Báo cáo thực tập vi sinh

c Dựa vào công dụng: - Môi trường chọn lọc: là môi trường đảm bảo sự phát triển ưu thế của một loại hoặc một nhóm vi sinh vật xác định nào đó VD: môi trường dùng để phân lập hoặc nuôi cấ

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP.HCM

Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH

(Năm học 2022 – 2023) Nhóm 16

Thành phố Hồ Chí Minh Ngày 09/03/2023

Mục lục

Phần chuẩn bị môi trường và các thao tác 2

Chủ đề 1: Phương pháp phát hiện vi sinh vật 4

Chủ đề 2: Quan sát hình thái vi sinh vật 11

Chủ đề 3: Phương pháp định lượng vi sinh vật 12

Chủ đề 4: Kiểm sát tăng trưởng vi sinh vật 18

Chủ đề 5: Biến dưỡng ở vi sinh vật 21 Bảng phân công nhiệm vụ

báo cáo.

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THAO TÁC VÔ TRÙNG, BẢO QUẢN

GIỐNG VI SINH VẬTI/ Môi trường:

- Các muối có gốc NH , NH cung cấp N cho vi sinh vật4+ 3

- Nguồn cung cấp O đến từ không khí

2 Phân loại:

a) Dựa vào thành phần:

- Môi trường tự nhiên: dùng các sản phẩm có trong tự nhiên như sữa, huyết thanh, khoai tây, cám, đường,…Thành phần hóa học của những sản phẩm này thường phức tạp và không ổn định

- Môi trường tổng hợp: dùng các chất có thành phần hóa học xác định để pha chế nên môi trường

- Môi trường bán tổng hợp: kết hợp việc dùng các sản phẩm tự nhiên và các hóa chất tổng hợp (cao nấm men, peptone, tryptone,…)

b) Dựa vào tính chất vật lý:

- Môi trường lỏng hay môi trường dịch thể

- Môi trường rắn hay môi trường chứa 1,5 - 2% agar hoặc 10 – 20% gelatin

- Môi trường rắn mềm là môi trường có chứa 0,35 – 0,7% agar

c) Dựa vào công dụng:

- Môi trường chọn lọc: là môi trường đảm bảo sự phát triển ưu thế của một loại hoặc một nhóm vi sinh vật xác định nào đó (VD: môi trường dùng để phân lập hoặc nuôi cấy vi sinhvật cố định đạm, vi khuẩn nitrat hóa,…)

- Môi trường phân lập: là môi trường làm một loại hoặc một nhóm vi sinh vật xác định nào

đó có biểu hiện khác

- Môi trường tăng sinh: là môi trường mà vi sinh vật nào cũng sống được và tăng trưởng bình thường

3 Nguyên tắc khi chuẩn bị môi trường:

- Xác định mục đích và loại vi sinh vật sử dụng để sử dụng môi trường phù hợp

- Biết rõ các nhu cầu của vi sinh vật về các chất dinh dưỡng và đặc điểm trao đổi chất chủ yếu của chúng

- pH, yếu tố hữu cơ, vô cơ, thế oxi hóa khử, nồng độ các chất dinh dưỡng đưa vào phải thích hợp, không chứa các yếu tố độc hại và hoàn toàn vô trùng

4 Các môi trường:

II/

Phương pháp vô trùng:

1 Các phương pháp vô trùng:

- Tia UV, gama vô trùng vật chứa

- Nhiệt độ và áp suất (121 độ C, 1atm, 20 phút đến 30 phút)

- Màng lọc 0,2m đến 0,4m / lỗ

2 Phương pháp vô trùng sử dụng trong các bài thực tập vi sinh:

- Bước 1: Sắp xếp, kiểm tra lại dụng cụ cần thiết trước khi bước vào thí nghiệm

- Bước 2: Vệ sinh tay, dụng cụ, khu vực thí nghiệm bằng cồn 70 độ

- Bước 3: Bật ngọn lửa đèn cồn và lưu ý chỉ thao tác thí nghiệm trong phạm vi bán kính 20cm so với ngọn lửa đèn cồn

- Bước 4: Bắt đầu thí nghiệm

- Bước 5: Kết thúc thí nghiệm thì tắt đèn cồn và ghi chú (đối với đĩa petri thường để úp ngược xuống, trừ bài kiểm soát tăng trưởng vi sinh vật)

- Bước 6: Vệ sinh tay, dụng cụ, khu vực thí nghiệm lại bằng cồn 70 độ

- MgSO (3g/L)4

- Gause 1X pha sẵn (NaCl, KNO , FeSO )3 4

- Tinh bột 2% 20g/L

- Agar 2% 20g/L

CHỦ ĐỀ 1: PHÁT HIỆN VI SINH VẬTI/ Nguyên tắc:

- Có nhiều phương pháp để phảt hiện các chủng vi sinh vật trong tự nhiên Về nguyên tắc cóthể chia thành ba nhóm là các phương pháp dựa trên kiểu hình, các phương pháp dựa trên tính miễn dịch và các phương pháp dựa trên DNA

- Vi sinh vật sẽ phát triển và tăng sinh trong một môi trường phù hợp, vì thế sau một khoảngthời gian nhất định nếu sống trong môi trường phù hợp thì vi sinh vật sẽ hình thành sinh khối làm đục môi trường (môi trường lỏng) hoặc tạo 1 lớp sinh khối trên bề mặt nuôi cấy (môi trường rắn)

- Phát hiện vi sinh vật bằng môi trường chọn lọc: Môi trường chọn lọc là môi trường chứanhững chất thiết yếu đối với sự sinh trưởng của chủng vi sinh vật mục tiêu Do đó có thể

sử dụng các loại môi trường có thành phần phù hợp với từng loại vi sinh vật để phân lậphoặc phát hiện chủng cần tìm trên mẫu thử nghiệm:

o Môi trường LB : Vi khuẩn như E coli, Bacilus subsilit, Lacto Bacilus,…

o Môi trường PGA : Nấm mốc

o Môi trường Hansen : Nấm men

o Môi trường Gauss : Xạ khuẩn

II/ Kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn:

1 Phương pháp pha loãng và trải đĩa:

a) Dụng cụ:

- Ống nghiệm chứa mẫu vi sinh vật

- Ống nghiệm chứa nước muối sinh lý

- Pipetman 100 – 1000L, pipetman 10 - 100L và các đầu tip phù hợp

- Đèn cồn, bật lửa, ly đựng rác, ly chứa cồn để đựng que trải, bút lông, bông gòn

- Đĩa petri môi trường Hansen và Gause

- Que trải

b) Quy trình

- Vô trùng khu vực làm việc, sắp xếp dụng cụ thuận tay, khử trùng tay

- Đảm bảo các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng trước ngọn lửa đèn cồn

- Dùng micropipette hút 1mL mẫu VSV cho vào ống nghiệm chứa 9mL nước muối sinh lý

và tiếp tục pha loãng bậc 10 đến 10 , 10 -1 -2 -3

Lưu ý:

- Luôn thực hiện thao tác trong bán kính 20cm xung quanh đèn cồn để đảm bảo vô trùng

- Khi thực hiện hút các mẫu không được để không khí lọt vào

- Đốt cồn trên que trải 2 lần và để nguội rồi mới bắt đầu trải

- Trải nhẹ, đều tay để tránh làm rách môi trường và trải đến khi mẫu khô

c) Kết quả:

Môi trường Gause Môi trường Hansen

- Ở trên 3 đĩa môi trường Gauss và 3 đĩa môi trường Hansen đều có khuẩn lạc xuất hiện và pháttriển trên bề mặt thạch

- Ở đĩa môi trường Gauss : Xuất hiện khuẩn lạc có hình thái nhỏ, hơi ngả vàng, khô và nằm đều trên

bề mặt môi trường thạch => nấm men

- Ở đĩa môi trường Hansen : Xuất hiện khuẩn lạc có hình thái nhỏ, sợi khuẩn ty nhỏ, trắng đục mọc

trên đĩa thạch => xạ khuẩn

- Khuẩn lạc trên đĩa bị ít vì ở độ pha loãng 10 số lượng VSV có trong mẫu bị giảm bớt nên số-3

khuẩn lạc cũng bị ít đi theo Độ pha loãng càng thấp tỉ lệ thuận với mật độ khuẩn lạc có trên đĩa

2 Phương pháp ria:

a) Dụng cụ:

- Ống nghiệm chứa vi sinh vật

- Đèn cồn, bật lửa, bút lông

- Ly đựng rác, bình xịt cồn 70 độ, bông gòn.

- Que cấy

- Đĩa petri môi trường LB

b) Quy trình:

- Sắp xếp dụng cụ, kiểm tra dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm

- Vệ sinh khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Bật đèn cồn, hơ que cấy cho nóng đỏ, sau đó để nguội

- Đưa que cấy vào để lấy chủng

- Cho que cấy vào ria trên mặt dĩa theo quy tắc zig zắc như sơ đồ minh họa bên dưới

- Hơ nóng lại que cấy rồi tắt đèn cồn

- Vệ sinh lại khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Ghi chú sau đó đem ủ trong điều kiện thích hợp rồi ghi nhận kết quả

Sơ đồ hóa quy trình:

Lưu ý:

- Hơ ống chủng sau khi mở bông và trước khi đóng bông lại, hơ đĩa petri trước thao tác và sau khi thao tác xong

- Phải để đĩa petri khi mở hướng về phía ngọn lửa đèn cồn

- Thao tác trong vòng bán kính 20cm đèn cồn để đảm bảo vô trùng

1 Từ môi trường lỏng sang lỏng:

- Sắp xếp dụng cụ, kiểm tra dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm

- Vệ sinh khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Bật đèn cồn, hơ que cấy cho nóng đỏ, sau đó để nguội

- Đưa que cấy vào ống chủng vi sinh vật để lấy chủng

- Đưa que cấy đã có chủng vào ống môi trường lỏng và khua nhẹ que cấy trong dung dịchcủa ống môi trường lỏng

- Tắt đèn cồn, kết thúc thí nghiệm

- Vệ sinh lại khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Ghi chú và đem ủ trong điều kiện thích hợp rồi ghi nhận kết quả

Lưu ý:

- Thao tác trong vòng bán kính 20cm đèn cồn để đảm bảo vô trùng

- Lắc đều ống chủng vi sinh vật trước khi lấy

- Hơ ống nghiệm chủng và môi trường lỏng sau khi lấy bông ra và trước khi đóng bông lại

2 Từ môi trường lỏng sang rắn:

- Sắp xếp dụng cụ, kiểm tra dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm

- Vệ sinh khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Bật đèn cồn, hơ que cấy cho nóng đỏ, sau đó để nguội

- Đưa que cấy vào ống chủng vi sinh vật để lấy chủng

- Đưa que cấy đã có chủng vào ống môi trường rắn và ria zic zắc trên ống thạch nghiêng

- Tắt đèn cồn, kết thúc thí nghiệm

- Vệ sinh lại khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Ghi chú và đem ủ trong điều kiện thích hợp rồi ghi nhận kết quả

Lưu ý:

- Thao tác trong vòng bán kính 20cm đèn cồn để đảm bảo vô trùng

- Lắc đều ống chủng vi sinh vật trước khi lấy

- Hơ ống nghiệm chủng và môi trường lỏng sau khi lấy bông ra và trước khi đóng bông lại

- Phải hơ que cấy từ đầu cấy đến đụng cán để khi đưa sâu vào ria ống thạch nghiêng vẫnđảm bảo vô trùng

3 Từ môi trường rắn sang lỏng:

- Sắp xếp dụng cụ, kiểm tra dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm

- Vệ sinh khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Bật đèn cồn, hơ que cấy cho nóng đỏ, sau đó để nguội

- Đưa que cấy vào ống chủng thạch nghiêng để lấy chủng

- Đưa que cấy đã có chủng vào ống môi trường lỏng và khua nhẹ que cấy trong dung dịchcủa ống

- Tắt đèn cồn, kết thúc thí nghiệm

- Vệ sinh lại khu vực thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ

- Ghi chú và đem ủ trong điều kiện thích hợp rồi ghi nhận kết quả

Lưu ý:

- Thao tác trong vòng bán kính 20cm đèn cồn để đảm bảo vô trùng

- Lắc đều ống chủng vi sinh vật trước khi lấy

- Hơ ống nghiệm chủng và môi trường lỏng sau khi lấy bông ra và trước khi đóng bông lại

- Phải hơ que cấy từ đầu cấy đến đụng cán để khi đưa sâu vào lấy chủng ở ống thạchnghiêng vẫn đảm bảo vô trùng

c) Kết quả:

- Sau thời gian ủ thì ống môi trường lỏng được cấy đã xuất hiện sinh khối (ống bị đục)

d) Nhận xét:

- Phương pháp cấy từ rắn sang lỏng dùng để duy trì sự phát triển, giữ giống của vi sinh vật,

ta phát hiện vi sinh vật nhờ sự tăng sinh trong ống môi trường được cấy khiến ống đục

4 Sơ đồ hóa các quy trình kỹ thuật cấy vi sinh vật:

CHỦ ĐỀ 2: QUAN SÁT VI SINH VẬT TRÊN KÍNH HIỂN VI VÀ

KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA PETRII/ Nguyên tắc:

- Tùy vào kích thước, vi sinh vật có thể được quan sát bằng mắt thường (quan sát thô) hoặc cần đến những thiết bị như kính lúp, kính hiển vi,…

- Ở đây ta sẽ quan sát vi sinh vật ở 2 mức độ:

+ Quan sát thô: dựa trên khuẩn lạc (mỗi tế bào vi sinh vật phát triển thành một tập hợp trên đĩa petri gọi là khuẩn lạc, ta có thể dùng phương pháp trải đĩa hay ria với môi trường thích hợp cho

vi sinh vật), từng loại vi sinh vật khác nhau sẽ hình thành dạng khuẩn lạc khác nhau và ta có thể quan sát bằng mắt thường

+ Quan sát bằng kính hiển vi: Kính hiển vi là công cụ quan trọng trong nghiên cứu hình thái vànhận diện vi sinh vật Kính hiển vi được thiết kế để có tính năng khác nhau nhằm đáp ứng yêucầu cho phép phóng đại và quan sát rõ, chân thật các đối tượng vi sinh vật, nội bào quan khácnhau

II/ Quan sát vi sinh vật trong kính hiển vi:

coli, có hiện tượng

nảy chồi, trong

bào tử

Xạ khuẩn Trắng

đục, ngà vàng, tâmlõm (có chấm đenhoặc trắng), răng cưa

Vi khuẩn E coli

Nhỏ, tròn, bóng

ẩm, màu trong

hơi ngà

CHỦ ĐỀ 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬTI/ Xác định tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:

1 Nguyên tắc:

- Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép định lượng các tế bào vi sinh vật sống hiện diện trong mẫu Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy

2 Thí nghiệm:

a) Dụng cụ thí nghiệm:

- Đĩa petri môi trường LB Agar, ống nghiệm chứa huyền phù E coli cần xác định mật độ (ởnhóm 16 huyền phù E coli có OD610nm là xấp xỉ 0,5)

- Đèn cồn, bật lửa, que trải, bông gòn, ly đựng rác, bút lông

- Pipetman 100 – 1000L, pipetman 10 - 100L và các đầu tip phù hợp

- Eppendorf chứa 0,9ml nước muối sinh lý 0,85%

b) Quy trình thực hiện trải để tạo khuẩn lạc:

Các đĩa Petri đã ghi chú

*Lưu ý:

- Vệ sinh nơi thí nghiệm, dụng cụ và tay bằng cồn 70 độ trước và sau khi thí nghiệm

- Toàn bộ thao tác trong quá trình thí nghiệm phải được thực hiện trong bán kính 20cm xung quanh đèn cồn để đảm bảo vô trùng

- Ghi chú trên eppendorf và petri trước khi thực hiện thí nghiệm

- Trong quá trình hút huyền phù phải đảm bảo không có bọt khí lọt vào

- Khi hút huyền phù tế bào E coli từ ống nghiệm thì dùng pipetman 100 – 1000L, khi hút huyền phù tế bào đã pha loãng từ eppendorf này sang eppendorf khác thì dùng pipetman 10 – 100L

- Lắc kỹ mỗi eppendorf vừa được pha loãng rồi mới tiến hành hút mẫu pha loãng tiếp

- Khi sát trùng que trải thì phải đảm bảo toàn bộ cồn trên que đã cháy hết rồi mới nhúng vào cồn đế sát khuẩn tiếp, nếu lỡ làm cồn trong ly cháy thì lấy hộp đựng đầu tip đậy lại ly cồn để dập tắt lửa Phải để que trải nguội rồi mới thực hiện thao tác trải nếu không sẽ làm chết vi sinhvật dẫn đến kết quả không chính xác

- Tránh chạm tay vào phía trong eppendorf để tránh nhiễm các vi sinh vật khác từ tay mình

c) Kết quả của nhóm:

- Mẫu 0,5: đĩa petri 10 có số khuẩn lạc lớn hơn 300; đĩa petri 10 có 184 khuẩn lạc; đĩa petri -5 -6

10-7 có 127 khuẩn lạc

- Công thức tính mật độ vi sinh vật: N d = A.10.d (số tế bào/ml)

+ Trong đó: A là số khuẩn lạc đếm được, d là độ pha loãng

+ Theo công thức ta tính được: N = 3.010 ; N = 1,810 ; N = 1,310 (tế bào/ml)5 8 6 9 7 10

- Phương pháp trải sẽ làm phân tán các vi sinh vật trong dung dịch và từng vi sinh vật sống đó

sẽ phát triển ở môi trường đĩa petri hình thành các khuẩn lạc, ta đếm các khuẩn lạc và thực hiện tính mật độ vi sinh vật bằng công thức ta sẽ biết được mật độ vi sinh vật có trong dung dịch

- Ở các độ pha loãng khác nhau thì sẽ có mật độ vi sinh vật khác nhau, độ pha loãng càng cao thì mật độ vi sinh vật càng thấp

- Độ chính xác sẽ phụ thuộc vào thao tác của người trải đĩa, nên trải càng kĩ và đều, dừng đúng lúc khô thì khả năng chính xác càng cao

- Phương pháp này có ưu điểm là phân biệt được vi sinh vật sống và chết (do chỉ vi sinh vật sống thì mới hình thành khuẩn lạc) tuy nhiên nhược điểm của nó là dễ nhầm lẫn trong quá trình đếm bằng mắt thường Độ chính xác tương đối, không quá cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp

II/ Xác định bằng phương pháp đo độ đục:

OD của mẫu đo được dựa vào đường chuẩn (đường tương quan mật độ tế bào theo OD610nm) đểđịnh lượng mẫu

- Pipetman 100 – 1000L và đầu tip phù hợp

- Dung dịch ống đối chứng (Blank)

- Dung dịch huyền phù E coli

b) Các bước thực hiện đo OD

- Đối với nhóm 16 có thêm mẫu ĐL, sau khi thực hiện các thao tác đo OD mẫu 0,5 thì nhóm tiếp tục thực hiện thao tác đo mẫu ĐL và đo được giá trị là 0,950, giá trị ngoài khoảng cho phép Tiến hành pha loãng 2 lần, thao tác như trên với 1ml mẫu ĐL và 1ml dung dịch Blank, sau khi pha loãng đo lại được giá trị 0,560

c) Lưu ý:

- Phải thực hiện thao tác Blank

- Blank bằng dung dịch giống như loại dung dịch dùng để nuôi cấy vi sinh vật (tức là cùng một loại dung dịch nhưng dung dịch cần đo có vi sinh vật nhưng dung dịch Blank không có vi sinhvật), đo Blank để khi đo mẫu ta trừ đi giá trị Blank để ra giá trị chính xác của riêng mẫu

- Khoảng cho phép là khoảng trên đường chuẩn

- Khi pha loãng thì pha bằng dung dịch Blank

- Khi hút dung dịch từ ống nghiệm không được để bọt khí đi vào

- Cầm cuvet ở mặt nhám (với cuvet 4 mặt trong thì cầm ở 2 mặt không cho ánh sáng đi qua) và cầm ở phía trên gần miệng cuvet

3 Kết quả:

- Xác định mật độ tế bào theo độ đục:

+ Đo độ đục của một huyền phù tế bào X có mật độ chưa biết

+ Từ giá trị OD610nm đo được, suy ra trị số log (N/ml) tương đương Suy ra trị số mật độ N/ml theo công thức: N/ml = 10 với a = log (N/ml)a

+ Mẫu 0,5: đo được 0,584; không tiến hành pha loãng nữa Dựa vào sống liệu đường chuẩn, tatính được 2.410 (tế bào/ml)8

+ Mẫu ĐL sau khi pha loãng là 0,560 Dựa vào số liệu đường chuẩn ta tính được 2.410 (tế 8

bào/ml)

4 Biện luận:

- Phương trình chuẩn có R là 0,987 2

- Phương trình chuẩn có R tin cậy, trong quá trình thực hiện thao tác đã xảy ra ít sai sót và làm 2

kết quả đường chuẩn có thể phản ánh mật độ tế bào với độ chính xác cao

5 Kết luận:

- Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số lượng

vi sinh vật có trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp

- Đường chuẩn có càng nhiều điểm và R càng lớn thì có độ tin cậy càng cao 2

- Đây là một phương pháp có thể tiết kiệm thời gian khi phải đo nhiều mẫu thay vì phải tốn nhiều thời gian trải rồi đợi khuẩn lạc hình thành sau đó đếm

- Tuy nhiên phương pháp này cũng có 3 nhược điểm lớn:

+ Không phân biệt được vi sinh vật sống hay chết (do xác vi sinh vật cũng cản ánh sáng như sinh vật sống)

+ Phương pháp này cần dùng thêm phương pháp khác để dựng đường chuẩn thì mới tính toán được mật độ vi sinh vật

+ Rất dễ xảy ra sai sót dẫn đến kết quả sai lệch trong quá trình thao tác