BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BUOC DAU XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GENE VIRUS DENGUE SỬ DỤNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẺ
Realtime PCR 177 =
Xét nghiệm Realtime PCR sử dụng cặp môi trường và đầu dò huỳnh quang đặc hiệu cho từng loại huyết thanh DENV, cho phép định lượng RNA của virus một cách chính xác và nhanh chóng trong thời gian thực.
Phương pháp Realtime PCR là công cụ hiệu quả để chẩn đoán nhiễm sốt xuất huyết (SXH) ở giai đoạn sớm Để đạt được kết quả chính xác, mẫu huyết thanh nên được thu thập trong vòng 7 ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng.
Giải trình tự gene là một kỹ thuật quan trọng nhằm xác định trình tự nucleotide (A, T, G, C) trong chuỗi acid nucleotide của các gene, bao gồm cả gene mã hóa và không mã hóa cho protein chức năng Hiện nay, có ba thế hệ công nghệ giải trình tự đang được phát triển: thế hệ thứ nhất với các phương pháp của Maxam và Gilbert, Sanger; thế hệ thứ hai bao gồm các công nghệ như 454, Solexa, Ion Torrent, Illumina; và thế hệ thứ ba với công nghệ Pacbio.
Oxford Nanopore) (Hu và ctv, 2021; Slatko va ctv, 2018).
2.3.4.1 Các thé hệ của giải trình tự a Thế hệ thứ nhất
Theo nghiên cứu của Heather và Chain (2016), vào năm 1953, Watson và Crick đã phát hiện ra cấu trúc ba chiều của DNA Tuy nhiên, nghiên cứu này vẫn chưa hoàn thiện do khả năng đọc DNA còn hạn chế Do đó, các nhà khoa học cần phát triển phương pháp để xác định trình tự chuỗi protein.
Vào năm 1977, nhờ nỗ lực của các nhà khoa học, công nghệ Sanger đã được phát triển Phương pháp này dựa trên nguyên lý sử dụng bốn ống thí nghiệm chứa bốn loại ddNTP khác nhau, kết hợp với điện di trên gel polyacrylamide hoặc đánh dấu các đồng vị bức xạ, tạo ra tín hiệu phóng xạ tại vị trí tương ứng trên gel.
Sanger được coi là tiêu chuẩn vàng trong giải trình tự DNA nhờ độ chính xác cao, phù hợp cho chẩn đoán lâm sàng Kỹ thuật này có chi phí hợp lý, thường được sử dụng để xác định trình tự các vùng gene quan tâm Đặc biệt, Sanger có khả năng xử lý mẫu DNA chất lượng thấp Mặc dù không đọc được các đoạn dài như công nghệ giải trình tự thế hệ mới, phương pháp này vẫn có thể tạo ra số lần đọc lên tới 1000 cặp bazơ, rất hữu ích cho việc phát hiện đột biến trong bộ gene (Al-Shuhaib và Hashim, 2023).
Công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai, ra đời vào khoảng những năm 2000, đã cải thiện đáng kể hiệu suất của quá trình giải trình tự so với thế hệ đầu tiên Kỹ thuật này hoạt động bằng cách tạo ra hàng triệu đoạn đọc ngắn từ DNA được khuếch đại qua phương pháp PCR Hiện nay, các công cụ và phương pháp mới đang được phát triển, cho phép xác định trình tự bộ gene người hoàn chỉnh trong vòng chưa đầy một ngày với chi phí dưới 1000 USD (Bayés và ctv, 2012).
Giải trình tự thế hệ thứ hai, mặc dù có nhiều ưu điểm, vẫn gặp phải hạn chế như sai sót trong quá trình sao chép PCR và chiều dài đoạn đọc ngắn Để khắc phục những vấn đề này, giải trình tự thế hệ thứ ba đã ra đời, cho phép giải trình tự các phân tử đơn mà không cần nhân bản DNA trước Hiện nay, giải trình tự thế hệ thứ ba bao gồm công nghệ Single Molecule Real-Time Sequencing (SMRT) của Pacific Biosciences và Nanopore của Oxford.
Nanopore Technologies Hiện nay kỹ thuật này được ưa chuộng rat nhiều nhờ hiệu năng vượt trội của nó (Xiao và Zhou, 2020).
2.3.4.2 Giải trình tự thế hệ mới Nanopore
Công nghệ GTT thế hệ mới Nanopore cho phép phân tích DNA và RNA trực tiếp trong thời gian thực với độ dài đoạn lên đến 4 Mb Bằng cách ghi nhận tín hiệu dòng điện khi axit nucleic đi qua, công nghệ này cung cấp kết quả điện tích để giải mã trình tự DNA và RNA Một ưu điểm nổi bật là khả năng sử dụng mẫu lẻ, giảm thiểu yêu cầu về số lượng mẫu đầu vào so với các phương pháp GTT đoạn ngắn như Illumina Thiết bị có kích thước nhỏ gọn, thuận tiện cho việc di chuyển đến các vùng dịch bệnh Nhờ những ưu thế này, kỹ thuật Nanopore có thể được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y sinh, nông nghiệp và hơn thế nữa.
Dữ liệu giải trình tự thô từ máy giải trình tự gene thế hệ thứ ba như nanopore được định dạng dưới dạng file fast5, sử dụng định dạng dữ liệu phân cấp HDF5 để lưu trữ dữ liệu lớn và phức tạp Để chuyển đổi sang định dạng file Fastq, cần sử dụng phần mềm và công cụ chuyên dụng, cho phép hiển thị nucleotide và điểm chất lượng (quality score) Việc đánh giá chất lượng giải trình tự là bước quan trọng trong quy trình phân tích dữ liệu.
Trước khi phân tích dữ liệu, việc đánh giá chất lượng dữ liệu thô là cần thiết để đảm bảo độ chính xác cho các bước xử lý tiếp theo Các công cụ đánh giá chất lượng dữ liệu thô sẽ thống kê dựa trên nhiều tiêu chí khác nhau.
Tổng số đoạn trình tự
Chất lượng theo vị trí base (từng trình tự)
Chất lượng trung bình theo đoạn trình tự Độ dài đoạn trình tự
+ + + + + + Số lượng các đoạn lặp lại
Chỉ số chất lượng giải trình tự (Q-Score) là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác trong các bước phân tích gen sau này, thể hiện độ chính xác của từng nucleotide Điểm chất lượng được tính theo công thức Q = -10log10P, trong đó P là xác suất xảy ra lỗi trong quá trình đọc Q-Score cao đồng nghĩa với độ chính xác cao hơn trong phân tích dữ liệu gen (Cock và cộng sự, 2010).
QC: thể hiện mức độ tin cậy là 90%
QC : thé hiện mức độ tin cậy là 99%
QC0: thể hiện mức độ tin cậy là 99.9%
QC@: thé hiện mức độ tin cậy là 99.99%
Dựa trên kết quả đánh giá như trên mà mỗi trình tự đọc sẽ được xử lý phù hợp như loại bỏ adapter, loại các base có Q-Score thấp.
Lắp ráp bộ gene dựa trên trình tự tham chiếu
Chất lượng đoạn đọc Fastq sau khi loại bỏ các trình tự adapter và các base có Q-score thấp sẽ được sử dụng để lắp ráp trình tự Có hai phương pháp lắp ráp trình tự chính: lắp ráp de novo và lắp ráp dựa trên trình tự tham chiếu.
Lắp ráp de novo là quá trình kết hợp các trình tự đọc mà không dựa vào trình tự tham chiếu, trong khi lắp ráp dựa trên trình tự tham chiếu là việc sắp xếp các trình tự đọc với bộ gene tham chiếu Một số công cụ phổ biến cho việc lắp ráp bộ gene bao gồm BWA, Bowtie, Novoalign, SOAP2, BFAST, SSAHA2, MPscan, GASSST và PerM, trong đó BWA và Bowtie2 được sử dụng rộng rãi nhất Kết quả của quá trình mapping thường được xuất ra dưới dạng file SAM.
(sequence alignment/map) hoặc file BAM (binary alignment/map).
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa diém nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ 01/03/2023 đến 30/08/2023. Địa điểm nghiên cứu: Phòng Arbovirus, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur
3.2.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm
Chương trình mục tiêu quốc gia về giám sát và phòng chống sốt xuất huyết đã sử dụng 14 mẫu huyết thanh từ những bệnh nhân dương tính với virus dengue (DENV).
(1-4) được thu thập và lưu trữ tại Viện Pasteur TP.HCM.
Hóa chat dùng cho tách chiết: QIAamp Viral RNA kit (Cat#52906, QIAGEN) Hóa chất dùng cho Realtime PCR: SuperScriptTM III Reverse Transcriptase
Hóa chất dùng cho giải trình tự: TURBO DNA-freeTM (CatAM1907, Invitrogen),
Nguồn gốe mẫu thí nghiệm . sec 12010001102.08001258 80p 16
Realtime PCR 06
Kiểm tra chất lượng mẫu bang Multiplex Realtime RT-PCR cho phép phát hiện đồng thời 4 loại virus dengue (DENV) Mỗi probe được sử dụng cho phản ứng tham khảo theo nghiên cứu của Santiago và cộng sự (2013), được tối ưu hóa bởi PXN Arbovirus tại Viện Pasteur TP.HCM Bộ kit SuperScript III Reverse Transcriptase (Cat#18080093, Invitrogen) và thiết bị Realtime được sử dụng trong quy trình này.
PCR QuantStudio5 (Cat#A34322, Applied Biosystems) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Chỉ chọn những mẫu có giá trị Ct < 28 Nếu số lượng mẫu đạt yêu cầu Ct không đủ, cần thực hiện lại quy trình từ bước chọn mẫu.
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng Multiplex Realtime RT-PCR.
Sinh phẩm Nồngđộ Thể tích cho 1 phản ứng (ul)
Superscript II] RT/Platinum Taq Mix 0.5
Probe và Probe 10uM 0.45 cặp môi D3F 0.25
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex Realttme RT-PCR
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ lặp
Chuẩn bị thư viện cho giải trình tue ccccccccccccessessessessessessessesseseeseessesseeseeees 19 1 Kiểm tra in silico trình tự primer cho giải trình tự Dengue
Tổng hop dsDNA o .cccccccscessesssessesseeseesesssessesssetseessesseesessiesseetieesessnesseeseeeiees 20 3.3.2.5 Chuẩn bị thư vidi oo c.c.cccecccccceccceceecssesessseesececsesueeesesecscsseessesecsessseeeseeseseeeeeeees 22 3.3.3 Phân tích kết quả giải trình tự . -2-©22222222222E22E+2EE22E22E22E2EESEEcrkrerrees 23 Trãi TC Tƒ ee 24 CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 52 22E22E22E22EE 2E rErrerree 25 4.1 Kiểm tra mẫu huyết thanh đầu vào bằng phương pháp Realtime PCR
Tổng hợp DNA sợi đôi từ DNA sợi đơn sử dụng các cặp môi đặc hiệu phát hiện bộ gene virus Dengue.
Kích thước của từng cặp mồi được thiết kế dựa trên hai yếu tố chính: công nghệ giải trình tự Nanopore và khả năng kéo dài của enzyme trong bộ kit.
Chiều dài cặp mồi phù hợp cho công nghệ giải trình tự Nanopore cần được tính toán cẩn thận, với khả năng giải đoạn amplicon lên đến 4 mb (Oxford, 2022) Enzyme trong bộ kit Platinum Taq DNA Polymerase có thể kéo dài đoạn amplicon tối đa 4 kb, do đó, chiều dài cặp mồi phải nằm trong khoảng 1 - 2 kb để đảm bảo không vượt quá giới hạn của enzyme Bộ gene DENV có kích thước khoảng 11 kb, vì vậy việc lựa chọn chiều dài cặp mồi thích hợp là rất quan trọng để phù hợp với nguyên lý hoạt động của công nghệ giải trình tự Nanopore.
Tiến hành tổng hợp DNA sợi đôi bằng bộ kit Platinum Taq DNA Polymerase (Cat#10966018, Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, bao gồm các bước cụ thể để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác trong quy trình.
Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp gồm các thành phần như Bảng 3.6
Bảng 3.6 Thanh phan phản ứng tổng hợp dsDNA
Thành phần Thể tích cho 1 phản ứng (uL)
Platinum taq DNA polymerase (5U/ pL) 0.1
Bước 2: Đặt vào may PCR MiniAmp Thermal Cycler (Cat#A37834, Applied Biosystems) theo chuong trinh nhiét tai Bang 3.7
Bang 3.7 Chương trình nhiệt phản ứng tổng hop dsDNA
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ lặp
Tiên biến tính 94°C 2 phut Ix
Bảng 3.7.(tt) Chương trình nhiệt phản ứng tổng hợp dsDNA
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ lặp
Sau khi sản xuất DNA sợi đôi, bước tiếp theo là chuẩn bị thư viện cho việc giải trình tự trên hệ thống Nanopore Quy trình giải trình tự được thực hiện qua ba giai đoạn, với hai phương pháp khác nhau.
Cách 1: Các mẫu DENV được giải kèm với các mẫu virus khác.
Bước 1: Sử dụng bộ kit QubitTM dsDNA HS Assay Kit (Cat#Q32851, Life Technologies) để đo nồng độ từng mẫu Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bao gồm các bước cụ thể.
Pha dung dịch huỳnh quang — buffer trên từng mẫu theo tỷ lệ 1/200 (1 pL huỳnh quang + 199 wL buffer).
Trộn mẫu với hỗn hợp huỳnh quang — buffer vừa pha theo tỷ lệ 1/200 ( 1 wL mẫu
+ 1 ụL dung dịch huỳnh quang — buffer).
Standard 1 và standard 2 có thé tích là 190 uL dung dich huỳnh quang — buffer Tiến hành đo lần lượt từng mẫu theo hướng của nhà sản xuất.
Bước 2: Pool amplicon và gắn barcode, sử dụng bộ kit Rapid Barcoding Kit 96
(Cat#SQK-RBK110.96, Oxford Nanopore Technologies) va thuc hién quy trinh theo các bước như sau:
Lay plate mới Thêm 2,5 pL HạO vào mỗi giếng.
Thêm 5 pL sản phẩm pool PCR Sau đó spin down.
Thêm 2,5 uL barcode Sau đó spin down. Đặt máy PCR MiniAmp Thermal Cycler (Cat#A37834, Applied Biosystems) ở nhiệt độ 30°C 2 phút va 80°C 2 phút trong vòng 1 chu kỳ.
Bước 3: Pool thư viện các mẫu.
Bước 4: Tinh sạch thư viện sử dụng bộ kit AMPure XP Beads (Cat#A63881,
Beckman Coulter), thực hiện quy trình theo hướng dẫn của nha sản xuất.
Bước 5: Do thư viện về nồng độ tối ưu theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit Rapid
Quy trình được thực hiện theo công thức sau: target quantity loading pool concentration Volume library pool Trong đó:
Volume library pool: Thể tích thư viện (uL)
Pool concentration: Số do Qubit (ng/ uL)
Ta có, Final volume EB là 11 pL.
Vay, volume EB (uL)= 11 — volume library pool (uL).
Thêm 1 pL Rapid Adapter F Sau đó giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Bước 7: Đặt máy giải trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Các bước thực hiện tương tự với cách 1, nhưng ở bước 5, cách 2 khác biệt: Đo thư viện để xác định nồng độ tối ưu theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Cần 9 uL 50 ng thư viện Ap dụng công thức: C1V1= C2V2
Cl la nồng độ thư viện (ng)
VI là thể tích thư viện (uL)
C2 là nồng độ tối ưu (ng)
V2 là thé tích tối ưu (wL)
Ta có, C2 là 50 ng và V2 là 9 uL Từ đó ta suy ra được V1.
3.3.3 Phân tích kết quả giải trình tự
Bước 1: Từ kết quả thu được dưới dạng điện tích (Fast5), tiến hành chuyển đổi dữ liệu thành dạng nucleotide (A, T, G, C) (FastQ) Kết quả này sẽ cung cấp dữ liệu thô để phân tích kết quả GTT.
Bước 2: Đánh giá chất lượng đoạn đọc (FastQC) bằng phần mềm UseGalaxy.
Bước 3: Lắp ráp thành bộ gene hoàn chỉnh dựa trên trình tự tham chiếu từ NCBI, sử dụng phần mềm UseGalaxy dé lắp ráp.
Bước 4 trong phân tích kết quả GTT yêu cầu xem xét hai tiêu chí chính: độ phủ sâu (X) và độ phủ ngang (%) Độ phủ sâu phản ánh độ tin cậy của kết quả thông qua số lần lặp lại (X), trong khi độ phủ ngang cho biết tỷ lệ phần trăm bộ gene được xác định.
Kết quả realtime được xử lý bằng phần mềm design and analysis software v1.5.2, quantstudio 3 and 5 systems.
Trình tự các cặp primer được kiểm tra bang phần mềm annhyb 4.946.
Các dữ liệu GTT được xử lý và đánh giá thông qua website usegalaxy phiên bản 23.0 Đầu tiên, chất lượng đoạn đọc được kiểm tra bằng công cụ FastQC (phiên bản 0.11.9) Sau đó, các đoạn đọc được lắp ráp thành bộ gene hoàn chỉnh bằng công cụ Map với minimap2 (phiên bản 2.26) Cuối cùng, chất lượng kết quả GTT được đánh giá bằng công cụ QualiMap BamQC (phiên bản 2.2.2d).
CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kiểm tra mẫu huyết thanh đầu vào bang phương pháp Realtime PCR 4.1.1 Chọn mẫu
Bang 4.1 Kết qua các mẫu được chọn dé thực hiện Reatime PCR
Stt Mã sô mẫu Serotype Loai mau
Trong nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng tổng cộng 14 mẫu huyết thanh từ bệnh nhân dương tính với virus Dengue (DENV) thuộc các serotype 1-4, được lưu trữ tại Viện Pasteur TP.HCM Cụ thể, có 4 mẫu thuộc DENV-1 (0886/22, 0890/22, 1042/22, 1052/22), 6 mẫu thuộc DENV-2 (1047/22, 1048/22, 1073/22, 1127/22, 1129/22, 1212/22), 1 mẫu thuộc DENV-3 (VL-03), và 3 mẫu thuộc DENV-4 (1040/22, 1075/22, 1225/22).
Bang 4.2 Két qua Multiplex Realtime RT-PCR 4 type Dengue virus
Stt Mã sô mẫu Serotype Gia trị Ct
Bảng 4.2.(tt) Kết qua Multiplex Realtime RT-PCR 4 type Dengue virus
Stt Mã số mẫu Serotype Gia tri Ct
Kết quả từ Bảng 4.2 cho thấy có 7 trong số 14 mẫu đã chọn đạt yêu cầu Ct đầu vào (Ct< 28), với giá trị Ct dao động từ 15 đến 23 Cụ thể, mẫu 0890/22 có Ct là 22, mẫu 1042/22 có Ct là 23, mẫu 1127/22 có Ct là 22, mẫu 1129/22 có Ct là 24, mẫu 1212/22 có Ct là 20, mẫu VL-03 có Ct là 15 và mẫu 1040/22 có Ct là 23 Trong khi đó, 7 mẫu còn lại gồm 0886/22, 1052/22, 1047/22, 1048/22, 1073/22, 1075/22 và 1225/22 không đạt yêu cầu với giá trị Ct cao hơn 28.
Ct dao động từ 28 đến 31.
4.2 Chuẩn bị thư viện và giải trình tự trên hệ thống Nanopore
4.2.1 Kiếm tra in silico trình tự các cặp primer
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra in silico primer DENV-1
Kíchthước Tỷ lệ °° Tén Trình tự primer (5' - 3') khuéch dai bắt cặp
Bảng 4.3.(tt) Kết quả kiểm tra in silico primer DENV-1 ed thước tý lệ
- Tên Trinh tự primer (5' - 3') khuéch đại bắt cặp
Kết quả in-silico cho thấy có 7 cặp primer tương thích với bộ gene DENV-1, bao gồm các cặp 1F-4R, 5F-8R, 9F-11R, 12F-14R, 15F-17R, 18F-20R và 21F-23R Tỷ lệ bắt cặp của các primer này dao động từ 81% đến 100%, với kích thước mỗi cặp primer từ 1257 bp đến 2179 bp, cho thấy sự phù hợp để tổng hợp DNA sợi đôi của DENV-1.
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra in silico primer DENV-2
Số Bich thước Ty lệ
- Tên Trinh tự primer (5' - 3') khuéch dai bắt cặp
Bảng 4.4.(tt) Kết quả kiểm tra in silico primer DENV-2
Kích thước Ty lệ °° Tén Trinh tự primer (5' - 3') khuếch đại bắt cặp me (bp) (%)
Kết quả in-silico ở Bang 4.4 cho thấy có 6 cặp primer bắt cặp với bộ gene DENV-2, bao gồm 1F-4R, 5F-8R, 9F-12R, 13F-16R, 17F-20R, với tỷ lệ bắt cặp từ 81% đến 100% và kích thước từ 1737 bp đến 2033 bp Tuy nhiên, cặp 21F-23R chỉ đạt tỷ lệ bắt cặp 52% Mặc dù không đủ các cặp mồi để tổng hợp DNA sợi đôi của DENV-2, nghiên cứu vẫn tiếp tục được thực hiện cho cả 4 chủng DENV.
Bang 4.5 Kết quả kiểm tra in silico primer DENV-3
Kích thước Ty lệ w Tên Trinh tự primer (5' - 3') khuéch dai bắt cap me (bp) (%)
Kết quả in-silico ở Bang 4.5 cho thấy có 6 cặp primer tương thích với bộ gene DENV-3, bao gồm các cặp 1F-4R, 5F-8R, 9F-12R, 13F-16R, 17F-20R và 21F-24R Tỷ lệ bắt cặp của các cặp primer này dao động từ 90,95% đến 100%, với kích thước mỗi cặp primer cũng có sự biến đổi nhất định.
1698 bp đến 2329 bp Tỷ lệ và kích thước nay là phù hợp dé tổng hợp DNA sợi đôi của
Bang 4.6 Két qua kiém tra in silico primer DENV-4
Số Tên Trình tự primer (5' - 3') Kích thước Ty lệ cặp khuếch đại bắt cặp
Kết quả in-silico cho thấy có 6 cặp primer có khả năng bắt cặp với bộ gene DENV-4, bao gồm các cặp 1F-4R, 5F-8R, 9F-12R, 13F-16R, 17F-20R và 21F-24R Tỷ lệ bắt cặp của các cặp primer này dao động từ 90,5% đến 100%, với kích thước mỗi cặp primer từ 1690 bp đến 2008 bp, cho thấy tính khả thi trong việc tổng hợp DNA sợi đôi.
Bảng 4.7 Kết quả chuẩn bị thư viện DNA của 7 mẫu DENV (1-4) cho giải trình tự
Mã số Nongdé Pha loãng DNA Index Nong độ thư Pha loãng về mẫu dsDNA (0,2ng/uL) viện 2nM
Bảng 4.7.(tt) Kết quả chuẩn bị thư viện DNA của 7 mẫu DENV (1-4) cho giải trình tự
DNA Nước I5 17 ngHL nM Thư Nước