bệnh cây lâm nghiệp người Đức đưa ra dé chỉ mối quan hệ giữa nam đặc biệt giữa

nắm cộng sinh và rễ cây Nam mycorrhiza cộng sinh với rễ thực vật nhằm hỗ trợ và

cung cấp dinh đưỡng, sự giúp đỡ qua lại đó giúp cả hai cùng phát triển Đây là sự kếthợp nam - thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình

phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái, có khoảng 80% trong số các loài

thực vật sống trên Trái Đất tham gia vào việc hình thành cộng sinh nắm rễ (Brundrett

và Tedersoo, 2018).

Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 được tô chức tai Lisboa

- Bồ Đào Nha đã quyết định lay tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” dé chỉ loại hìnhcộng sinh này Do vậy, trong các tài liệu mới được công bồ, thuật ngữ “ArbuscularMycorrhiza Fungi” (viết tat là AMF) đã được thống nhất sử dung thay cho thuật ngữ

“Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” vào năm 2008.

1.1.2 Phân loại nam rễ cộng sinh

Frank Martin là người tiên phong trong việc nghiên cứu mycorrhiza dẫn đến

sự công nhận về 2 nhóm cộng sinh của mycorrhiza là ectomycorrhizas vàendomycorhizas (Smith va Read, 2008).

1.1.2.1 Ectomycorrhizas

Nam rễ ngoại cộng sinh được đặc trưng bởi sợi nam bao quanh rễ dinh dưỡng,kéo dài giữa các vách tế bào mà không xuyên qua mô tế bào hình thành của một lớp

bao phủ và mạng lưới Hartig Nắm rễ ngoại cộng sinh thường có hình dạng và màusắc nhất định (có thế nhìn thấy bằng mắt thường).

Hình 1.1 Mặt cắt ngang của rễ chứa Ectomycorrhiza

(Mark Brundrett, 2008) 1.1.2.2 Endomycorhizas

Endomycorhizas có nhiều biến đổi hơn ectomycorrhizas ở các loài cây thânthảo và cây rừng Endomycorhizas được phân loại thêm như là arbuscular

mycorrhizas, ericoid mycorrhizas, arbutoid mycorrhizas, monotropoid mycorrhizas, ectendo mycorrhizas va orchid mycorrhizas Mỗi loại này được đặc trưng bởi su xâm

nhiễm và sự khác biệt trong quá trình phát triển của những sợi nấm vào các tế bao rễ

Arbuscular mycorrhizas (AM) có kiểu cộng sinh tạo bụi trong tế bào rễ AM

là dạng cộng sinh phô biến nhất trong tat cả các loại nam mycorrhiza (Harley, 1987)với khoảng 72 - 80% (Brundrett và Tedersoo, 2018) của tất cả các loài thực vật Đặcđiểm nhận biết của AM là sự phát triển của sợi nắm liên bào, sợi nam nội bao và bụitrong các tế bào rễ (một số loài cũng phát triển thành túi trong và giữa các tế bảo rễ)ngoài ra còn có sự sản sinh các bao tử trên các sợi nam trong và ngoài tế bao

Ericoid mycorrhizas là dạng nam rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ Quyên(Ericales) Ericoid mycorrhizas được đặc trưng bởi các cuộn nam hình thành trongcác tế bảo biểu bì của rễ Các nam ericoid mycorrhizas tạo thành các mang lưới sợinắm xung quanh bên ngoài rễ tóc, từ đó nắm xâm nhập vào các thành tế bao vỏ rễ déhình thành các cuộn nội bảo có thể nằm trọn trong những tế bảo riêng biệt Theo

Scagel (2005), việc lây nhiễm nam Ericoid mycorrhizas làm tăng khả năng sinhtrưởng của cây trồng, và tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng hoặc tăng hiệu quả

sử dụng chất dinh dưỡng ở một số giống cây

Arbutoid mycorrhizas và Monotropoid mycorrhizas là dang nam rễ có cả ngoạicộng sinh và nội cộng sinh nhưng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi thuộc họ ĐỗQuyên (Ericaceae) Hai loại nay có sự khác biệt với Ericoid mycorrhizas do có mộtmạng lưới Hartig cũng như các sợ nam nội bào và có liên quan đến đối tượng nam

khác (Peterson va ctv 2004) Monotropoid mycorrhizas khác biệt với Arbutoid

mycorrhizas trong các tế bào biểu bì bị xâm nhập bởi một sợi đơn tạo thành hình dạngcái “cọc” xung quanh mà các tế bào chủ xây dựng thành và màng tế bao Mặt khác,Arbutoid mycorrhizas thì phát triển một hệ sợi phức tạp trong tế bào biểu bì

(Peterson va ctv, 2004; A: Arbutoid mycorrhizas; B: Monotropoid mycorrhizas; C: Orchid

mycorrhizas; D: Ericoid mycorrhizas; E: Arbuscular mycorrhiza)

Orchid mycorrhizas là dang nấm rễ cộng sinh với các cây ho Lan(Orchidaceae) Sự xâm nhiễm của mycorrhiza vào rễ lan chủ yếu qua lông hút Ở một

số loài xâm nhiễm trực tiếp qua lớp biểu bì Các loại nắm hình thành cau trúc sợixoắn lớn (pelotons) và xâm nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (Sathiyadash và ctv,2012).

Ectendomycorrhizas là dạng nắm rễ nội - ngoại cộng sinh, mang đặc trưng của

2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý Theo Yu và ctv

(2001) Ectendomycorrhiza thường chỉ giới han ở những loài Penus và Larix spp Sự

cộng sinh này đặc trưng bởi sự kết hợp độc đáo của một lớp phủ nam, mạng lướiHartig và các sợi nam trong tế bào Ectendomycorrhizas có vai trò quan trọng trongquá trình tái tạo các tế bào bị tổn thương

1.1.3 Đặc điểm, cấu trúc và chức năng của nấm rễ cộng sinh Arbuscular

Mycorrhiza

1.1.3.1 Sợi nắm

Năm 2004, Peterson và ctv nhận định sự hình thành nam nội cộng sinh AMliên quan đến hàng loạt các bước từ sự tiếp xúc với rễ đến sự hình thành vòi bám,xâm nhập vào tế bào biểu bì, sự phát triển của sợi nam nội bao và bụi, trong một sốtrường hợp hình thành cấu trúc túi

Hình 1.3 Quá trình xâm nhiễm của nắm AM trên rễ cây

(Nguồn: Peterson và ctv, 2004)

Sự cộng sinh bắt đầu từ sự nảy mầm của bào tử khi gặp điều kiện thuận lợi,

bảo tử hình thành ống mam và phát triển thành sợi nam ngoại bao Các sợi nam naycảm ứng được sự hiện diện của rễ cây và phát triển hướng đến rễ DE phát triển tất cảcác cấu trúc bên trong, các sợi nắm phải tiếp xúc với bề mặt của tế bao biểu bì rễ hoặclông hút rồi hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là vòi bám, sau đó xâm nhập vào lớpbiểu bì trước khi đến tế bào rễ Tại những vị trí mà sợi nắm tiếp xúc với bề mặt rễ,

nơi mà các vòi bám hình thành vào xâm nhập vào rễ gọi là điểm xâm nhiễm Soi namkhi tiếp xúc với bề mặt rễ có thể hình thành nhiều điểm xâm nhiễm.

Theo Peterson và ctv (2004), các sợi nắm bám trên bề mặt rễ hoặc lông hút cóthé bắt nguồn từ những bào tử nảy mầm hoặc những sợi nam mọc ra từ rễ cây chủ délại trong đất khi thực vật chết Các sợi nam tồn tại trong các mảnh rễ đã mục nát trongđất là nguồn gốc quan trọng cho sự xâm nhiễm vào rễ mới Bằng cách chống chịu lại

sự lạnh giá hoặc hạn hán của đất, các sợi nam có thé tồn tại trong đất cho đến khi gặpđiều kiện thuận lợi dé phát triển Brundrett và ctv (1996) cho rằng các sợi nam trongđất có chức năng hấp thu chất dinh dưỡng, lan truyền sự liên kết và hình thành bàotử; sợi nam trong dat san sinh ra các sợi nam khác bao gồm sợi nam lan truyền, sợinam phân phối và sợi nam hap thu

1.1.3.2 Bụi

vì chúng giống như những bụi nhỏ phân nhánh phức tạp trong tế bào rễ Bụi đượchình thành do sự phân chia nhiều lần và giảm dần về độ dày của sợi nam bắt đầu từ

sợi nam đầu tiên (đường kính 5 - 10 pm) và kết thúc bởi sự gia tăng của những sợi

nhánh (đường kính <1 pm) Bui cũng được xem là nơi cộng sinh chính giữa AM va

cây chủ.

Theo Peterson va ctv (2004), tính chat phân nhánh của bụi và sự hiện điện củamột màng bao phủ tất cả các sợi nhánh tạo ra diện tích bề mặt lớn, việc trao đổi traođổi chất dinh dưỡng có thé xảy ra do cấu trúc này Bui chỉ tồn tại trong khoảng vàingày (Harley và ctv, 1987), sau đó hình thành bụi mới nên chất dinh dưỡng có thểđược giải phóng vào tế bào rễ cây chủ khi bụi tiêu biến (Peterson và ctv, 2004)

1.1.3.3 Túi

Túi là chỗ phình to của sợi nấm trong tế bảo rễ, có thé hình thành từ đầu sợinam hoặc từ các sợi nhánh, túi cũng có thé mọc bên trong tế bao hoặc giữa các gianbào và thường mọc dày đặc bên trong những đoạn rễ già Túi có thường có vách dày,

có dạng hình bầu dục hoặc gần giống hình chữ nhật (thường chỉ xuất hiện ở một sốloài thuộc chi Acaulospora) và không thấy sự xuất hiện túi trong tế bao ở 2 chi namGigaspora và Scutellospora (Brundrett và ctv, 1996).

Hình 1.5 Túi của nam rễ cộng sinh AM trong rễ cây(Nguồn: Brundrett và ctv, 1996; A: túi của chi Glomus; B: túi của chi Acaulospora).Cấu trúc túi chứa một lượng lớn lipid (khoảng 58,2% khối lượng khô của túi)(Jabaji-Hare, 1984) và tế bào chất, chúng được hình thành bởi một số nam xuất hiệntrong tế bào rễ Một số loài nam hình thành cấu trúc giống như bao tử trong đất Do

đó túi là một cau trúc quan trọng và có thé hoạt động như một yếu té lan truyền giống

1.1.3.4 Tế bào phụ trợ

Hình 1.6 Tế bào phụ trợ (TBPT) của Gigaspora và Scutellospora

(Nguồn: Brundrett và ctv, 1996; A: TBPT của Gigaspora; B: TBPT của Scutellospora)

Theo Brundrett va ctv (1996) va Peterson va ctv (2004), té bao phụ trợ cònđược gọi là túi ngoải, là một cụm những tế bào hình cầu sưng phông lên trên các sợinắm ngoại bào (có thê xảy ra đơn lẻ hoặc thành chùm) Chúng chứa một lượng lớnlipid và không bào Tế bao phụ trợ chỉ xuất hiện ở hai chi nam là Scutellospora vàGigaspora (tế bào phụ trợ có gai) và không có chức năng lan truyền giống

1.1.3.5 Bào tử

Năm 1996, Brundrett và ctv mô tả bào tử được hình thành từ những chỗ phình

lên của sợi nắm trong đất hoặc trong rễ (một số được hình thành từ túi bào tử) Bào

tử thường có dang hình cau, hình elip, hình bầu dục, hay không có hình dạng xác

định Màu sắc của bào từ rất đa dạng, từ trong suốt, trắng đục, vàng, cam, nâu đỏ đến

màu đen Bào tử thường mọc đơn lẻ hoặc mọc thành chùm, có cuống hoặc khôngcuống Thành bào tử day, có cau gồm một hay nhiều lớp, điều này giúp chúng có thétồn tại lâu trong đất đôi khí đến vài năm (Peterson và ctv, 2004) Kích thước bào tửcũng thay đôi từ rất nhỏ (20 - 50 ym) đến rat to (200 -1000 pm)

sau đó cảm ứng được sự hiện diện của rễ và phát triển hướng đến rễ, cuối cùng làthiết lập mối quan hệ cộng sinh giữa sợi nắm và rễ cây Bào tử có chức năng như mộtyếu tô lan truyền giống chứa các bào quan thông thường như ty thể, lưới nội chất,không bao (Peterson va ctv, 2004) và một lượng lớn lipid(khoảng 45,5% trọng lượng khô của bào tử) (Beilby, 1980).

1.1.4 Nhận diện nắm rễ nội cộng sinh

Hiện nay việc nhận diện nam rễ nội cộng sinh dựa vào các đặc điểm hình tháikhá phô biến ở Việt Nam Các đặc điểm hình thái được nghiên cứu chủ yêu thuộc 3

họ chính là Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Glomeraceae.

Họ Acaulosporaceae, đặc trưng bởi sự hình thành bào tử bên trên hoặc trong

cuống bào của túi bào tử (saccule), tuy nhiên khi trưởng thành, bào tử sẽ tách ra khỏitúi và còn lại 1 vết sẹo gọi là cicatrix có hình trứng hoặc gần hình trứng Bề mặt bao

tử có thể nhẫn, có gai nhỏ hoặc có những hốc nhỏ phủ đều Thành bào tử gồm 2 - 3

lớp, các bao tử mới hình thành thường có 1 lớp mỏng (<1 um) bao phía ngoài va

thường mất đi khi bào tử trưởng thành Thành mầm (germinal wall) có 2 đến 3 lớp,lớp trong cùng thường bắt màu đỏ tia đến đỏ thẫm với thuốc nhuộm PVLG và Melzer(tỉ lệ 1:1) Họ Acaulosporaceae cũng hình thành 1 cầu mầm (germination orb) ở thànhmam phía trong bào tử (germinal wall), cầu mầm thường khó nhìn thay và chi dé thaykhi bào tử già khi các chất bên trong bào tử đã tan rã và hợp nhất với các giọt lipidbên trong bào tử (INVAM).

Họ Gigasporaceae (hình 1.9) được phân loại bởi Morton và Benny năm 1990(INVAM) gồm các chi Gigaspora, Cetraspora, Dentiscutata, Racocetra,Scutellospora; các bào tử ho Gigasporaceae thường có kích thước khá lớn (thường >

200 um) Thanh bao tử bao gồm một lớp bên ngoài cô định bao quanh một lớp nhiều

lớp, mỗi lớp có các đặc tính khác nhau giúp phân biệt các loài; Nội dung bảo tử được

ngăn cách với nội dung của tế bào bảo tử hình củ hành bằng nút thắt hoặc hiếm hơn

là bằng vách ngăn (INVAM), Cuống bào tử có dạng phình to hình củ hàn (Brundrett

và ctv, 1996) hoặc được gọi là sporogenous cell (INVAM).

Ho Glomeracaea (hình 1.10) được phân loại từ rất sớm, ké từ khi khóa phân loạiđầu tiên về mặt hình thái học bởi Gerderman (1963) Họ glomeraceae đặc trưng bớicau trúc cuống bảo tử (subtending hypha) thang, đính vuông góc với bề mặt bao tử,

va sự nảy mầm của bảo tử thông qua thành hoặc cuống bao tử Thành bao tử của họnày bao gồm 1-3 lớp, bào tử có thể mọc riêng lẻ gọi là glomoid hoặc thành cụmsporocarp Họ Glomeraceae cũng được đặc trưng bởi các chi nắm phô biến được phânloại sớm nhất là Glomus, Sclerocystic (Morton va Benny, 1990)

lại

wall

i

MUROGRAPH Cc

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành nắm rễ cộng sinh AM

1.1.5.1 Tính chuyên biệt của nắm rễ

Những loài nắm khác nhau có tính chọn lọc, thích nghi và phạm vi tồn tại khácnhau Nhưng trong cùng một loài nắm, những chủng khác nhau cũng có tính chuyênhóa khác nhau (Trần Văn Mão, 2004)

Vào năm 2002, nghiên cứu của Helgason và ctv đã sử dụng 4 loài nắm cộngsinh gồm Scutellospora dipurpurescens; Glomus hoi, UY1225 (Glomus sp.) va

Archaeospora trappei lây nhiễm vào 05 giéng cây A pseudoplatanus, A reptans,

G hederacea, L nummularia va T scorodonia Kết qua cho thấy cây A

pseudoplatanus chi cộng sinh được với loài Glomus hoi, trong khi đó loài nam

Scutellospora dipurpurescens chỉ cộng sinh với 2 trong 5 loại cây trên Điều nay chothấy cùng một chi nắm nhưng loài khác nhau thì tính chuyên hóa cũng khác nhau

Mặc dù nấm AM và các loài cây chủ ký chủ có thể tương thích về sự hìnhthành sự cộng sinh nhưng không phải lúc nào cũng tương thích ở các mức chức năngkhác (Ravnskov và Jakobsen, 1995) Do đó một số loài cây có thể thiết lập mối quan

hệ cộng sinh với nhiều loại nam rễ khác nhau (Harley, 1987) Những loài cây khácnhau, các giai đoạn phát triển cũng khác nhau nên loài nắm cộng sinh cũng khônghoàn toàn như nhau.

1.1.5.2 Đặc tính sinh lý của nắm rễ

Khi gặp điều kiện thuận lợi, bảo tử nắm phát triển, hình thành sợi và xâm nhiễmvào thực vật Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trong ảnh hưởng đến sự hìnhthành nam rễ AM

Nghiên cứu của Gavito và ctv (2005) về sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinhtrưởng và hoạt động của nam rễ AM cho thấy nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến sựsinh trưởng của sợi nắm nội bảo, sợi nắm ngoại bào, khả năng tạo bụi vả túi trong tếbao mà còn ảnh hưởng đến khả năng vận chuyên chất dinh dưỡng từ nắm đến rễ cây

Bên cạnh đó theo Kurle và Pfleger (2000), việc đốt nương rẫy sau mùa vụ làm tăng

gián tiếp nhiệt độ trong đất cũng ảnh hưởng đến sự nảy mầm và phát triển của nấm(trích dẫn bởi Trần Thị Dạ Thảo, 2012)

13

Năm 1996, Habte và Soedarjo đã đánh giá sự ảnh hưởng của pH bằng việcchủng nam Glomus aggregatum vào cây Acacia mangium ở các mức pH từ thấp đếncao (4,3 - 6,0) thì tỉ lệ xâm nhiễm của nam vào cây chủ qua các mức độ pH cũng tăngtheo Rhoyadi va ctv (2004) cũng thử nghiệm trên 2 loài nắm Gigaspora margarita

và Glomus etunicatum ở các mức độ pH tăng dần (4,7 - 5,2) cho thấy tỉ lệ xâm nhiễmvào cây chủ của loài Gi margarita cao nhất ở mức pH = 4,7, còn tỉ lệ xâm nhiễm của

G etunicatum cao nhất ở pH = 5,2 Ngoài ra các nghiên cứu của Green va ctv (1976),

Siqueira và ctv (1985), chỉ ra rằng nam G7ozs phát triển tốt ở vùng có pH từ trungtính đến cao, còn Gigaspora và Acaulospora phát triển tốt ở vùng có pH thấp

Như vậy có thé kết luận pH là một yếu tố quan trọng trong sự phân bé và sựxâm nhiễm vào cây chủ của nắm rễ cộng sinh AM

1.1.5.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến sự hình thành cộng sinh giữa nắm và

rễ cây trồng

Nguồn Carbon (C): theo Trần Văn Mão (2004), nam cần nhiều hợp chất cacbontrong quá trình hình thành tế bao và trao đổi chat Do đó, nam rễ cộng sinh AM cũngcần nguồn dinh dưỡng cacbon từ ngoài vào thông qua bộ rễ Harris và ctv (1985) chorằng mycorrhiza sử dụng 17% sản phẩm quang hợp từ cây đậu nành trong tuần thứ 6

và tỉ lệ này giảm xuống 8% ở tuần thứ 9 Các nghiên cứu của Snellgrove va ctv (1982),Wang và ctv (1989) cũng cho thấy thực vật đã phân phối một lượng C từ sản pham

quang hợp đến nắm rễ AM trong quá trình cộng sinh Năm 1998, Wright va ctv sử

dụng mycorrhiza xâm nhiễm vào cỏ ba lá, kết quả tốc độ quang hợp ở lá non tăng(393%) ở tuần đầu tiên và giảm đáng kể qua tuần tiếp theo, nhưng sự gia tăng củahợp chất carbon không được chuyền thành sinh khối Từ đó có thể kết luận rằng nắm

rễ AM sử dụng nguồn C từ cây chủ khi xâm nhiễm và kích thích sự quang hợp trêncây chủ dé đến khi cả hai sinh trưởng cân bang thì nguồn dinh dưỡng dần được cảithiện.

Nguồn Phốt pho (P): Nam rễ cộng sinh AM cũng giống như nấm rễ ngoạI cộngsinh đều có thé lấy P trực tiếp từ đất thông qua sợi nam (Tran Văn Mão, 2004) Nhữngnghiên cứu cua Smith (1982), Eason và ctv (1991), Habte và Soedarjo (1996), Smith

và ctv (2011) đã chỉ ra rang nam rễ AM có vai trò quan trọng trong việc hap thu P

14

chuyền hóa vào cây trồng Tuy nhiên liều lượng P cũng ảnh hưởng đến sự hình thành

và hiệu quả nam cộng sinh đối với cây chủ Ở nồng độ P thấp, sự hình thành nắm rễcộng sinh tăng lên, nhưng khi tăng nồng độ P lên cao thì hiệu quả của nấm rễ cộngsinh giảm lại (Habte và ctv, 1996) Năm 2001, Ploulton cũng nhận thay cây ca chua

có nam rễ AM xâm nhiễm ra hoa nhiều ở điều kiện P trong đất thấp Koide (1991)

cho rằng sự thiếu hụt P là có thể là một nguyên nhân dẫn đến sự cộng sinh với nam

AM Ong cũng nhận định sự phan ứng thực tế đối với quá trình cộng sinh của

mycorrhiza có thê được xem là một chức năng trong việc hấp thu P và hiệu quả sửdụng P của cây trồng

1.1.6 Vai trò của nam rễ cộng sinh AM đối với cây trồng

1.1.6.1 Tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng

Đến nay có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của nam rễ AM trongviệc làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng cho cây chủ đặc biệt là hấp thu P trongđất Qua đó, thực vật được nắm rễ AM cộng sinh có 2 con đường hấp thu dinh dưỡng(Smith và ctv,1997; Biicking va ctv, 2015) Cây ký chủ có thé hap thu dinh dưỡngtrực tiếp từ sự vận chuyền chất dinh dưỡng qua lớp biéu bì hoặc lông hút, con đườngcòn lại là sự hấp thu chất dinh gián tiếp nhờ sự cộng sinh của nam rễ AM

Phốt pho (P) là yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng sinh trưởng và pháttriển Ở trong đất, P rất kém di động nên cây trồng rất khó hấp thu, vì vậy nắm rễ AM

có vai trò quan trọng trong việc giúp tăng cường khả năng hấp thu P cho cây trồng

(Snellgrove và ctv, 1982; Koide, 1991; Harrison va ctv, 2002; Smith va ctv, 2003;Nagy va ctv, 2009) Smith va ctv (2003) nhận thay Gigaspora rosea làm tăng sự hapthu P thông qua đường dan trực tiếp vào rễ Soi nam ngoại bào của Glomuscaledonium vận chuyển một lượng lớn P từ khoang sợi nam đến cây chủ (Ravnskov

và Jakobsen, 1994) Theo Jakobsen và ctv (1992) thì sự khác biệt giữa nam trở nên

rõ nét hơn khi dòng P được thê hiện trên cơ sở chiều dai nam Hệ sợi nắm ngoại bao

kéo dài thống rễ giúp cây chủ tiếp cận lượng P trong đất từ con đường cộng sinh với

nam rễ đáng kể hơn con đường tự hap thu (Nagy và ctv, 2009)

Bên cạnh đó, một yếu tố dinh dưỡng không thé thiếu đối với cây trồng là Nito(N) Nam AM có thé day nhanh quá trình phân hủy chất hữu cơ, qua đó tăng khả năng

15

tiếp nhận và hấp thu nitrate (Javot, 2007) Các sợi nam của AM có thé cải thiện hiệuqua hap thu N vô cơ cao hơn; nam Glomus intraradices và Gigaspora margarita vậnchuyền hơn 30% !ŠN đến cây ngô (Frey va Schiiepp, 1993) Mac đù nấm rễ AM cóthé có thé truyền một phần N đến cấy chủ (Hodge và Fitter, 2010) tuy nhiên, Heijden

và ctv (2015) lại cho rằng nắm rễ AM thu được N từ phân hủy chất hữu cơ và sử dụng

N chủ yếu cho sự phát triển và sự trao đổi chất của chúng, làm cho chúng cạnh tranhcây ký chủ.

Nấm rễ AM là dạng cộng sinh bắt buộc, và việc trao đôi chất dinh dưỡng haichiều giữa nắm và cây ký chủ là một đặc điểm quan trọng đối với tính năng cộng sinh(Nagy và ctv, 2009), do đó cây ký chủ cũng cung cấp một lượng sản phẩm quang hợpcho nam sinh trưởng và phát triển (Snellgrove va ctv, 1982; Harris va ctv, 1985; Wang

va ctv, 1989; Wright va ctv, 1998) Viéc trao đổi chất đinh dưỡng giữa nắm AM vàcây chủ là nhờ vào sự phát triển của cau trúc sợi nam và bụi trong tế bao Khi bụi củanắm AM tiêu biến từ đó giải phóng một lượng dinh dưỡng vào tế bào rễ

Sự hap thu chất dinh dưỡng trong dat của nam rễ chịu anh hưởng bởi các yếu

tố như pH đất (Habte và Soedarjo, 1996 và Rhoyadi, 2004), nhiệt độ (Gavito và ctv,2005) Bên cạnh đó hiệu qua hap thụ chất dinh dưỡng của nam rễ có thé bị ảnh hưởngbởi sự phân bố không gian (chiều dai) của sợi nam ngoại bao trong đất (Jakobsen vàctv, 1992).

1.1.6.2 Vai trò khác

Ngoài việc làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, nắm rễ AM còn có rất nhiềuvai trò khác như: tăng khả năng chống chịu cây trồng trong các điều kiện bất lợi khicộng sinh với cây (Habte va Soedarjo, 1996; Gavito va ctv, 2005) Nam ré AM va vikhuẩn có lợi có thé cùng tồn tai mà không anh hưởng với nhau, do đó sự kết hợp này

có thé làm tăng sự phát triển của cây trồng, tăng sức đề kháng và chống lại các tácnhân gây bệnh (Akhtar và Siddiqui, 2008) Nam rễ AM cộng sinh với cây trồng làmgiảm khoảng 7% truyền trùng gây hại (Hol và Cook, 2005) Akhtar và Siddiqui (2008)cũng cho thấy khi kết hợp Glomus intraradices, Pseudomonas alcaligenes, vàBacillus pumilus làm giảm sự nhân lên của tuyến trùng (56 - 66%) Ngoài ra khi bố

16

sung nắm AM cũng kích thích cây chủ sinh trưởng và phát triển, tăng khả năng ra

hoa và thụ phấn (Ploulton và ctv, 2001).

1.2 Những nghiên cứu liên quan nam rễ cộng sinh Mycorrhiza

Việc nghiên cứu mycorrhiza đang trở thành một hướng phát triển ở Việt Nam.Tuy nhiên các nghiên cứu còn mới và thường chỉ dừng lại ở mức độ phân lập, địnhdanh vai trò của mycorrhiza trong việc hấp thu lân trên cây trồng

Năm 2012, Nguyễn Thị Kim Liên và ctv đã phân lập được 16 loài thuộc 6 chinam AM trong đất trồng cam tại Quy Hợp, Nghệ An Đỗ Thị Xuân (2016) đã địnhdanh được bốn chi nam là Acaulospora, Entrophosphora, Glomus, Gigaspora trongdat trồng bắp, mè, ớt tại TP Cần Tho Lê Thị Hoàng Yến (2017) đã phân lập được

15 loài nam thuộc 8 chi nấm rễ cộng sinh AM trong đất trồng ngô tại Hà Nội

Bên cạnh đó Nguyễn Thị Minh và Nguyễn Thanh Nhàn (2016) đã tuyển chọnđược 2 chủng Arbuscular mycorrhizae (Gigaspara sp1, Acaulospora sp1) đề làmgiống sản xuất vật liệu sinh học

Gần đây, nhóm tác giả Lê Thị Kim Duyên và ctv (2019), Nguyễn Vũ Phong vàctv (2021) cũng đã nghiên cứu đặc điểm và xác định thành phần tồn tại của nắm rễnội cộng sinh trong đất trồng hồ tiêu

Tran Hoàng Siêu (2022) đã dé cập tổng quan các nghiên cứu về nam rễ nội cộngsinh tại Việt Nam bao gồm các nghiên cứu về phân lập và định danh nam AM dựatrên các đặc điểm hình thái trên các loại cây trồng khác nhau như hồ tiêu, bắp, ớt, lúa,bưởi da xanh Việc định danh nắm AM bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cặpprimer M13f và M13r từ nguồn nam AM trên cây nghệ và lim xanh Đồng thời cácnghiên cứu về ảnh hưởng các sản phẩm chứa nắm AM đến sinh trưởng của một sốcây trồng cũng được dé cập trong tổng quan trên

Đến nay việc nghiên cứu mycorrhiza trên thế giới rất phát triển Các nghiêncứu rat đa dạng chủ yếu là các nghiên cứu chuyên sâu như vai trò của mycorrhiza đến

sự hấp thu dinh dưỡng của cây trồng (Koide, 1991; Smith va ctv, 1994; Harrison và

ctv, 2002; Smith va ctv, 2011), anh hưởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, độ âm (Habte

và Soedarjo, 1996; Gavito và ctv, 2005) đến sự phát triển của nấm AM hay ứng dụng

17

mycorrhiza trong kiểm soát sinh hoc (Hol và Cook, 2005; Akhtar va Siddiqui, 2008;Wehner va ctv, 2010; Vos va ctv, 2014).

Amplified region — Molecular marker Primer(s) Target organism

SSU rDNA PCR VANSI Glomales

Genomic DNA PCR-RAPD OPA-02 and OPA-04 Glomus versiforms, G mosseae

OPA-18 and P124 G caledonium, Acaulospora laevis OPA-18 and P124 Gigaspora margarita, Scutellospora gregaria SSU rDNA PCR VANSI and NS21 G intraradices

Genomic DNA Competitive PCR PO and M3 G mosseae

ITS PCR-RFLP ITS1 and ITS4 Glomus sp., Scutellospora sp., Gigaspora sp.

SSU 1492 PCR NS71 and SSU1492’ Gigaspora sp.

Partial rDNA PCR-Partial SS38 and VANSI Roots and spores of AM

VANSI Scutellospora and Glomus

VAGIGA Gigasporaceae ITSI and ITS2 PCR ITSI and ITS2 G margarita

ITS PCR ITS! and ITS4 G mosseae and Gigaspora margarita

SSU rDNA PCR-RFLP LRI and FLR2 Subgroups of Glomales

PCR-nested FLR2-5.23 and FLR2-8.23 G mosseae, G intraradices

LRI-23.46 G roseae

28S rDNA PCR-SSCPs LSU-Primers Glomus sp.

SSU rDNA PCR NS31 and AMI Glomus sp.

SSU rDNA PCR-SSCP VANSI Subgroups of Glomaes

Nested PCR ITS, AMI Glomus sp.

ITS PCR-RFLP ITS1 and ITS4 G mosseae

ITS Nested PCR-SSCP Eukaryotic universal primer Glomus sp.

Glomus-specific ITS primer ITS Nested PCR ITSS and ITS4 Glomeromycota (except Archaeosporaceae)

ITS PCR SSU-Glom/LUS-Glom 1 Major groups within Glomeromycota

ITSS and ITS

Hình 1.11 Các nghiên cứu phân tử dựa trên marker phân tử về nam AM

(Trích dan bởi Velmurugan và ctv)

Việc phân loại nắm AM được tiến hành từ rất sớm ké từ khi nắm AM đượcnghiên cứu đến nay Gedermann và Trappe (1974) đã phân loại AM thành 44 loàithuộc 7 chi nấm của họ Endogonaceae Năm 1990, Morton và Benny đã phân loạiGomerales thành 3 họ là Glomeraceae, Acaulosporaceae va Gigasporaceae Trong

đó, họ Glomeraceae gồm 2 chi nam là Glomus và Sclerocystic; Acaulosporaceae gồm

2 chi nam là Acaulospora và Enirophospora; cuỗi cùng là 2 chi nam Gigaspora vàScutellospora thuộc họ Gigasporaceae.

Đến khi việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng dé phân loại nam

AM, SchiiBler và ctv (2001) đã tách nam AM ra khỏi Zygomycota và đưa chúng vàomột nhóm ngành mới là Glomeromycota đồng thời phân nhóm thành 4 bộ, 7 họ và 8chi nam dựa trên việc phân tích phân tử vùng gene SSU-rDNA

Năm 2011, Oehl và ctv đã phân loại nắm AM thành 3 lớp, 5 bộ và 29 chỉ nắmdựa trên việc phân tích phân tử một phan trình tự B-tubulin, SSU và LSU rRNA kếthợp với các đặc điểm hình thái nhứ màu sắc, hình dạng và cuống bào tử

18

Ngày nay, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về nắm

AM đã trở nên phố biến, các kỹ thuật được sử dụng như PCR, Nested PCR, RAPD,RFLP và việc thiết kế các primer chuyên biệt cho nắm AM hoặc chuyên biệt cho từng

loài cũng được nghiên cứu rộng rai.

Lee và ctv (2008) đã thiết kế cặp primer AML1/AML2 dựa trên vùng trình tự18S rDNA dé khuếch dai DNA của tat cả các nhóm nhỏ thuốc ngành nắm rễ cộng

sinh Glomeromycota, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện nắm rễ cộng sinh

Với kích thước sản phẩm khuếch đại khoảng 800bp, cặp primer AMLI/AML2 cho

thây hiệu quả cao cho việc nghiên cứu phát hiện nắm rễ cộng sinh.

Primer Nucleotide sequence (5-3) nt Target taxa (mainly)

SSUmAf1 TGG GTA ATC TIT TGA AAC TTY A 22 Acaulosporaceae, Archaeosporaceae, Diversisporaceae, Geosiphonaceae,

Gigasporaceae, Glomeraceae (GIGrA & G|GrB), Pacisporaceae SSUmAf2 TGG GTA ATC TIR TGA AAC TIC A 22 Ambisporaceae, Diversisporaceae, Geosiphonaceae, Paraglomeraceae SSUmAf — Mix SSUmAf1-2 (equimolar) 22 All AMF lineages

SSUmCf1 T ŒGC TCT TCA ACG AGG AATC_ 20 Archaeosporaceae (indirect evidence by amplification

of Ambispora fennica), Glomeraceae (mainly GIGrB) SSUmCf2 TAT IGE TCT TCA ACG AGG AATC 22 Paraglomeraceae

SSUmCf3 TAT TGC TCT TNA ACG AGG AATC 22 Acaulosporaceae, Ambisporaceae, Archaeosporaceae, Diversisporaceae,

Geosiphonaceae, Gigasporaceae, Glomeracea (mainly GIGrA), Pacisporaceae SSUmCf Mix of SSUmCf1-3 (equimolar) 20-22 All AMF lineages

LSUmAr1 GCT CAC ACT CAA ATC TAT CAA A 22 Acaulosporaceae

LSUmAr2 GCT CTA ACT CAA TTC TAT CGA T 22 Gigasporaceae

LSUmAr3 T GCT CTT ACT CAA ATC TAT CAA A 23 Acaulosporaceae, Diversisporaceae, Geosiphonaceae, Gigasporaceae,

Glomeraceae (GIGrA and GIGrB), Pacisporaceae

LSUmAr4 GCT CIT ACT CAA ACC TAT CGA 21 Paraglomeraceae

LSUmAr — Mix of LSUmAr1-4 (equimolar) 21-23 All AMF lineages

LSUmBr1 DAA CAC TCG CAT ATA TGT TAGA 22 Acaulosporaceae, Archaeosporaceae, Glomeraceae (GIGrA), Pacisporaceae LSUmBr2 AA CAC TCG CAC ACA IGT TAGA 21 Acaulosporaceae

LSUmBr3 AA CAC TCG CAT ACA IGT TAGA 21 Gigasporaceae

LSUmBr4 AAA CAC TCG CAC ATA TGT TAGA 22 Diversisporaceae, Geosiphonaceae, Glomeraceae, Paraglomeraceae,

(primer sequence was also found in amplicons from Ambispora

fennica and an Archaeospora sp.) LSUmBr5 AA CAC TCG CAT ATA TGC TAG A 21 Gigasporaceae, Glomeraceae (GIGrB)

LSUmBr Mix of LSUmBr1-5 (equimolar) 21-22 All AMF lineages

Hình 1.12 Bộ primer cải tiến khuếch dai DNA Glomeromycota theo Kriiger

Kriiger va ctv (2009) đã cai thiện các đặc tính phân tử của nganh

Glomeromycota bởi việc thiết kế bộ primer hỗn hợp với sản phâm khuếch đại khoản

1500 bp bao phủ một phần vùng SSU, toàn bộ vùng ITS và một phần vùng LSU Tuynhiên, sản phẩm khuếch đại quá dài cũng gây khó khăn cho việc giải trình tự; bêncạnh đó, việc sử dụng bộ mỗi hỗn hợp trong phản ứng nested PCR cũng gây khó khăn

19

cho việc thao tác Do đó sự kết hợp của bộ mồi này đến này chỉ sử dụng trong một sốnghiên cứu.

Ngoài việc phát hiện nắm rễ cộng sinh trong đất thông qua việc ly trích DNA

từ bào tử, nam rễ cộng sinh cũng được phát hiện dựa trên phản ứng nested PCR tạivùng gen SSU rDNA bởi 2 cặp primer LSU0061/LSU0599 và LSU4f/LSU7r đượcthiết kế bởi Kjøller và Rosendahl (2000) Trong luận án tiến sĩ của mình, Trần Thị

Dạ Thao (2012) cũng sử dụng bộ primer này dé thực hiện phát hiện nam rễ cộng sinh

mycorrh1za trên cây ngô tại vùng Đông Nam Bộ Việt Nam.

20

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2022 đến tháng 05/2023 tại phòng thí nghiệmChân đoán Bệnh học Thực vật và phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử thuộc Việnnghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thànhphố Hồ Chi Minh

2.2 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu

Nắm rễ nội cộng sinh Arbuscular mycorrhiza trên vùng đất trồng rau tại huyện

Củ Chi, thành phố Hồ Chi Minh

Hóa chất: KOH 10%, HCI 2%, Trypan blue 0,05%, đệm SDS, Isopropanol,ethanol 70%, bộ đệm T.E, Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1), Chloroform/Isoamyl Alcohol (tỷ lệ 24: 1), HyperLadder 1 Kb (Bioline), HyperLadder

100 bp (Bioline), agarose, Master mix 2x (Bioline), đệm T.A.E.

Thiết bị: may anh Compact Canon IXUS 190, Kính hiển vi CX43, kính soi nổiOlympus XZ51, Máy ly tâm 13.000 vòng, máy ly tâm 3.000 vòng, cân điện tử 4 số,máy PCR Bioer.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu thập, phân lập nắm rễ nội cộng sinh

2.3.1.1 Thu thập mẫu nắm rễ nội cộng sinh

Mau dat và rễ các loại rau ăn qua thuộc họ bau bí (bí dao, dua leo, khô qua) vàcây họ đậu (đâu đũa, đậu que) được thu thập tại vùng đất trồng rau thuộc xã TânThông Hội và Tân Thạnh Đông huyện Củ Chi thành phố Hồ Chí Minh Các điểm thu

mẫu được lựa chọn từ những vườn chuyên canh hoặc luân canh các loại rau ăn quả

thuộc ho bầu bí và họ đậu Mẫu đất và rễ cây ở mỗi vườn được thu ở 5 vị trí khác

nhau gồm 4 góc và trung tâm vườn sau đó trộn đều với nhau, đồng thời mẫu đât được

21

lay ở tầng đất 0 - 20 cm xung quanh gốc cây và cách gốc cây 20 — 30 cm Mỗi loạicây trồng tiến hành thu 10 mẫu đất và rễ Mẫu sau khi thu thập được chứa trong túizip và ghi mã mẫu, sau đó được chuyền về phòng thí nghiệm và tiễn hành phân tíchthành phần nắm AM.

2.3.1.2 Phương pháp phân lập bào tử từ đất

Mau đất sau khi thu thập được sử dụng ngay dé phân tích nam nội cộng sinh

hoặc bảo quản trong tủ mát (8 - 10 °C) đến khi sử dung cho quá trình tách bào tử nam

cộng sinh Bảo tử được tách khỏi đất theo kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết hợp với

ly tâm trong dung dich sucrose (50%) của Brundrett và ctv (1996).

Cân 50 g đất, loại bỏ các hạt đá to và rác thô trong mẫu đất sau đó cho vào cốcchứa 1 lít nước, khuấy đều và ngâm khoảng 30 phút cho nước hòa tan các hạt đất to.Khuấy đều dung dịch đất rồi dé yên khoảng 30 giây cho các thành phan đất to lắngxuống rồi gan dịch qua một loạt sàng có kích thước lần lượt là 1000 pm, 500 um và

40 um Quá trình lọc được lặp lại nhiều lần đến khi nước trên sang có màu trong Thuphan dat và bao tử trên sàng 40 tm cho vào các ông ly tâm thé tích 50 ml Sau đó chodung dịch succrose (50%) vào 2/3 ống ly tâm đã chứa mẫu đất và lắc đều Mẫu được

ly tâm với tốc độ 2000 vòng/ phút (trong 5 phút) Hút dịch nổi sau khi ly tâm cho quaray kích thước 40 wm và tiến hành rửa đường sucrose dưới vòi nước Thu lại bao tửtrên sàng 40 um sau đó quan sát và đếm mật số bao tử dưới kính soi nổi va quan sáthình thái dưới kính hiền vi

2.3.1.3 Xác định sự hiện diện của nắm cộng sinh trong rễ

Mau rễ sau khi thu thập được rửa sạch đất dưới vòi nước máy sau đó được sửdụng để nhuộm và quan sắt nam ré nội cộng sinh hoặc bao quản ở 4°C trong tủ lạnhđến khi sử dụng cho quá trình nhuộm màu Sự hiện diện của nam nội cộng sinh trong

rễ được nhận diện bằng cách tiến hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips vàHayman (1970) (có chỉnh sửa thời gian và nhiệt độ).

Cắt rễ thành từng đoạn ngắn khoản 1 cm Sau đó ngâm những đoạn rễ đã cắt

trong dung dịch KOH (10%) khoảng 20 - 30 phút (ở 80°C) Rửa mẫu rễ sau khi ngâm

KOH với nước đến khi hết màu nâu rồi tiếp tục ngâm mẫu rễ trong dung dịch HCI(2%) khoảng 10 phút để trung hòa lượng KOH còn trong mẫu rễ Rửa mẫu rễ lại với

pe:

nước rồi nhuộm với dung dịch Tryphan blue (0,05% trong lactoglycerol) khoảng 10

- 15 phút (ở 80°C) Rửa mẫu rễ nhiều lần với nước máy sau đó quan sát và ghi nhậncau trúc xâm nhiễm dưới kính hiển vi ở vật kính 40x Đồng thời tỉ lệ xuất hiện nắmcộng sinh được tính bằng công thức:

Tỉ lệ xuất hiện nam cộng sinh = Số đoạn rễ xuất hiện nam cộng sinh

x100/Téng số đoạn quan sát2.3.2 Định danh nấm rễ cộng sinh Arbuscular mycorrhiza

2.3.2.1 Định danh nắm cộng sinh dựa vào đặc điểm hình thái bào tử

Bào tử nắm cộng sinh sau khi ly tâm được quan sát cấu trúc dưới kính hiển vi

va được sang lọc và định danh ở mức chi nam theo mô tả của các tác gia Gerdermann(1963), Gerdemann và Trappe (1974) và Brundrett va ctv (1996), mô tả về hình dangcuống bảo tử (subtending hypha) của Oehl và ctv (2011), Walker và ctv (2012), sáchchuyên khảo về nam arbuscular mycorrhiza của Trần Thị Dạ Thảo va Bùi Cách Tuyến(2012) Đồng thời tham khảo tài liệu trực tuyến về mô tả loài của INVAM (cập nhật

năm 2022).

Hình 2.1 Thước chuan dùng cho tính kích thước và vẽ scale bar

(A: Trắc vi vật kính; B: Buồng đếm hồng cau)Các bào tử được quan sát và mô tả hình dạng, màu sắc dưới kính soi nỗi(Olympus SZ51), sau đó được nhuộm với thuốc thử Melzer và PVLG (1:1) dé quasát các cấu trúc thành bao tử, thành mầm (nếu có), cuống bao tử, khiên mam (nếu có)dưới kính hiển vi CX43 Các số liệu về hình thái bao tử được đo trên tổng số 30 bao

tử tương đồng về các cau trúc hình thái dưới kính hiển vi Các cau trúc của bao tửđược chụp ảnh bằng máy anh Compact Canon IXUS 190 Việc đo các kích thước của

23