Nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trong chế phẩm chứa dược liệu .... Các nghiên cứu phát hiện chất hóa dược thuộc nhóm kháng histaminNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

TỔNG QUAN

Tình hình thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80% người dân ở các nước đang phát triển vẫn chủ yếu sử dụng thuốc truyền thống cho chăm sóc sức khỏe, đặc biệt tại châu Phi và châu Á Cụ thể, 90% dân số Ethiopia, 75% dân số Mali, 70% ở Myanmar, 70% ở Rwanda, 60% ở Tanzania và 60% ở Uganda sử dụng dược liệu để điều trị bệnh Ngay cả ở các nước phát triển châu Âu, doanh thu từ chế phẩm dược liệu cũng rất lớn, với thị phần ở Đức đạt 39% và Pháp 21%.

Tình trạng thuốc hóa dược trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu đang gia tăng, gây lo ngại về sức khỏe người sử dụng Sự gia tăng này được thể hiện qua nhiều nghiên cứu toàn cầu về việc phát hiện thuốc hóa dược không hợp pháp trong các sản phẩm chứa dược liệu Diễn đàn FHH đã thiết lập chuyên mục riêng để phát hiện chất giả mạo trong chế phẩm dược liệu và xây dựng thư mục dữ liệu về các báo cáo phát hiện chất hóa dược trộn lẫn trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ dược liệu tại các nước châu Á, như Singapore và Hồng Kông Kể từ năm 2009, bộ dữ liệu này đã ghi nhận 99 báo cáo liên quan.

Các chất hóa dược trong chế phẩm từ dược liệu rất đa dạng, bao gồm glucocorticoid, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc giảm béo, thuốc lợi niệu, thuốc ức chế PDE-5, thuốc giảm glucose máu, thuốc hạ huyết áp, và thuốc kháng histamin Những chất này không chỉ có trong thuốc dược liệu mà còn xuất hiện trong nhiều sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa dược liệu.

Nhằm kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn cho sản phẩm dược liệu, nhiều quy định đã được ban hành để đối phó với nguy cơ từ việc làm gian dối Hướng dẫn về yêu cầu thử nghiệm cho thuốc từ dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe của FHH quy định việc phát hiện chất độc hại và chất trộn lẫn Hiện nay, có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện glucocorticoid, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc giảm béo, thuốc ức chế PDE-5 và thuốc giảm glucose máu trong sản phẩm dược liệu, trong khi nghiên cứu về kháng histamin và thuốc điều trị tăng huyết áp vẫn còn hạn chế Dưới đây là một số nghiên cứu quốc tế về hai nhóm dược chất này.

Các dược chất kháng histamin H1 thường được kết hợp vào các sản phẩm từ dược liệu nhờ vào khả năng chống dị ứng và an thần Một nghiên cứu tại Mỹ cho thấy trong 243/260 loại thuốc từ dược liệu châu Á thu thập ở các cửa hàng thảo dược tại California, có 17 loại (7%) chứa các thành phần hóa dược không được khai báo, trong đó clorpheniramin là một trong bốn loại phổ biến nhất.

Trên cổng thông tin của diễn đàn FHH, có 99 báo cáo chỉ ra sự hiện diện của chất hóa dược trong thành phần thuốc từ dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe, trong đó 29 sản phẩm được xác định có chứa clorpheniramin.

YE Lin-hu và cộng sự (2016) đã áp dụng phương pháp LC-MS/MS để nghiên cứu bảy loại kháng histamin, bao gồm loratadin, diphenhydramin hydrochlorid, cyproheptadin hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin và clorpheniramin maleat trong các sản phẩm thuốc từ dược liệu tại Trung Quốc Kết quả phân tích cho thấy

9 mẫu chế phẩm đã xác định được 4 mẫu đã bị trộn lẫn với một trong các kháng histamin trên [67]

Kim Jung Yeon và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS độ phân giải cao để phân tích 117 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe Kết quả cho thấy trong số 117 mẫu khảo sát, có một mẫu phát hiện chứa thành phần diphenhydramin.

Các dược chất kháng histamin và chống tăng huyết áp có thể được phát hiện qua nhiều phương pháp như sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng khối phổ Trong đó, sắc ký lớp mỏng thường được sử dụng để sàng lọc, trong khi sắc ký lỏng khối phổ cung cấp kết luận khẳng định Tình trạng trộn lẫn các chất hóa dược trong chế phẩm từ dược liệu vẫn diễn ra phổ biến, dẫn đến việc phát hiện ngày càng nhiều dược chất Điều này nhấn mạnh tính cấp thiết của việc nghiên cứu, cần thiết phải xây dựng một hệ thống phương pháp đa dạng, bao gồm cả định tính và định lượng, để phát hiện nhiều nhóm dược chất khác nhau tùy thuộc vào trang thiết bị của các đơn vị kiểm nghiệm.

1.1.2 Nhóm thuốc điều trị tăng huyết áp

Tăng huyết áp là tình trạng huyết áp tâm thu và/hoặc huyết áp tâm trương cao, có thể không rõ nguyên nhân, và là một bệnh lý mạn tính nguy hiểm, gây ra nhiều biến chứng tim mạch như loạn nhịp tim, thiếu máu não và suy tim Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 1,13 tỷ người trên toàn cầu mắc tăng huyết áp, với tỷ lệ một trên bốn ở nam giới và một trên năm ở nữ giới Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự xuất hiện của các chất hóa dược hạ huyết áp không hợp pháp trong các sản phẩm dược liệu.

Lu Yaling và các cộng sự (2009) đã tiến hành phân tích 8 loại thuốc hóa dược

(Clonidin, dihydrochlorothiazid, triamteren, metoprolol, phentolamin, chlorthalidon, furosemid và valsartan) trộn bất hợp pháp trong thực phẩm bổ sung điều trị tăng huyết áp bằng phương pháp HPLC-MS [69]

Y.L Lu và cộng sự (2010) tiến hành nghiên cứu phân tích 18 dược chất được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, thuốc chẹn kênh calci và thuốc ức chế men chuyển được trộn trong thực phẩm bổ sung và các loại thuốc truyền thống Trung Quốc bằng sắc ký khối phổ ion hóa điện tử (LC/ESI-MS) Tiến hành phân tích

35 mẫu thực phẩm bổ sung và các thuốc cổ truyền phát hiện 9 mẫu có chứa hydrochlorothiazid, 2 mẫu có chứa clonidin và 2 mẫu chứa triamteren [68]

Nghiên cứu của Ana Paula Lanỗanova Moreira và cộng sự (2016) tại Brazil đã phân tích 13 loại thuốc điều trị cao huyết áp, bao gồm thuốc lợi tiểu, β-blockers, thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II và thuốc ức chế men chuyển angiotensin, bằng phương pháp UHPLC-ESI-MS/MS Qua việc phân tích 34 mẫu chế phẩm chứa dược liệu trên thị trường Brazil, nghiên cứu đã xác định được 3 mẫu chứa thuốc lợi tiểu hydrochlorothiazid và 2 mẫu chứa furosemid.

Nghiên cứu của Seok Heo và các cộng sự (2017) đã tiến hành phân tích 35 chất hóa dược điều trị tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng phương pháp LC/MS/MS Họ đã thử nghiệm trên 97 mẫu thực phẩm bổ sung từ thị trường Hàn Quốc, bao gồm nhiều dạng như viên nén, viên nang cứng, viên nang mềm, bột, viên hoàn và dạng lỏng Kết quả cho thấy không có mẫu nào phát hiện chứa 35 dược chất đã nghiên cứu.

Kesting J R và cộng sự (2010) đã tiến hành phân tích viên nang mềm Gold Night, một loại thuốc thảo dược Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp, bằng phương pháp LC–HRMS Nghiên cứu sử dụng cột ZORBAX Eclipse Plus (C18; 1,8 µm) 3,0 mm x 50 mm và LC-MS-SPE/NMR với cột Phenomenex Max-RP (C12; 4 µm) 4,6 mm x 250 mm, áp dụng chương trình gradient của hỗn hợp dung môi ACN - nước có chứa 0,1% acid formic Kết quả phân tích đã phát hiện ba thành phần chính: amlodipin (1,3 mg), indapamin (1,3 mg) và valsartan.

(30,8 mg) trộn trái phép trong viên [62]

Nghiên cứu của Zhu và các cộng sự (2014) đã nhanh chóng phát hiện 4 chất hóa dược điều trị tăng huyết áp trong thuốc y học cổ truyền Trung Quốc, bao gồm Nicardipin hydroclorid, doxazosin mesylat, propranolol hydroclorid và hydroclorothiazid, thông qua phương pháp TLC-SERS với độ đặc hiệu cao và giới hạn phát hiện khoảng 0,005 µg Kết quả cho thấy 2 trong số 10 mẫu thuốc y học cổ truyền dương tính với các chất nghiên cứu, trong đó 1 mẫu dương tính với doxazosin mesylat và 1 mẫu dương tính với cả hydroclorothiazid và propranolol.

Tình hình chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu tại Việt Nam

Việt Nam đã có một lịch sử dài trong việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm từ dược liệu, khẳng định vai trò quan trọng trong hệ thống y tế quốc gia Theo quyết định số 1976/QĐ-TTg, chính phủ đã phê duyệt quy hoạch phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030, nhấn mạnh việc sản xuất hàng hóa dược liệu để đáp ứng nhu cầu thị trường và xây dựng vùng trồng dược liệu gắn liền với công nghiệp chế biến Tiếp theo, quyết định số 376/QĐ-TTg tiếp tục ưu tiên đầu tư cho nghiên cứu khoa học và sản xuất thuốc dược liệu chất lượng cao Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản nhằm quản lý chất lượng dược liệu, trong đó có Thông tư 43/2014/TT-BYT về quản lý thực phẩm chức năng Đặc biệt, Luật Dược 2016 đã quy định rõ ràng về dược liệu và thuốc cổ truyền tại Việt Nam.

Các chế phẩm từ thảo dược bao gồm dược liệu, thuốc cổ truyền, thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) và thuốc đông y do lương y kê đơn Những sản phẩm này được quản lý và cấp số đăng ký bởi các cơ quan khác nhau Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền cấp số đăng ký cho dược liệu và thuốc cổ truyền, trong khi thuốc từ dược liệu được cấp số đăng ký bởi Cục Quản lý Dược Việt Nam Các sản phẩm này phải được sản xuất bởi các cơ sở đạt tiêu chuẩn sản xuất tốt (GMP) hoặc tương đương, và mỗi lô sản phẩm đều được kiểm tra chất lượng trước khi được bán tại các nhà thuốc TPBVSK được quản lý bởi Cục An toàn thực phẩm.

Vệ sinh thực phẩm và quản lý cấp số công bố là điều kiện cần thiết đối với cơ sở sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK), trong đó các cơ sở này phải đạt tiêu chuẩn GMP Sản phẩm TPBVSK được phân phối qua nhiều kênh khác nhau như nhà thuốc, cửa hàng chăm sóc sức khỏe, hệ thống kinh doanh đa cấp và bán hàng trực tuyến Đối với thuốc đông y, chúng thường được kê đơn bởi lương y và bán trực tiếp tại phòng khám mà không có hệ thống kiểm soát chất lượng Tại Việt Nam, thuốc từ dược liệu và thuốc cổ truyền chỉ chiếm khoảng 20% thị trường, trong khi TPBVSK và thuốc đông y theo đơn của lương y chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ.

Trong những năm gần đây, số lượng chế phẩm từ dược liệu tại Việt Nam, đặc biệt là thực phẩm chức năng (TPBVSK), đã tăng mạnh Cụ thể, từ 143 cơ sở kinh doanh TPBVSK với 300 sản phẩm chủ yếu nhập khẩu vào năm 2005, con số này đã vọt lên trên 1600 cơ sở và hơn 5000 sản phẩm vào năm 2015, trong đó hai phần ba là sản phẩm nội địa do Việt Nam sản xuất Sự tăng trưởng này phản ánh xu thế toàn cầu về chăm sóc sức khỏe.

Thị trường hiện nay có nhiều chế phẩm từ dược liệu với thành phần đa dạng, nhưng khó kiểm soát do được phân phối qua nhiều kênh như hiệu thuốc, cửa hàng sức khỏe, internet, đa cấp và siêu thị Điều này làm tăng nguy cơ sản phẩm giả mạo, dẫn đến nhiều tác dụng không mong muốn khi sử dụng.

Cao Công Khánh và các cộng sự (2013) đã phát triển một quy trình hiệu quả để xác định đồng thời việc giảm cân và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến xương, khớp, gout thông qua kỹ thuật phát hiện HPLC.

Nghiên cứu sử dụng cột Waters Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) với pha động là dung dịch đệm acetat (pH 3,5) và MeOH để phân tích furosemid Qui trình xây dựng cho thấy khoảng tuyến tính từ 0,5 àg/mL đến 50 àg/mL, với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 0,1 mg/100 g và 0,4 mg/100 g Độ thu hồi đạt từ 98,4% đến 102,7% cho tất cả các chất phân tích.

Vào năm 2012, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tiến hành kiểm tra mẫu sản phẩm ‘Thuốc bổ Tỳ’ từ một cơ sở tại Đà Nẵng, có công dụng kích thích ngon miệng, và phát hiện rằng sản phẩm này bị pha trộn với dexamethason và cyproheptadin.

Năm 2017, Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện một cơ sở đông y ở quận

Bài viết đề cập đến 12 cơ sở lưu giữ và bày bán các chế phẩm dược liệu điều trị biếng ăn cho trẻ em, với kết quả kiểm nghiệm cho thấy có chứa corticoid và cyproheptadin Để tăng cường kiểm soát mối nguy hại từ các hoạt động bất hợp pháp này, Bộ Y tế đã ban hành thông tư 10/2021/TT-BYT vào ngày 30/06/2021, quy định về danh mục 80 chất cấm trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe Danh mục này chủ yếu bao gồm các chất đã được phát hiện trong sản phẩm dược liệu toàn cầu, bao gồm các nhóm điều trị cảm cúm, dị ứng và tăng huyết áp như Clorpheniramin, cyproheptadin, cinnarizin, furrosemid, hydrochlorothiazid, propranolol và terazosin.

Tình hình chế phẩm có thành phần dược liệu bị trộn lẫn với các chất hóa dược đang ở mức báo động toàn cầu Nhiều quốc gia đã thực hiện nghiên cứu độc lập để thu thập mẫu và đánh giá thực trạng Tại Việt Nam, việc phát hiện tân dược trong chế phẩm đông dược chủ yếu dựa vào các mẫu do cơ quan quản lý lấy, dẫn đến kết quả mang tính chất sự vụ và không phản ánh đúng thực tế.

Nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng việc sử dụng thuốc hóa dược chống dị ứng, đặc biệt là nhóm kháng histamin H1, trong các chế phẩm từ dược liệu vẫn còn hạn chế Mặc dù một số quốc gia đã nghiên cứu việc trộn thuốc hóa dược điều trị tăng huyết áp vào dược liệu, tại Việt Nam, các công bố về vấn đề này vẫn rất ít, chủ yếu tập trung vào nhóm thuốc lợi niệu.

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mở rộng đối tượng nghiên cứu về các dược chất kháng histamin H1 và điều trị tăng huyết áp, dựa trên thông tin về các chất cấm trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo Thông tư Số 10/2021/TT-BYT Mục tiêu chính là xây dựng bộ công cụ phát hiện các dược chất phổ biến thuộc nhóm kháng histamin và nhóm điều trị tăng huyết áp, sử dụng các phương pháp sắc ký từ HPTLC đơn giản đến HPLC thường quy và cuối cùng là phương pháp hiện đại LC-MS/MS với độ nhạy, độ chính xác và độ đặc hiệu cao.

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu cho thấy các dược chất dễ bị trộn lẫn trong chế phẩm từ dược liệu, đặc biệt là nhóm thuốc kháng histamin H1 và thuốc điều trị tăng huyết áp Những dược chất này thường được chỉ định trong phác đồ điều trị các bệnh dị ứng và tăng huyết áp, hai bệnh lý phổ biến tại Việt Nam Thị trường dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe tại Việt Nam có nhiều sản phẩm hỗ trợ điều trị cho các bệnh này Các dược chất được nghiên cứu không chỉ phổ biến và có giá thành phải chăng mà còn dễ dàng mua được, đồng thời có tỷ lệ trộn lẫn cao trong các chế phẩm dược liệu.

Tiêu chuẩn chất lượng của các dược chất trong nghiên cứu này đã được công nhận trong các Dược điển Dựa trên các đặc tính lý hóa của chúng, việc sử dụng các phương pháp phân tích như TLC, HPLC và LC-MS/MS là hoàn toàn phù hợp.

- Giới thiệu sơ lược về bệnh dị ứng và các thuốc kháng histamin H1

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, dị ứng là rối loạn quá mẫn của hệ miễn dịch, phản ứng nhanh chóng và có thể dự đoán nhằm chống lại các chất vô hại trong môi trường, được gọi là chất gây dị ứng như phấn hoa, lông thú cưng hoặc một số loại thực phẩm.

Bệnh lý dị ứng hiện nay được Tổ chức Y Tế Thế Giới phân loại là bệnh mãn tính, với tỷ lệ lưu hành tăng gấp đôi mỗi 15 năm Sự gia tăng này đặc biệt rõ rệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam Nhiều giả thuyết đã được đưa ra để giải thích cho sự gia tăng bệnh dị ứng, đặc biệt là dị ứng đường hô hấp và dị ứng môi trường, bao gồm giả thuyết về vệ sinh môi trường sống và sự kéo dài của các mùa dị ứng do biến đổi khí hậu toàn cầu.

Dị ứng nhẹ là tình trạng phổ biến, thường biểu hiện qua các triệu chứng như viêm kết mạc dị ứng, ngứa và chảy nước mũi Trong một số trường hợp, dị ứng có thể tiến triển thành phản ứng viêm nghiêm trọng như chàm, phát ban, sốt, cơn hen suyễn, thậm chí là sốc phản vệ Để điều trị dị ứng, ngoài việc tránh xa các tác nhân gây dị ứng hoặc áp dụng liệu pháp miễn dịch, người bệnh có thể sử dụng các loại thuốc hóa dược chống dị ứng.

- Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1

- hoặc có thể dùng các chế phẩm từ dược liệu

Thuốc kháng histamin H1 là lựa chọn phổ biến trong điều trị dị ứng, được chia thành hai nhóm chính: thế hệ 1 và thế hệ 2 Các thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 như Clorpheniramin và Promethazin có thể gây buồn ngủ, trong khi các thuốc thế hệ 2 như Cetirizin và Loratadin ít gây buồn ngủ hơn Tuy nhiên, cần lưu ý rằng tác dụng của các thuốc này chủ yếu là giảm triệu chứng chứ không điều trị nguyên nhân gây ra dị ứng.

Năm dược chất kháng histamin H1 thường dùng trong điều trị dị ứng được lựa chọn cho nghiên cứu này bao gồm cinarizin, clorpheniramin, cyproheptadin, loratadin và promethazin Những chất này dễ bị sử dụng trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu, đặc biệt là cinarizin, clorpheniramin và cyproheptadin, đã nằm trong danh mục chất cấm sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe Các dược chất này cũng đã được phát hiện bị trộn trái phép trong nhiều nghiên cứu trước đó.

- Cấu trúc, đặc tính vật lý/hóa học và liều dùng của các chất được lựa chọn để nghiên cứu

Cấu trúc, đặc tính hóa lý và liều dùng của 5 dược chất nghiên cứu xem ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Cấu trúc, tính chất vật lý và liều dùng của các thuốc kháng histamin H1

Tên chất Công thức hóa học, cấu trúc hóa học Đặc tính hóa lý và liều dùng

Tính tan: Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, tan trong aceton, khó tan trong ethanol 96% và methanol [7]

Log Kow (octanol/nước): 5,8 [43] Liều dùng: 25 mg/lần ngày uống 2-3 lần [7], [8]

Tính tan: Dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%, cloroform; ít tan trong ether và benzen [7], [79]

Log Kow (octanol/nước): 2,6 [43] Liều dùng: Người lớn: 4 mg cách 4-6 giờ/lần Tối đa: 24 mg/ngày (người cao tuổi tối đa 12mg/ngày) [8]

Tính tan: Khó tan trong nước, dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96% [7]

Log Kow (octanol/nước): 4,69 [43] Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần × 3-4 lần/ngày Tối đa 0,5 mg/kg/24 giờ [8]

Tính tan: Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methanol

Log Kow (octanol/nước): 5,20 [43] Liều dùng: Người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên: Dùng 1 lần trong ngày, liều 10 mg [8]

Tính tan: Rất dễ tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và dicloromethan [7]

Log Kow (octanol/pH 7,4): 2,9 [43] Liều dùng: Người lớn ngày uống

2 lần, mỗi lần 25 mg sau ăn [8]

Tác dụng không mong muốn

Tác dụng không mong muốn hay gặp nhất của thuốc kháng histamin H1 thế hệ

Thuốc an thần có thể gây ra nhiều tác dụng phụ như khô miệng, họng và mũi do tác động kháng cholinergic Ngoài ra, người dùng có thể trải qua cảm giác căng ngực, hồi hộp, đau đầu và khó tiêu Về hệ tiêu hóa, thuốc có thể làm giảm cảm giác thèm ăn, gây nôn, buồn nôn và tiêu chảy Hơn nữa, thuốc ức chế hệ thần kinh trung ương có thể dẫn đến chóng mặt, mệt mỏi, buồn ngủ, ù tai và bồn chồn, đồng thời tăng nguy cơ co giật ở trẻ em Tuy nhiên, thế hệ thuốc an thần thứ hai thường ít gặp các tác dụng phụ này.

1.3.2 Nhóm điều trị tăng huyết áp

- Giới thiệu sơ lược về bệnh tăng huyết áp và các thuốc điều trị

Tăng huyết áp là tình trạng bệnh lý khi huyết áp nghỉ ngơi cao hơn mức bình thường, với chỉ số huyết áp tâm thu đạt ≥ 140 mmHg và/hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90 mmHg.

Tăng huyết áp là nguyên nhân chính gây tử vong sớm ở bệnh nhân tim mạch, với tỷ lệ mắc trung bình toàn cầu gần 20% theo WHO, và tỷ lệ này gia tăng theo độ tuổi Tại Việt Nam, dự báo đến năm 2025 sẽ có gần 10 triệu người mắc bệnh tăng huyết áp.

Các nhóm thuốc thường dùng để điều trị tăng huyết áp hiện nay:

+ Nhóm thuốc lợi tiểu: Hydroclorothiazid, furosemid… Dùng đơn độc khi bị cao huyết áp nhẹ, dùng phối hợp với thuốc khác khi bệnh cao huyếp áp nặng thêm

Nhóm thuốc đối kháng calci, bao gồm amlodipin, felodipin và nifedipin, là lựa chọn hiệu quả cho bệnh nhân mắc đau thắt ngực, đặc biệt là ở người cao tuổi Những loại thuốc này không gây ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa đường và mỡ trong cơ thể, giúp cải thiện sức khỏe tim mạch mà không làm tăng nguy cơ các vấn đề chuyển hóa.

Nhóm thuốc tác động lên thần kinh trung ương như Reserpin, methyldopa và clonidin hiện nay ít được sử dụng do tác dụng phụ gây trầm cảm Việc ngừng thuốc đột ngột có thể dẫn đến tình trạng huyết áp tăng vọt.

+ Nhóm thuốc chẹn beta (tác dụng trên hệ giao cảm): Atenolol, propranolol… Chống chỉ định đối với người có kèm hen suyễn, suy tim, nhịp tim chậm

Nhóm thuốc ức chế men chuyển như Captopril, Enalapril và Lisinopril là lựa chọn hàng đầu cho những bệnh nhân mắc hen suyễn, đặc biệt khi không thể sử dụng chẹn beta Ngoài ra, nhóm thuốc này cũng phù hợp cho người bệnh đái tháo đường, giúp kiểm soát huyết áp hiệu quả.

+ Nhóm thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II: Losartan, irbesartan, valsartan

Chống chỉ định của thuốc là không dùng cho phụ nữ có thai hoặc người bị dị ứng với thuốc

Ngoài ra, để hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu cũng có thể được các bệnh nhân sử dụng

Nghiên cứu này tập trung vào bốn dược chất điều trị cao huyết áp: Furosemid, amlodipin, felodipin và nifedipin, với mục tiêu đánh giá nguy cơ sử dụng trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu Furosemid, nằm trong danh mục chất cấm sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, đã được phát hiện nhiều lần trong các nghiên cứu về trộn lẫn trái phép Trong khi đó, nhóm đối kháng calci, bao gồm amlodipin và felodipin, là những dược chất phổ biến nhất hiện nay, đặc biệt là đối với người cao tuổi nhờ vào các đặc tính điều trị hiệu quả của chúng.

- Cấu trúc, đặc tính vật lý/hóa học và liều dùng của các chất được lựa chọn để nghiên cứu

Cấu trúc, đặc tính hóa lý và liều dùng của 4 dược chất xem ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Cấu trúc, đặc tính hóa lý và liều dùng của các dược chất điều trị tăng HA

Công thức hóa học, cấu trúc hóa học Đặc tính hóa lý và liều dùng

Tính tan: Dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol khan, khó tan trong nước và 2-propanol [7]

Log Kow (octanol/nước): 3,00 [43] Liều dùng: 5-10 mg/lần, ngày uống 1 lần [7], [8]

Tính tan: Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, trong ethanol khan, trong methanol và trong methylen clorid [7]

Log Kow (octanol/nước): 3,86 [43] Liều dùng: 2,5-10 mg/lần, ngày uống

Tính tan: Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol, methanol [7]

Log Kow (octanol/nước): 2,2 [43] Liều dùng: 10 mg/lần, ngày uống 3 lần [7], [8]

Tính tan: Tan trong aceton và methanol, hơi tan trong ethanol 96 %, khó tan trong nước, acetonitril và cloroform Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng [7], [43]

Log Kow (octanol/nước): 2,0 [43] Liều dùng: 20 mg - 40 mg / lần ngày uống 2 lần [7], [8]

Tác dụng không mong muốn

Nhóm chẹn kênh calci có thể gây ra các triệu chứng như phù cổ chân nhẹ đến trung bình, nhức đầu, chóng mặt, buồn nôn, và nhịp tim chậm Ngoài ra, người bệnh có thể gặp tình trạng khô miệng, phát ban, táo bón hoặc tiêu chảy, cùng với bệnh trào ngược dạ dày thực quản (GERD) Đối với furosemid, tác dụng phụ có thể bao gồm chuột rút cơ, suy nhược, lú lẫn, và chóng mặt nghiêm trọng Người dùng cũng cần chú ý đến các dấu hiệu vấn đề về thận như thay đổi lượng nước tiểu, tê/nhức/đỏ/sưng tay chân, và các triệu chứng liên quan đến thính giác như ù tai.

Tổng quan về phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật phân tích lâu đời, cho phép tách biệt hỗn hợp nhiều cấu tử với lượng mẫu nhỏ và tốc độ phân tích nhanh, thích hợp cho việc phân tích hàng loạt mẫu Nhờ vào những ưu điểm này, TLC hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một công cụ tiên tiến hơn so với sắc ký lớp mỏng (TLC), được điều khiển bởi phần mềm phù hợp để đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy và độ lặp lại cao nhất của số liệu Quá trình phun mẫu, khai triển sắc ký và nhận diện vết sắc ký được thực hiện tự động hoặc bán tự động, giúp giảm thiểu sai số trong phân tích Trong quá trình khai triển, các điều kiện về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả giữa các lần phân tích và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV kết hợp với máy scan và phần mềm phân tích hỗ trợ cho việc định tính và định lượng hiệu quả.

Hiện nay, để nâng cao độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản mỏng này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC, với độ dày khoảng 100 µm so với 250 µm của TLC, và sử dụng bột mịn có kích thước hạt 5 µm với độ đồng đều cao hơn Việc áp dụng bản mỏng này mang lại hiệu quả cao hơn nhờ kích thước hạt mịn, tăng cường độ nhạy và độ phân giải, với vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi tiêu thụ ít hơn so với TLC thông thường.

Phương pháp HPTLC hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm hóa thực vật để xác định sự hiện diện của các chất hóa học trong thực vật, y sinh và đặc biệt là kiểm soát chất lượng các chế phẩm thảo dược và thực phẩm chức năng Với khả năng phân tích một số lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn, HPTLC đảm bảo độ tin cậy và chính xác trong kết quả, do đó, nó trở thành công cụ hữu ích cho việc sàng lọc mẫu và định lượng bằng các phương pháp hiện đại hơn.

* Ưu, nhược điểm của HPTLC

Bộ phận scanner cho phép phân tích cả định tính và định lượng, ghi lại phổ hấp thụ của chất, mang lại độ chính xác cao hơn so với phương pháp TLC thông thường Phân tích định tính trở nên đặc hiệu hơn, trong khi định lượng đạt được độ chính xác vượt trội so với việc chụp ảnh và đo mật độ màu của vết.

Khai triển sắc ký cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí hóa chất cũng như vật tư tiêu hao Nhờ đó, thời gian và chi phí cho mỗi lần phân tích được giảm thiểu đáng kể.

Các mẫu phân tích và mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký và khai triển đồng thời dưới cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ và độ ẩm, giúp tăng cường độ lặp lại và giảm thiểu ảnh hưởng của môi trường trong quá trình phân tích.

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước như lọc và khử khí, lượng dung môi pha động tiêu thụ cho mỗi mẫu thấp

- Về mặt kỹ thuật, rất đơn giản để tìm hiểu và vận hành

- Pha tĩnh có độ chọn lọc cao để tách các thành phần trong hỗn hợp nhiều chất [89]

Hiện nay, để nâng cao độ tin cậy của kết quả phân tích, việc sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) là rất hiệu quả Sử dụng loại bản mỏng này giúp tăng cường độ nhạy và độ phân giải, nhờ vào kích thước vết sắc ký nhỏ hơn và thời gian sắc ký được rút ngắn.

Nền mẫu từ dược liệu có tính phức tạp cao với thành phần đa dạng, dẫn đến khả năng xuất hiện các hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả Điều này xảy ra khi phương pháp phân tích không đạt yêu cầu về độ nhạy, ảnh hưởng đến kết quả phát hiện chất phân tích.

* Ứng dụng của TLC để phát hiện chất hóa dược trộn lẫn trong chế phẩm từ dược liệu

TLC là một kỹ thuật phân tích hiện đại, được sử dụng hiệu quả trong việc phân tích định tính và định lượng nhiều hợp chất, đặc biệt là trong lĩnh vực dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thiên nhiên.

Phương pháp HPTLC có khả năng định tính và định lượng chính xác các chất hóa dược bất hợp pháp trong chế phẩm từ dược liệu, với độ nhạy và độ lặp lại vượt trội.

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng kỹ thuật TLC được áp dụng hiệu quả trong việc phát hiện các chất hóa dược lẫn trong chế phẩm từ dược liệu.

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm chất hóa dược điều trị cao huyết áp và kháng histamin có thể được kết hợp trong các chế phẩm từ dược liệu, như thể hiện trong Bảng 1.3.

Bảng 1.3 trình bày các nghiên cứu về việc phát hiện chất hóa dược thuộc nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trong các chế phẩm từ dược liệu thông qua phương pháp TLC.

Hoạt chất và mẫu thử

Nền mẫu Phương pháp phân tích Tài liệu

Nicardipin hydrochlorid, doxazosin mesylat, propranolol hydrochlorid, hydrochlorothiazid

Thuốc từ dược liệu (ở Trung Quốc)

TLC- SERS LOD từ 0,005 àg/mL Không có thông tin về dung môi chiết mẫu

- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60F254

- Pha động: Chloroform - methanol - acid acetic băng - amoniac (9,5 : 0,5 : 0,1 : 0,1) (tt/tt/tt/tt)

- Thể tớch chấm: 10 àl dung dịch 100 àg/mL

(Tương quan tuyến tính thu được trong khoảng 0,2-2 và 0,4-1,6 àg/ dải chấm lần lượt đối với dimenhydrinat và cinnarizin)

- Phát hiện ở bước sóng: 235 nm

Chế phẩm từ dược liệu

- Pha tĩnh: Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 Pha động: Cyclohexan - aceton - triethylamin (8: 2: 0,5) (tt/tt/tt)

- Phát hiện ở bước sóng 254 nm

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích quan trọng, dựa trên nguyên tắc phân tách các chất qua một pha tĩnh trong cột, nhờ vào dòng pha động lỏng được đẩy dưới áp suất cao.

Tổng quan về nền mẫu nghiên cứu

1.5.1 Dược liệu và chế phẩm từ dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa

Hiện nay, thị trường có nhiều chế phẩm từ dược liệu đã được cấp số đăng ký lưu hành, hiệu quả trong việc điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa Các sản phẩm này đa dạng về thành phần dược liệu như liên kiều, kim ngân hoa, kinh giới, bồ công anh, ngưu bàng tử, cúc hoa, cùng với nhiều dạng bào chế như viên hoàn, thuốc bột, viên nang và cốm tan.

Danh mục thuốc cổ truyền và dược liệu thiết yếu được ban hành theo Thông tư số 19/2018/TT-BYT ngày 30 tháng 8 năm 2018 và Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT ngày 15/10/2021 của Bộ Y tế, bao gồm nhiều dược liệu có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa Dưới đây là một số dược liệu thông dụng có trong danh mục này.

Bảng 1.6 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng

TT Dược liệu Bộ phận dùng TT Dược liệu Bộ phận dùng

1 Bạc hà Toàn cây 9 Kim ngân hoa Hoa

2 Bồ công anh Toàn cây 10 Liên kiều Quả chín

3 Cúc hoa Hoa 11 Ngưu bàng tử Quả chín

4 Đạm đậu xị Hạt 12 Phòng phong Rễ

5 Đơn lá đỏ Lá 13 Sài đất Toàn cây

6 Hoàng bá Vỏ thân 14 Thổ phục linh Thân rễ

7 Kinh giới Phần trên mặt đất 15 Thuyền thoái Xác của con ve sầu

8 Ké đầu ngựa Quả 16 Xuyên khung Thân rễ

Dược điển Việt Nam V đã giới thiệu hai chuyên luận thuốc cổ truyền có khả năng giải độc và điều trị dị ứng, mẩn ngứa, bao gồm Hoàn Ngân kiều giải độc và Hoàn Nhị trần.

Thành phần Hoàn Ngân kiều giải độc gồm

- Đạm đậu xị (Đỗ đen chế) 100 g

Thành phần Hoàn Nhị trần gồm

Bảng 1.7 Một số chế phẩm chứa dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng lưu hành trên thị trường

STT Tên chế phẩm Thành phần Dạng bào chế

Cao đặc qui về khan bao gồm các thành phần quan trọng như Kim ngân hoa (267 mg), Liên kiều (267 mg), Bạc hà (160 mg), Kinh giới (107 mg), Đạm đậu xị (133 mg), Ngưu bàng tử (160 mg), Cát cánh (160 mg) và Đạm trúc diệp (107 mg) Sự kết hợp này mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch và cải thiện tình trạng viêm nhiễm.

Thanh nhiệt giải độc SXH

Mỗi gói 5,5 g chứa cao khô dược liệu (tương ứng: Tang diệp 4 g; Cúc hoa 4 g;

Kim ngân hoa 4 g; Liên kiều 4 g; Bạc hà

Hoàng cầm 2,7 g; Quả dành dành 2,7 g)

Thuốc bột giải nhiệt tiêu ban tán

Mỗi gói 1 g chứa: Bạch chỉ 0,15g; Phòng phong 0,15 g; Cát căn 0,15 g; Sài hồ 0,10 g; Kim ngân hoa 0,10g; Liên kiều 0,10 g;

Ma hoàng 0,10 g; Tô diệp 0,05 g; Bạc hà 0,05 g; Cam thảo 0,05 g

Bảo bảo nhiệt độc thanh

Cao khô dược liệu (12:1) 0,25 g (tương đương với: Bồ công anh 0,5 g; Kim ngân hoa 0,5 g; Sài đất 0,5 g; Thổ phục linh 0,5 g; Ké đầu ngựa 0,4 g; Hạ khô thảo 0,5 g; Huyền sâm 0,1 g)

Công ty TNHH Dược phẩm Hoa Linh

* Các sản phẩm kê trong bảng trên đều là các thuốc y học cổ truyền, có số đăng ký

Danh mục dược liệu và thành phần công thức của chế phẩm nêu trên là cơ sở quan trọng để lựa chọn và xây dựng nền mẫu cho nghiên cứu.

1.5.2 Dược liệu và chế phẩm từ dược liệu dùng trong điều trị và hỗ trợ điều trị tăng huyết áp

Theo Y học cổ truyền, tăng huyết áp được xem là một trong những chứng bệnh như huyễn vựng, đầu thống, và thất miên, có nhiều nguyên nhân khác nhau Một số nguyên nhân có thể kể đến như can dương vượng hoặc tình chí không thư thái, dẫn đến tình trạng uất ức lâu ngày, gây ra triệu chứng như hoa mắt, chóng mặt, và ù tai Ngoài ra, lao động nặng nhọc kéo dài hoặc tuổi cao sức yếu cũng có thể làm tổn thương các cơ quan trong cơ thể Đặc biệt, tổn thương thận âm và thận âm hư không đủ nuôi dưỡng can mộc, dẫn đến can âm suy yếu, làm tăng can dương gây ra chóng mặt, đau đầu và hay quên Cuối cùng, việc tiêu thụ nhiều đồ béo bổ có thể gây hại đến tỳ vị, khiến thức ăn không được chuyển hóa thành tân dịch mà trở thành đàm thấp, làm cho thanh dương không thể thăng lên, gây ra huyễn vựng và cảm giác choáng váng.

Tùy thuộc vào từng thể lâm sàng và tình trạng bệnh lý của người bệnh, các bài thuốc và dược liệu điều trị cao huyết áp sẽ được gia giảm khác nhau Khi người bệnh gặp căng thẳng, lo âu hay tức giận (Âm hư dương xung), bài thuốc thiên ma câu đằng ẩm sẽ được sử dụng Đối với chứng âm hư, lục vị qui thược là lựa chọn phù hợp; trong khi đó, khi dương xung can hỏa thịnh, long đởm tả can thanh sẽ được áp dụng Đối với tình trạng can thận âm hư, kỷ cúc địa hoàng thang là bài thuốc thích hợp, còn can thận dương hư sẽ dùng lục vị địa hoàng thanh gia giảm Cuối cùng, thể tâm tỳ hư sẽ được điều trị theo bài qui tỳ thang gia giảm.

Các dược liệu thường được sử dụng trong điều trị cao huyết áp bao gồm hòe hoa, cúc hoa, câu đằng, ba gạc và nhàu Những nguyên liệu này có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc phối hợp trong các bài thuốc nhằm mang lại hiệu quả tốt nhất trong việc kiểm soát huyết áp.

Các dược liệu như râu ngô, mã đề, trạch tả và bạch phục linh được sử dụng để mang lại tác dụng lợi tiểu Những dược liệu này thường được kết hợp trong các bài thuốc và chế phẩm từ dược liệu nhằm hỗ trợ điều trị cao huyết áp.

Trên thị trường hiện nay, có nhiều sản phẩm từ dược liệu được sử dụng để điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp Dưới đây là một số chế phẩm từ dược liệu có chỉ định hỗ trợ điều trị cao huyết áp đang được lưu hành.

Bảng 1.8 Một số chế phẩm chứa dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị tăng huyết áp trên thị trường

STT Tên sản phẩm Thành phần Nhà sản xuất, số đăng ký Liều dùng

Viên nang cứng Hạ áp ích nhân Địa long, nattokinase, hòe hòa, huyền sâm, câu đằng, hạ khô thảo

CT Nam Dược 1464/2014/ATTP- XNCB

Viên nén Định áp vương

Cao lá dâu tằm, cao cần tây, cao tỏi, cao hoàng bá,

Cốm Dưỡng huyết thanh não PQA

Dạ giao đằng, câu đằng, thiên ma, ích mẫu, phục linh, đỗ trọng, thạch quyết minh, hoàng cầm, ngưu tất, tang ký sinh

CT CPDP PQA 6950/2012/ATTP- XNCB

CT TNHH tư vấn y dược Quốc Tế

5 Viên nén Hạ hồi đơn

Táo nhân, đỗ trọng, câu đằng, ngưu tất, hạ khô thảo, bạch thược, đảng sâm, sinh địa, linh chi

Công ty CP Dược VTYT Hải phòng 13689/2013/ATTP- XNCB

Cao xa tiền thảo, hòe hoa, ngọc mễ tu, hạ khô thảo, tinh lá sen

Công ty TNHH IPHA công nghệ

7 Viên hoàn Ích áp cao

Cao giảo cổ lam, cao vương tôn

Công ty TNHH thảo dược Kiên Minh 29530/2017/ATTP- XNCB

Ba gạc, Ba kích, Cúc hoa, Hòe hoa, ALA, L-arginin,

Công ty trách nhiệm hữu hạn Medistar Việt Nam

Hoàn lục vị bổ thận âm

Thục địa, sơn thù, trạch tả, hoài sơn, phục linh, đơn bì

Tư âm bổ thận hoàn

Thục địa, sơn thù, trạch tả, hoài sơn, phục linh, đơn bì, mạch môn, thạch hộc, đỗ trọng, ngưu tất

Công ty TNHH y học cổ truyền Đại Hồng Phúc

Viên nang mềm Hạ huyết áp PV

Hoàng cầm, hạ khô thảo, hoa hòe, ngưu tất, đương qui, sinh địa, đan sâm, câu đằng, thảo quyết minh, địa long, trân châu

* Với nội dung tổng quan đã nêu, có thể thấy rằng:

Nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật phân tích nhạy cao để phát hiện các dược chất kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trong các chế phẩm dược liệu, đặc biệt là từ nguồn gốc không rõ ràng, là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn lớn Các nghiên cứu hiện tại thường chỉ áp dụng một kỹ thuật phân tích duy nhất như TLC, HPLC hoặc LC-MS/MS và chủ yếu dựa trên mẫu của một sản phẩm cụ thể, do đó chưa thể hiện tính đại diện cho nhiều loại sản phẩm dược liệu Hầu hết các nghiên cứu phân tích đồng thời nhiều dược chất điều trị tăng huyết áp hay kháng histamin đều là của các nhà khoa học quốc tế, sử dụng các phương pháp sắc ký hiện đại như Q-TOF và LC-MS/MS.

Không có kỹ thuật phân tích nào có thể xử lý tất cả các chất một cách độc lập; do đó, việc kết hợp các phương pháp phân tích sẽ nâng cao độ tin cậy của kết quả và khả năng ứng dụng thực tiễn Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc xây dựng và phát triển một hệ thống các phương pháp, bắt đầu từ sàng lọc nhanh bằng phương pháp đơn giản (TLC) cho đến việc định lượng các chất với độ chính xác cao hơn thông qua các phương pháp như HPLC và LC-MS/MS.

Bài viết đề cập đến 4 dược chất điều trị tăng huyết áp (Amlodipin, Felodipin, Furosemid, Nifedipin) và 5 dược chất kháng histamin (Cinarizin, Clorpheniramin, Cyproheptadin, Loratadin, Promethazin) được chọn lựa dựa trên đánh giá nguy cơ bị lạm dụng trong sản phẩm dược liệu Những dược chất này có đặc điểm là phổ biến, dễ tìm, giá thành thấp và đã được phát hiện trong một số sản phẩm dược liệu theo các nghiên cứu toàn cầu.

Với cấu trúc hóa học và tính chất của các chất nghiên cứu, việc lựa chọn các kỹ thuật phân tích như TLC, HPLC và LC-MS/MS là phù hợp và khả thi Dựa vào đặc tính hóa lý và các kết quả đã công bố, chúng tôi khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu để tách và phát hiện các chất phân tích Nghiên cứu không chỉ kế thừa các kết quả đã có mà còn mở rộng đối tượng áp dụng, thiết lập hệ thống quy trình thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả trong ứng dụng thực tiễn.

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, trang thiết bị

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 Cinarizin Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTHCM Hàm lượng: 99,7% (nguyên trạng) SKS: QT082060916

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTHCM Hàm lượng: 100,34% (nguyên trạng) SKS: QT145090516

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,75% (nguyên trạng) SKS: 0209032

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 100,64%, độ ẩm 7,6%

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,30%, độ ẩm 0,06%

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,51% (nguyên trạng), độ ẩm 0,07%; SKS: 0103128

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,24% (khan), độ ẩm 0,02%; SKS: 0108242

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,68% (nguyên trạng) SKS: C0319200.03

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,65% (khan), độ ẩm 0,13%; SKS : 0204085

Các dược liệu bào chế nền mẫu bao gồm: Liên kiều, bạc hà, bạch thược, cam thảo, cát cánh, chi tử, đạm đậu xị, đan bì, huyền sâm, khương hoạt, kim ngân hoa, kinh giới, ngưu bàng tử, phòng phong, ké đầu ngựa, sài hồ, thăng ma, xuyên khung, hoài sơn, mẫu đơn bì, thục địa, sơn thù du, trạch tả, bạch linh, râu ngô, hạ khô thảo, rễ nhàu, cúc hoa, mã đề, hoa hòe, ngưu tất, đỗ trọng, và táo nhân Tất cả các dược liệu này được mua lại từ Công ty Dược phẩm Tâm Bình và đã được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển.

- Dung môi, hóa chất: Methanol, acetonitril, acid formic loại dùng cho HPLC và

LC-MS (Merck) Dung môi hữu cơ khác như n-hexan, ethyl acetat, acid acetic, cloroform, n-butyl acetat, amoniac sử dụng loại tinh khiết phân tích (Prolabo, Baker; Merck, …)

Các tá dược phổ biến trong bào chế viên nén và viên nang cứng bao gồm bột talc, magnesi stearat, cellulose vi tinh thể, tinh bột, sorbitol 50%, glycerin, propylen glycol và gôm xanthan đạt tiêu chuẩn dược dụng Tất cả các nguyên liệu này được cung cấp bởi công ty cổ phần dược phẩm Traphaco.

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Agilent 6460 Triple Quad LC-MS/MS, Mỹ

- Hệ thống HPLC Shimazu 20AD với detector UV-PDA, Nhật

- Hệ thống HPLC Waters Alliance e2695 detector PDA, Mỹ

Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ) bao gồm các thiết bị như bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động và máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm video Scan của Camag cho phép quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký và xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính một cách hiệu quả.

- Bản mỏng TLC và HPTLC Silica gel 60 F254 của Merck – Đức

- Cân phân tích Mettler – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg)

- Cân phân tích Mettler – Toledo XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg)

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 – Ý

- Máy lọc hút chân không

- Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức

- Máy siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc

- Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức

- Các dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, pipet, micropipet, mao quản, ống ly tâm,…

Các trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia đều được chứng nhận đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và/hoặc GLP.

Đối tượng nghiên cứu

Các chế phẩm từ dược liệu như thuốc dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe được sử dụng để điều trị và hỗ trợ điều trị các bệnh như cảm cúm, dị ứng, mẩn ngứa, tăng huyết áp và lợi tiểu Những sản phẩm này có sẵn ở nhiều dạng bào chế khác nhau và có thể được mua tại các nhà thuốc hoặc trực tuyến Danh mục các mẫu thử trong nghiên cứu được trình bày chi tiết ở Phụ lục 4.

Hai mẫu nền chuẩn bị từ dược liệu có tác dụng điều trị cảm cúm, dị ứng và mẩn ngứa bao gồm mẫu nền N1 hoặc DU.N1 dạng rắn và mẫu nền N2 hoặc DU.N2 dạng lỏng.

Hai mẫu nền chuẩn HA.N1 và HA.N2 được phát triển từ các dược liệu có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, với mẫu HA.N1 ở dạng rắn và mẫu HA.N2 ở dạng lỏng.

Mẫu nền cần được chuẩn bị bằng cách cân chính xác và thêm một lượng dung dịch chuẩn theo tỉ lệ nhất định Sau khi thêm dung dịch, để yên mẫu trong 15 phút trước khi tiến hành xử lý theo quy trình đã định.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng và bào chế nền mẫu

2.3.1.1 Phương pháp xây dựng công thức nền mẫu

Thành phần nền mẫu cho chế phẩm dược liệu được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông và các bài thuốc kinh điển Danh mục thuốc cổ truyền và vị thuốc thiết yếu được quy định trong Thông tư số 19/2018/TT-BYT và Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT Nghiên cứu khoa học đã chỉ ra tác dụng của dược liệu trong điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, tăng huyết áp và lợi tiểu.

2.3.1.2 Phương pháp bào chế nền mẫu

Các dược liệu trong công thức được chế biến thành cao lỏng (Mẫu nền N2) và cao khô (Mẫu nền N1) theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V, sử dụng phương pháp sắc với nước Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết trên cách thủy cho đến khi 1 ml cao tương ứng với 1 g dược liệu, từ đó thu được cao lỏng Dịch chiết sau đó được cô đặc và sấy khô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60°C, tạo ra cao khô.

Các tá dược được cân hoặc đong theo tỷ lệ trong công thức thành phần, trộn đều

2.3.2 Xây dựng qui trình định tính bằng HPTLC

2.3.2.1 Chuẩn bị các dung dịch

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc đơn 1 mg/mL, cân chính xác khoảng 10 mg của các chất chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR, PRO, AML, FEL, FUR, NIF vào các bình định mức 10,0 mL Sau đó, hòa tan và định mức đến 10,0 mL bằng methanol.

Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp các chất kháng histamin với nồng độ 1 mg/mL được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR và PRO vào một bình định mức 10,0 mL Sau đó, các chất này được hòa tan và định mức đủ 10,0 mL bằng methanol.

Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp các chất điều trị tăng huyết áp có nồng độ 1 mg/mL được tạo ra bằng cách cân chính xác khoảng 10 mg cho mỗi chuẩn AML, FEL, FUR, NIF vào một bình định mức 10,0 mL Sau đó, các chất này được hòa tan và định mức đến 10,0 mL bằng methanol.

Dung dịch chuẩn đơn với nồng độ 0,1 mg/mL được tạo ra bằng cách lấy chính xác 1,0 mL từ dung dịch chuẩn gốc đơn và cho vào các bình định mức 10,0 mL riêng biệt Sau đó, thêm methanol cho đủ thể tích.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,1 mg/mL: Lấy chính xác 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp, cho vào bình định mức 10,0 mL, thêm methanol vừa đủ thể tích

2.3.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích bằng HPTLC

* Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Đối với các dược chất nhóm kháng histamin:

Dựa trên tài liệu đã công bố và các điều kiện sẵn có, tiến hành khảo sát để xác định điều kiện tách năm chất kháng histamin CIN, CLO, CYP, LOR, và PRO với các điều kiện sắc ký dự kiến.

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254

- Hệ dung môi khai triển: Cyclohexan – aceton – triethylamin (8:2:0,5)

- Bước sóng phát hiện: 254 nm

- Nồng độ chất phân tích: 0,1 mg/mL

Sử dụng phần mềm chuyên dụng để quét phổ tại vị trí tương ứng của từng chất phân tích trên máy scanner Sau đó, chồng phổ thu được của mẫu thử tự tạo (bao gồm mẫu nền và chuẩn) với mẫu chuẩn để xác nhận chất dương tính trong mẫu thử Điều này đặc biệt quan trọng đối với các dược chất thuộc nhóm điều trị tăng huyết áp.

Dựa vào các nghiên cứu đã công bố [48], [49], [71], [80] tiến hành khảo sát các dung môi với tỷ lệ phù hợp đối với các chất nghiên cứu

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254

- Hệ dung môi khai triển:

+ Ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac (3:18:6:0,6)

+ Cloroform – ethyl acetat – acid acetic băng (6:5:0,2)

+ Toluen – ethyl acetat – acid acetic (17:13:1)

- Thể tớch chấm sắc ký: 10 àL

- Nồng độ chất phân tích: 0,1 mg/mL

- Phát hiện: Khảo sát điều kiện phát hiện với các bước sóng khác nhau bằng đèn tử ngoại

Để định tính các chất, cần lựa chọn điều kiện tách riêng và đảm bảo các vết phân tích trùng với phổ chuẩn Sử dụng phần mềm chuyên dụng để quét phổ tại vị trí tương ứng của từng chất trên máy scanner Sau đó, chồng phổ thu được từ mẫu thử (mẫu nền thêm chuẩn) với mẫu chuẩn để xác nhận sự hiện diện của chất dương tính trong mẫu thử.

* Khảo sát và lựa chọn khoảng nồng độ chất phân tích

Dung dịch chuẩn hỗn hợp được pha loãng bằng dung môi mẫu để tạo ra các dung dịch có nồng độ 10, 20, 50 và 100 µg/mL Sắc ký được thực hiện theo các điều kiện đã định để xác định các vết sắc ký Các vết này được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm bằng mắt thường Khoảng nồng độ làm việc được xác định là nồng độ mà các vết sắc ký có thể quan sát rõ ràng trong điều kiện phát hiện đã chọn, với nồng độ tối ưu để chấm sắc ký là 100 µg/mL.

Dựa vào tính tan của các chất phân tích [7] và một số nghiên cứu đã công bố [19],

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất nhóm kháng histamin và các chất điều trị tăng huyết áp có hiệu suất chiết xuất khác nhau, được phân tích qua phương pháp HPLC Các kết quả khảo sát cho thấy sự khác biệt trong hiệu quả chiết xuất của các chất này.

- Đồng nhất mẫu: Mẫu thử dạng rắn (khoảng 5 g hoặc 5-10 đơn vị mẫu chế phẩm) được nghiền mịn; mẫu dạng lỏng (khoảng 10 mL hoặc 3-5 đơn vị mẫu chế phẩm)

- Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu dạng rắn hoặc 1,00 g mẫu dạng lỏng vào ống falcon

- Thêm chính xác 10,0 mL methanol

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp dịch trong được lọc qua màng lọc PTFE cú kớch cỡ lỗ lọc 0,45 àm

Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các chất nghiên cứu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016 và ICH [44], [45], [61]:

Phân tích đồng thời 3 mẫu: Dung dịch hỗn hợp chuẩn chất phân tích, mẫu nền và mẫu nền thêm chuẩn trên hệ thống HPTLC Thực hiện trên 2 nền mẫu

Trên sắc ký đồ của mẫu nền thêm chuẩn, các vết chính cần phải có màu sắc và giá trị Rf tương đồng với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn Hệ số phù hợp giữa phổ của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải lớn hơn 0,99 Đồng thời, sắc ký đồ của mẫu nền không được xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu nền thêm chuẩn.

- Giới hạn phát hiện (LOD):

Thêm hỗn hợp chuẩn vào nền mẫu với nồng độ giảm dần:

Đối với nhóm điều trị tăng huyết áp, cần thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 mg/mL lần lượt là 1000 àL, 500 àL, 200 àL và 100 àL vào nền mẫu (0,50 g cho nền rắn hoặc 1,00 g cho nền lỏng), tương ứng với dung dịch đem chấm sắc ký có nồng độ 100 àg, 50 àg, 20 àg và 10 àg/mL Sau khi lắc đều, để yên trong 15 phút.

Đối với nhóm kháng histamin, cần thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 mg/mL vào nền mẫu, cụ thể là 100 àL, 60 àL, 30 àL và 20 àL cho nền rắn (0,50 g) hoặc nền lỏng (1,00 g) Những lượng này tương ứng với nồng độ dung dịch đem chấm sắc ký là 10 àg, 6 àg, 3 àg và 2 àg/mL Sau khi thêm dung dịch, lắc đều và để yên trong 15 phút.

Xử lý mẫu theo quy trình đã xác định và thực hiện sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn LOD, hay giới hạn phát hiện, là nồng độ thấp nhất có thể quan sát bằng mắt thường.

2.3.3 Xây dựng qui trình định tính, định lượng bằng HPLC

2.3.3.1 Chuẩn bị các dung dịch

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Xây dựng và bào chế nền mẫu

3.1.1 Xây dựng công thức nền mẫu

3.1.1.1 Xây dựng công thức nền mẫu chế phẩm có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa

Dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông và các bài thuốc kinh điển, Bộ Y tế đã công nhận danh mục thuốc cổ truyền Các chế phẩm thuốc có thị phần lớn trên thị trường đã tham khảo ba bài thuốc đặc trưng, được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Các bài thuốc đặc trưng điều trị, hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa

Bài thuốc: Liên kiều bại độc tán

Bài thuốc: Tiêu phong tán gia giảm

Chi tử 12 g Đạm đậu xị 20 g Đan bì 8 g

Xuyên khung 10 g Đạm trúc diệp 16 g Đương qui 12 g

Từ đó lựa chọn và xây dựng được thành phần công thức nền mẫu dùng để phân tích các dược chất kháng histamin, được trình bày trong bảng 3.2:

Bảng 3.2 Thành phần công thức nền mẫu để phân tích các dược chất thuộc nhóm kháng histamin

TT Dược liệu Khối lượng

2 Bạc hà 8 11 Kim ngân hoa 10

4 Cam thảo 8 13 Ngưu bàng tử 12

6 Chi tử 12 15 Ké đầu ngựa 8

7 Đạm đậu xị 10 16 Sài hồ 12

3.1.1.2 Xây dựng công thức nền mẫu chế phẩm có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị tăng huyết áp

Dựa trên nguyên lý của Y học cổ truyền phương Đông và các bài thuốc kinh điển, Bộ Y tế đã công nhận danh mục thuốc cổ truyền Các chế phẩm chứa dược liệu có thị phần lớn trên thị trường đã được tham khảo từ ba bài thuốc đặc trưng, như trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3 Các bài thuốc đặc trưng có tác dụng điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu

Bài thuốc Hoàn lục vị gia giảm

Hạ áp thể đờm thấp

Dựa trên nghiên cứu, chúng tôi đã lựa chọn và xây dựng thành phần công thức nền mẫu phục vụ cho việc phân tích các dược chất điều trị tăng huyết áp, như được thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.4 Thành phần công thức nền mẫu để phân tích dược chất điều trị tăng HA

TT Dược liệu Khối lượng

2 Mẫu đơn bì 12 10 Mã đề 20

4 Sơn thù du 16 12 Ngưu tất 10

3.1.2.1 Bào chế nền mẫu dạng lỏng từ dược liệu

- Dược liệu được rửa sạch, để ráo và sấy khô ở nhiệt độ khoảng 60 o C

- Các dược liệu được thái lát mỏng, cắt nhỏ nếu cần

- Cân dược liệu theo tỷ lệ như bảng 3.2 và bảng 3.4 gấp 5 lần mỗi mẻ

Để chế biến dược liệu, cho vào nồi và thêm nước ngập khoảng 3 cm trên bề mặt dược liệu Đun sôi nhẹ trong 3 giờ, nhớ bổ sung nước định kỳ để đảm bảo nước luôn ngập dược liệu Sau đó, gạn dịch sang một nồi khác và lặp lại quy trình một lần nữa, tập trung dịch vào nồi đầu tiên.

- Lọc dịch qua 2 lần vải xô

- Cô dịch cách thủy đến tỷ lệ 5:1 được nền mẫu lỏng

3.1.2.2 Bào chế nền mẫu dạng rắn

- Tiến hành tương tự như qui trình bào chế nền mẫu dạng lỏng thu được cao lỏng

- Cô cao lỏng trên cách thủy thành cao đặc

- Sấy cao đặc đến khô trong tủ sấy chân không ở 60 o C, thu được nền mẫu rắn.

Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm kháng

trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

3.2.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn CLO, CYP, CIN, LOR, PRO và chuẩn gốc hỗn hợp 5 chất trong methanol có nồng độ 0,1 mg/ml

❖ Đánh giá điều kiện sắc ký:

Tiến hành phân tích hỗn hợp 5 chất theo điều kiện đã nêu trong mục 2.3.2.2 Kết quả phân tích được thể hiện qua hình 3.1, với quét phổ UV trong khoảng bước sóng từ

200 nm đến 400 nm tại vị trí vết của 5 chất phân tích trong sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp Kết quả được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPTLC phân tích các dược chất nhóm kháng histamin H1

Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV của các chất nhóm kháng histamin H1 trong phân tích bằng

➢ Từ kết quả thu được, điều kiện sắc ký được lựa chọn là:

- Pha tĩnh: Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254

- Hệ dung môi khai triển: Cyclohexan – aceton – triethylamin (8: 2: 0,5)

Phân tích đồng thời 5 mẫu hỗn hợp chuẩn CLO, LOR, PRO, CYP, CIN với nồng độ 0,1 mg/ml trên hai loại nền mẫu (DU.N1 và DU.N2) cho thấy sự xuất hiện vết có màu sắc và Rf tương đương với vết của mẫu chuẩn trên sắc ký đồ của các mẫu nền thêm chuẩn Ngược lại, mẫu nền không thêm chuẩn không xuất hiện vết tương ứng Kết quả cho thấy hệ số match của cả 5 chất đều đạt lớn hơn 0,997, chứng tỏ phương pháp sắc ký HPTLC đảm bảo độ đặc hiệu trong việc phát hiện các chất nghiên cứu trên các nền mẫu chế phẩm chứa dược liệu.

Hình 3.3 SKĐ HPTLC đánh giá độ đặc hiệu của các chất nhóm kháng histamin H1

Hình 3.4 Kết quả chồng phổ hấp thụ tại vị trí tương ứng với vết của PRO trên sắc ký đồ mẫu nền DU.N1 thêm chuẩn và mẫu chuẩn

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC đối với dược chất nhóm kháng histamin H1

Chất phân tích Rf Màu sắc vết

Hệ số match Nền N1 Nền N2

❖ Giới hạn phát hiện (LOD):

Thêm 1 mg/mL dung dịch chuẩn vào 0,50 g bột nền mẫu DU.N1 hoặc 1,00 g dịch nền mẫu DU.N2 Sau khi xử lý theo quy trình, thu được dung dịch có nồng độ chất phân tích 2 – 3 – 6 – 10 µg/mL Tiến hành sắc ký để phân tích mẫu.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với cả hai nền mẫu, các vết CLO và LOR được quan sát rõ ràng ở dung dịch nồng độ 10 àg/mL, trong khi các vết PRO, CYP và CIN được ghi nhận rõ ràng ở dung dịch nồng độ 6 àg/mL Kết quả LOD của phương pháp cho năm chất nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.6 và minh họa ở hình 3.5.

Hình 3.5 Sắc ký đồ xác định LOD của các chất nhóm kháng histamin H1 bằng

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định LOD của phương pháp HPTLC phân tích các dược chất nhóm kháng histamin H1

Mẫu nền DU.N1 Mẫu nền DU.N2

Nồng độ dung dịch sắc ký (àg/vết)

Nồng độ tính trên nền mẫu (mg/g)

Như vậy, phương pháp có độ chọn lọc đảm bảo, LOD nằm trong khoảng 0,06 – 0,20 mg/g mẫu thử

Chuẩn bị các dung dịch như trình bày ở mục 2.3.3.1

❖ Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký:

Tiến hành phân tích hỗn hợp 5 chất với điều kiện như trình bày ở mục 2.3.3.2

Hình 3.6 SKĐ HPLC khảo sát cột sắc ký tách các dược chất nhóm kháng histamin H1: (a) Cột InertSustain C18; (b) Cột Zorbax SB-C18; (c) Cột Waters Xbridge C18

Cả ba cột (a), (b) và (c) đều được sử dụng với các hình ảnh tách biệt, chân hình gọn gàng và cân đối, đạt độ phân giải đường nền, cho phép áp dụng trong nghiên cứu Trong nghiên cứu này, cột Waters Xbridge C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) đã được lựa chọn dựa trên điều kiện sẵn có.

❖ Lựa chọn bước sóng phân tích

Quét phổ UV tại thời điểm tương ứng với thời gian lưu pic của từng chất trên sắc ký đồ trong khoảng bước sóng từ 190 đến 400 nm, với kết quả được trình bày trong hình 3.7.

Hình 3.7 Phổ hấp thụ UV của các dược chất nhóm kháng histamin H1

Kết quả từ hình 3.7 chỉ ra rằng tại bước sóng 254 nm, các chất đều có phản ứng mạnh, vì vậy bước sóng này được chọn để phát hiện cả 5 chất phân tích trong nghiên cứu.

3.2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc trong methanol có nồng độ các chất CIN, CLO, CYP, LOR, PRO là 1,0 mg/ml

Thêm dung dịch chuẩn hỗn hợp vào nền mẫu, sau đó chiết với 20 ml dung môi và xử lý mẫu theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.3 Các dung môi được khảo sát bao gồm methanol và hỗn hợp methanol – nước với tỷ lệ 90:10 Kết quả chiết xuất được trình bày chi tiết trong bảng 3.7 và hình 3.8.

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát dung môi chiết các dược chất nhóm kháng histamin H1

Mẫu nền rắn (DU.N1) Mẫu nền lỏng (DU.N2)

Hình 3.8 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết các chất nhóm kháng histamin H1 trong phân tích HPLC

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng dung môi chiết methanol (MeOH) có hiệu suất chiết cao hơn so với hỗn hợp dung môi MeOH – nước (90:10) Hơn nữa, methanol cũng cho độ ổn định cao trong quá trình chiết, với khả năng lặp lại tốt Do đó, methanol được lựa chọn làm dung môi chiết mẫu.

➢ Từ kết quả khảo sát, điều kiện phân tích được lựa chọn như sau:

Để chuẩn bị mẫu, nghiền mịn khoảng 5 g mẫu dạng rắn hoặc lắc kỹ khoảng 10 mL mẫu dạng lỏng cho đồng nhất Cân chính xác 0,50 g mẫu rắn hoặc lấy 1,00 g mẫu lỏng vào ống falcon, sau đó thêm 20 mL methanol Lắc xoáy trong 5 phút và siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 25 mL, tráng ống hai lần với 2 mL methanol mỗi lần, và thêm methanol đến vạch định mức Lắc đều và chuyển 10 mL hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút Cuối cùng, lọc lớp dịch trong qua màng lọc 0,45 µm.

- Cột sắc ký: Waters Xbridge C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: Acetonitril - dung dịch natri heptansulfonat 0,01 M (điều chỉnh tới pH = 2,8 bằng acid acetic băng); Gradient dung môi: từ 0 – 17 phút Acetonitril 38% → 67%; từ 17 – 20 phút Acetonitril từ 67% → 38%; từ 20 – 25 phút Acetonitril 38%

Hiệu suất chiết (%) DU-N2 (MeOH- H2O) DU-N1 (MeOH-H2O)

- Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

3.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

❖ Độ thích hợp hệ thống:

Trong nghiên cứu, dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL đã được tiêm lặp lại nhiều lần vào hệ thống HPLC để đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.8.

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống HPLC phân tích các dược chất nhóm kháng histamin H1 (n = 6)

Chất phân tích CLO PRO CYP LOR CIN

Diện tích pic (mAu.s) Trung bình 35952 246569 114799 101371 245173

Hệ số kéo đuôi 1,5 1,6 1,6 1,3 1,8 Độ phân giải Độ phân giải giữa các pic liền kề: đều ≥ 3 (từ 3 đến 11)

Các kết quả cho thấy thời gian lưu và diện tích pic của 6 lần sắc ký lặp lại mẫu chuẩn của 5 chất có giá trị RSD nhỏ hơn 1,1%, đáp ứng yêu cầu AOAC (< 2,0%) Hệ số kéo đuôi của các pic đều nhỏ hơn 2,0 và độ phân giải giữa các pic liền kề lớn hơn 2,0 Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng đồng thời CIN, CLO, CYP, LOR, PRO.

Phân tích đồng thời 5 mẫu hỗn hợp chuẩn CLO, LOR, PRO, CYP, CIN với nồng độ mỗi chất là 10 àg/mL trên hệ thống HPLC Mẫu nền rắn (DU.N1) và mẫu nền lỏng (DU.N2) không có chuẩn hỗn hợp cùng nồng độ 10 àg/mL Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.9.

Hình 3.9 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của nhóm kháng histamin H1 bằng HPLC: Mẫu chuẩn hỗn hợp (a); mẫu nền DU.N1 (b); mẫu nền DU.N1 thêm chuẩn

Kết quả từ hình 3.9 cho thấy, trên sắc ký đồ của cả hai mẫu nền thêm chuẩn, xuất hiện pic có thời gian lưu (RT) tương đương với RT của mẫu chuẩn Ngược lại, sắc ký đồ của mẫu nền không có pic tương ứng với RT của các chất phân tích, và các pic đều có hình dạng gọn gàng, cân đối Chồng phổ các pic từ dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu nền thêm chuẩn cho thấy hệ số Match#Angle nhỏ hơn 10%, chứng tỏ phương pháp này có độ đặc hiệu cao.

❖ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành như chỉ dẫn ở mục 2.3.3.4 đối với thẩm định chỉ tiêu LOD và LOQ Kết quả được trình bày tại bảng 3.9 và hình 3.10

Hình 3.10 Sắc ký đồ xác định LOQ nhóm kháng histamin H1 của phương pháp HPLC trên nền DU.N1 (a); mẫu nền DU.N2 (b)

Bảng 3.9 Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp HPLC phân tích các chất nhóm kháng histamin H1

Mẫu nền rắn (DU.N1) Mẫu nền lỏng (DU.N2)

(àg/mL) àg/ g mẫu nền

Nồng độ*: Nồng độ dung dịch sắc ký

Dựa trên đánh giá tỷ số tín hiệu và nhiễu nền (S/N), nồng độ LOD của dung dịch sắc ký được xác định là 0,3 àg/mL, tương ứng với hàm lượng chất phân tích trong 1 g mẫu thử là 15 àg cho nền mẫu rắn và 7,5 àg cho nền mẫu lỏng Đồng thời, điểm nồng độ LOQ của dung dịch tiêm sắc ký, với giá trị S/N ≥ 10, được xác định là 1,0 àg/mL, tương ứng với hàm lượng chất phân tích trong 1 g mẫu thử là 50 àg cho nền mẫu rắn và 25 àg cho nền mẫu lỏng.

Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

huyết áp trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn FUR, AML, NIF, FEL và chuẩn gốc hỗn hợp 4 chất trong methanol có nồng độ 0,1 mg/mL

❖ Khảo sát hệ dung môi pha động:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn là bước quan trọng trong nghiên cứu, bao gồm các dung dịch chuẩn đơn và dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất: AML, NIF, FEL, và FUR Những dung dịch này được pha chế trong methanol từ dung dịch chuẩn gốc đơn và hỗn hợp với nồng độ 1 mg/mL.

- Khảo sát trên bản mỏng silicagel gel 60 F254, chiều dài 10 cm

- Thể tớch chấm 10 àL, bước súng phỏt hiện 254 nm, 366 nm, thực hiện sắc ký với các hệ dung môi:

• Hệ 1: Ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac (3:18:6:0,6)

• Hệ 2: Cloroform – ethyl acetat – acid acetic băng (6:5:0,2)

• Hệ 3: Ethyl acetat – methanol – amoniac (8:2:0,1)

• Hệ 4: Toluen – ethyl acetat – acid acetic (17:13:1)

- Kết quả được trình bày ở hình 3.18

Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát thành phần dung môi pha động HPTLC tách các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

Kết quả từ hình 3.18 cho thấy rằng trong các hệ pha động được khảo sát, hệ 1 cho các vết của các chất nghiên cứu tách rời và gọn gàng Trong khi đó, hệ 2 cho thấy vết của AML chưa được rửa giải và vẫn ở vị trí ban đầu Hệ 3 cho thấy vết của AML và FUR chồng nhau, cùng với vết của NIF và FEL cũng chồng nhau Cuối cùng, hệ 4 cho thấy vết của AML không di chuyển với Rf = 0 Do đó, hệ dung môi 1 là lựa chọn tối ưu cho nghiên cứu.

❖ Xác định phổ hấp thụ UV - Vis:

Quá trình quét phổ UV được thực hiện trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm, tập trung vào vị trí vết của bốn chất phân tích trong sắc ký đồ của cả chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp Kết quả của quá trình này được thể hiện rõ ràng trong hình 3.19.

Hình 3.19 Phổ hấp thụ UV của các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp trong phân tích bằng HPTLC

* Nhận xét: Quét phổ tại các vết tương ứng các chất trên sắc ký đồ, kết quả cho thấy

NIF và FUR có khả năng hấp thụ mạnh ở bước sóng 254 nm, trong khi AML và FEL hấp thụ hiệu quả ở bước sóng 366 nm Do đó, việc lựa chọn cặp bước sóng này là cần thiết để phát hiện các chất trong nghiên cứu.

➢ Từ kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký như sau:

- Pha tĩnh: Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254, kích thước 20 cm × 10 cm

- Hệ dung môi khai triển: Ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac (1,5:9:3:0,3)

- Bước sóng phát hiện: 254 nm với NIF, FUR; 366 nm với AML và FEL

Phân tích 5 mẫu hỗn hợp chuẩn FUR, AML, NIF, FEL với nồng độ 0,1 mg/ml cùng với mẫu nền cao khô (HA.N1) và cao lỏng (HA.N2) cho thấy kết quả đáng chú ý Sắc ký đồ của mẫu nền thêm chuẩn xuất hiện vết có Rf và màu sắc tương đương với mẫu chuẩn, trong khi các mẫu nền không thêm chuẩn không có vết tương ứng Chồng phổ vết cho thấy hệ số match của cả 4 chất đều lớn hơn 0,997, chứng tỏ phương pháp đảm bảo độ chọn lọc cao để phát hiện các chất nghiên cứu.

2 nền mẫu chế phẩm chứa dược liệu đã xây dựng

Hình 3.20 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện ở bước sóng

254 nm (a); 366 nm (b); Kết quả chồng phổ hấp thụ tại vị trí tương ứng với vết của

FUR trên sắc ký đồ mẫu nền HA.N1 thêm chuẩn và chuẩn (c)

Bảng 3.20 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC đối với dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

Rf Màu sắc vết phát hiện ở bước sóng

Hệ số match chồng phổ

254 nm 366 nm Nền HA.N1 Nền HA.N2

❖ Giới hạn phát hiện (LOD):

Thêm 1 mg/mL dung dịch chuẩn gốc vào 0,50 g bột nền mẫu HA.N1 hoặc 1,00 g dịch nền mẫu HA.N2 để thu được các dung dịch có nồng độ phân tích 10 – 20 – 50 – 100 àg/mL (C1, C2, C3, C4) Tiến hành sắc ký để xác định LOD, tức là nồng độ thấp nhất có thể quan sát bằng mắt thường.

Kết quả nghiên cứu cho nền HA.N1 cho thấy vết NIF chỉ quan sát được ở dung dịch C2, trong khi các vết khác đều phát hiện ở dung dịch C1 Đối với nền HA.N2, vết AML và FEL được quan sát ở dung dịch C1, còn vết FUR và NIF phát hiện ở dung dịch C2 LOD của phương pháp đối với cả 4 chất nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.21 và minh họa ở hình 3.21.

Phát hiện ở bước sóng 254 nm Phát hiện ở bước sóng 366 nm

Hình 3.21 Sắc ký đồ xác định LOD của các chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng

Bảng 3.21 Kết quả thẩm định LOD của phương pháp HPTLC phân tích các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

Mẫu nền HA.N1 Mẫu nền HA.N2

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đạt độ đặc hiệu cao, với giới hạn phát hiện (LOD) đối với bốn chất phân tích AML, FEL, NIF và FUR nằm trong khoảng 0,1.

Chuẩn bị các dung dịch như trình bày ở mục 2.3.3.1

❖ Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký:

Tiến hành phân tích hỗn hợp 4 chất với điều kiện như trình bày ở mục 2.3.2.2

Kết quả được trình bày ở hình 3.22

Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC khảo sát cột sắc ký tách các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp: (a) Cột InertSustain C18; (b) Cột Zorbax SB-C18; (c) Cột Waters Xbridge

Sử dụng cả ba cột (a), (b) và (c) với các hình ảnh tách biệt, chân hình gọn gàng và cân đối, đạt độ phân giải đường nền, cho phép cả ba cột này được áp dụng trong nghiên cứu Trong nghiên cứu này, cột Waters Xbridge C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) đã được lựa chọn dựa trên các điều kiện sẵn có.

❖ Lựa chọn bước sóng phân tích

Quét phổ UV tại vị trí tương ứng với thời gian lưu pic của từng chất trên sắc ký đồ trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm Kết quả này được thể hiện rõ ràng trong hình 3.23.

Hình 3.23 Phổ hấp thụ UV của các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trong phân tích bằng HPLC

* Nhận xét: Hình 3.23 cho thấy, 4 chất phân tích đều có độ hấp thụ lớn trong khoảng từ

Trong khoảng 230 nm đến 240 nm, FEL có độ hấp thụ thấp nhất và liều sử dụng thấp nhất trong bốn chất phân tích Do đó, bước sóng 238 nm được chọn làm bước sóng phân tích để thực hiện định tính và định lượng đồng thời cho cả bốn chất.

3.3.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol có nồng độ các chất AML, FEL, FUR, NIF là 1 mg/mL

Thêm 250 µL dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1 mg/mL vào 1,00 g mẫu nền và thực hiện xử lý mẫu theo hướng dẫn ở mục 2.3.3.3 Các dung môi chiết được khảo sát bao gồm methanol và hỗn hợp acetonitril - nước với tỷ lệ 50:50 Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.22 và hình 3.24.

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát dung môi chiết các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

(n = 6) trong phân tích bằng HPLC

Mẫu nền rắn (HA.N1) Mẫu nền lỏng (HA.N2)

Hình 3.24 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp trong phân tích HPLC

Kết quả nghiên cứu cho thấy dung môi chiết methanol (MeOH) có hiệu suất chiết cao hơn so với hỗn hợp dung môi acetonitril và nước (50:50) Điều này cũng cho thấy độ ổn định và khả năng lặp lại trong quá trình chiết là tốt, vì vậy methanol được lựa chọn làm dung môi chiết mẫu.

➢ Từ kết quả khảo sát, điều kiện phân tích được lựa chọn như sau:

Mẫu thử dạng rắn (khoảng 5 g) được nghiền mịn, trong khi mẫu dạng lỏng (khoảng 10 mL) được lắc đều Cân chính xác khoảng 1,00 g mẫu vào ống falcon và thêm khoảng 20 mL methanol Lắc xoáy trong 5 phút và siêu âm trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 25 mL, tráng ống hai lần với khoảng 2 mL methanol mỗi lần, và tập trung dịch rửa vào bình định mức, sau đó thêm methanol tới vạch Lắc đều và chuyển khoảng 10 mL hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút Cuối cùng, lớp dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 µm.

- Cột sắc ký: Waters Xbridge C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: Kênh A: Dung dịch acid phosphoric 0,1%

Chương trình pha động: 0 → 10 phút: 30% B; 10 → 20 phút: 30 → 60% B; 20 → 32 phút: 60% B; 32 → 33 phút: 60 → 30% B; 33 → 38 phút: 30% B

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

3.3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

❖ Độ thích hợp hệ thống:

Tiến hành lặp lại nhiều lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL trong hệ thống HPLC để đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.23.

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống HPLC phân tích các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

Chất phân tích FUR AML NIF FEL

Diện tích pic (mAU.s) Trung bình 575004 290745,5 278221,3 300097,3

Hệ số kéo đuôi 1,4 1,6 1,4 1,3 Độ phân giải Độ phân giải giữa các pic liền kề: đều > 10 (từ 14 đến 31)

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng trong phân tích mẫu thực

Phương pháp HPTLC được áp dụng để sàng lọc các mẫu chế phẩm chứa dược liệu và thực phẩm chức năng đã thu thập, trong khi HPLC và LC-MS/MS được sử dụng để phân tích và xác nhận kết quả trên toàn bộ mẫu.

3.4.1 Xác định các dược chất nhóm kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

Trong quá trình xử lý và phân tích các mẫu thử theo quy trình đã được thiết lập, kết quả cho thấy 44/55 mẫu không phát hiện cả 5 chất nghiên cứu, trong khi 11/55 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất này (xem bảng 3.37 và hình 3.34) Đối với các mẫu dương tính, việc quét và chồng phổ vết chất phân tích trên sắc ký đồ cho thấy hệ số match đều lớn hơn 0,99, như minh họa trong hình 3.35 với mẫu BNH93 (dương tính với CLO).

Hình 3.34 Sắc ký đồ HPTLC phân tích một số mẫu thực phát hiện các chất nhóm kháng histamin H1 (1 Mẫu HCH164; 2 Mẫu HCH04; 8 Mẫu VNA05; 10 Mẫu

Hình 3.35 Kết quả chồng phổ UV tại vị trí có R f = 0,27 (vết CLO) của mẫu dương tính

Bảng 3.37 Kết quả phân tích các mẫu dương tính với các chất nhóm kháng histamin

TT Mẫu thử Dạng bào chế Nguồn gốc Chất phát hiện

1 BNH93 Bột Mua Online CLO 0,27 0,9924

2 HA29 Hoàn mềm Mua Online CLO 0,26 0,9994

3 HCH99 Hoàn cứng Mua của

5 VNA05 Viên nang cứng Mẫu gửi CLO 0,26 0,9984

6 VNA35 Viên nang cứng Mẫu gửi CLO 0,26 0,9927

7 HA26-L17 Hoàn mềm Mua của

8 HA32 Hoàn mềm Mua Online CLO 0,26 0,9945

9 HCH04 Bột Mẫu gửi CLO 0,26 0,9962

10 HCH164 Hoàn cứng Mua Online CLO 0,26 0,9936

11 HCH94 Hoàn cứng Mẫu gửi CLO 0,26 0,9925

Trong quá trình xử lý và phân tích các mẫu thử theo quy trình đã thiết lập, kết quả cho thấy 43/55 mẫu không phát hiện 5 chất nghiên cứu, trong khi 12/55 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất này (bảng 3.38) Để xác nhận chất dương tính, thời gian lưu và quét phổ của mẫu thử được so sánh với mẫu chuẩn, cho thấy hệ số Match#Angle đều thấp hơn 10,0 khi xác định CLO trong các mẫu Bảng 3.38 trình bày kết quả định tính các mẫu dương tính, và hình 3.36, hình 3.37 minh họa phân tích mẫu dương tính BNH93 Nồng độ thuốc hóa dược trong mẫu thử được tính toán dựa trên phương trình hồi qui với hệ số tương quan.

R 2 ≥ 0,99 xây dựng trong cùng ngày phân tích, bảng 3.39 là kết quả định lượng các chất dương tính nhóm kháng histamin

Bảng 3.38 Kết quả định tính các mẫu dương tính với chất nhóm kháng histamin bằng

UV Giá trị Match#Angle

Hình 3.36 Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn (a), mẫu thực dương tính BNH93 (b)

Hình 3.37 Kết quả chồng phổ UV xác nhận CLO, LOR, CIN trong mẫu BNH93

Bảng 3.39 Kết quả xác định hàm lượng các chất nhóm kháng histamin trong mẫu thử dương tính bằng HPLC

STT Mẫu thử Dạng bào chế

Kết quả định tính và xác định hàm lượng

CIN CLO CYP LOR PRO

* Nhận xét: Kết quả ở hình 3.36 và hình 3.37 cho thấy trên sắc ký đồ mẫu thử xuất hiện

Kết quả phân tích cho thấy 3 mẫu thử có thời gian lưu tương ứng với CLO, LOR và CIN, với hệ số Match#Angle lần lượt là 1,836; 31,643 và 53,304, xác nhận rằng chỉ mẫu thử CLO dương tính Tương tự, 11 mẫu thử khác cũng được xác nhận dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.39) Trong số các chất nghiên cứu, CLO được phát hiện dương tính trong tất cả 12 mẫu, với hàm lượng từ 0,21 đến 3,10 mg/g chế phẩm.

3.4.1.3 Phương pháp LC-MS/MS

Trong quá trình xử lý và phân tích các mẫu thử theo qui trình đã xây dựng, kết quả cho thấy 43/55 mẫu không phát hiện 5 chất nghiên cứu, trong khi 12/55 mẫu dương tính với các chất này Để xác định kết quả dương tính, bước đầu tiên là tính độ chệch về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ so với mẫu chuẩn; nếu độ chệch nằm trong giới hạn chấp nhận (≤ 2,5%), sẽ tiến hành bước tiếp theo Bước thứ hai là tính độ chệch tỷ lệ cường độ ion của chất phân tích trên sắc ký đồ so với mẫu chuẩn; nếu cũng nằm trong giới hạn chấp nhận, kết luận sẽ được đưa ra là dương tính.

Để xác định hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử dương tính, cần sử dụng phương trình hồi quy với hệ số tương quan R² ≥ 0,99, cùng với thông tin về lượng cân, độ pha loãng và diện tích pic của chất phân tích Đối với các chất có hàm lượng thấp hơn giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp, kết luận sẽ được đưa ra là nhỏ hơn LOD Hình 3.38, 3.39 và bảng 3.40 minh họa kết quả định tính của mẫu thực HCH99, trong khi bảng 3.41 trình bày kết quả phân tích định tính và định lượng các chất dương tính trong mẫu thực.

Ion định lượng Ion định tính Phổ đồ

Hình 3.38 Sắc ký đồ và phổ đồ LC-MS/MS phân tích mẫu chuẩn nồng độ mỗi chất

Hình 3.39 Sắc ký đồ và phổ đồ LC-MS/MS phân tích mẫu HCH99

Bảng 3.40 Kết quả định tính các chất nhóm kháng histamin trong mẫu HCH99 bằng

Tỷ lệ cường độ ion

Kết luận Thử Chuẩn Bias

LOR 5,414 5,267 2,79% Không đúng 27,9 29,8 - Không đúng

PRO 5,247 4,987 5,21% Không đúng 3,7 23,1 - Không đúng

CYP 4,986 4,941 0,91% Đúng 0 48 100% Không đúng CIN 4,961 5,063 -2,01% Đúng 20,5 22,2 -7,66% Đúng

Bảng 3.41 Kết quả định tính và định lượng các mẫu dương tính với các chất nhóm kháng histamin bằng LC-MS/MS

STT Mẫu thử Dạng bào chế

Kết quả định tính và xác định hàm lượng

CIN CLO CYP LOR PRO

Kết quả phân tích mẫu HCH99 cho thấy thời gian lưu của ba chất CLO, CYP, CIN nằm trong khoảng chấp nhận (bias ≤ 2,5%) Tỷ lệ cường độ ion của hai chất CLO và CIN cũng có độ chệch trong giới hạn chấp nhận (≤ 25%), xác nhận tính dương tính trong mẫu thử Tuy nhiên, đáp ứng pic của CIN nhỏ hơn LOD, dẫn đến mẫu HCH99 vẫn được xác định là dương tính.

CLO là chất nghiên cứu được phát hiện dương tính nhiều nhất trong số 12 mẫu thử, với 12/12 mẫu đều cho kết quả dương tính Hàm lượng CLO trong các chế phẩm này nằm trong khoảng từ 0,23 đến 3,13 mg/g, theo bảng 3.41.

Kết quả từ ba phương pháp HPTLC, HPLC và LC-MS/MS cho thấy sự tương đồng trong việc phát hiện các mẫu dương tính với nhóm kháng histamin (Bảng 3.42).

Bảng 3.42 tổng hợp kết quả định tính và định lượng các mẫu dương tính với nhóm kháng histamin, sử dụng cả ba phương pháp HPTLC, HPLC và LC-MS/MS.

Stt Mẫu thử Dạng bào chế

Kết quả định tính và xác định hàm lượng bằng LC-MS/MS

(mg/ g) CIN CLO CYP LOR PRO

3.4.2 Xác định các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

Trong quá trình xử lý và phân tích các mẫu thử theo quy trình đã định, kết quả cho thấy 47/56 mẫu không phát hiện 4 chất nghiên cứu, trong khi 9/56 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất AML, NIF, FUR Đối với các mẫu dương tính, việc so sánh phổ vết cho thấy hệ số match rất thấp, từ 0,10 đến 0,76, chứng tỏ không có mẫu nào dương tính với cả 4 chất AML, NIF, FEL, FUR Hình ảnh minh họa kết quả chồng phổ của mẫu M02 nghi ngờ dương tính với AML và FUR được trình bày trong hình 3.41.

Hình 3.40 Sắc ký đồ phân tích một số mẫu thực phát hiện các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC tại bước sóng 254 nm (a) và 366 nm (b)

Bảng 3.43 Kết quả phân tích một số mẫu thực nghi ngờ chứa các chất nhóm thuốc điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC

STT Mẫu thử Dạng bào chế Nguồn gốc Chất phân tích

8 M18 Trà thảo mộc Mẫu gửi + + - -

Hình 3.41 Kết quả chồng phổ UV tại vị trí có R f tương ứng với chất phân tích nghi ngờ dương tính trong mẫu thử M02 (nhóm điều trị tăng huyết áp)

Trong quá trình xử lý và phân tích các mẫu thử theo quy trình đã thiết lập, kết quả cho thấy 54/56 mẫu không phát hiện cả 4 chất nghiên cứu, trong khi 2/56 mẫu có dấu hiệu nghi ngờ dương tính Đối với các mẫu nghi ngờ này, việc quét và so sánh phổ tại RT pic của chất phân tích với mẫu chuẩn cho thấy hệ số Match #1 Angle lớn hơn 70, xác nhận rằng không có mẫu nào dương tính với các chất AML, NIF, FEL, và FUR Hình 3.42 và 3.43 trình bày kết quả phân tích của các mẫu M04 và M10 có nghi ngờ dương tính với AML và FUR.

Bảng 3.44 Kết quả định tính trên mẫu thực nghi ngờ chứa dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng HPLC

STT Mẫu thử Dạng bào chế Nguồn gốc Chất phân tích

1 M04 Viên nang cứng Mẫu gửi + - - -

Hình 3.42 Sắc ký đồ HPLC và kết quả chồng phổ UV của mẫu M04 nghi ngờ dương tính với amlodipin

Hình 3.43 Sắc ký đồ HPLC và kết quả chồng phổ UV của mẫu M10 nghi ngờ dương tính với furosemid 3.4.2.3 Phương pháp LC-MS/MS

Các mẫu thử đã được xử lý và phân tích theo quy trình đã thiết lập Kết quả cho thấy không phát hiện 4 chất nghiên cứu trong 56/56 mẫu Hình 3.44 minh họa kết quả phân tích LC-MS/MS của mẫu M04, nghi ngờ dương tính với AML khi phân tích bằng HPLC dựa vào RT.

Hình 3.44 Sắc ký đồ và phổ đồ MS/MS của mẫu M04 nghi ngờ dương tính với amlodipin

BÀN LUẬN

Đối tượng nghiên cứu

Sản phẩm chứa dược liệu đã được nghiên cứu và phát triển từ lâu, khẳng định vai trò quan trọng trong hệ thống y tế, góp phần chăm sóc sức khỏe cộng đồng Quyết định số 1976/QĐ-TTg phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2030.

Theo định hướng “2020 và đến năm 2030” của Thủ tướng Chính phủ ban hành ngày 30/10/2013, một trong những quan điểm quan trọng trong quy hoạch là phát triển dược liệu theo hướng sản xuất hàng hóa Điều này nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường, kết nối sản xuất nguyên liệu với tiêu thụ sản phẩm, và xây dựng vùng trồng dược liệu gắn liền với công nghiệp chế biến Sản phẩm cần có cơ cấu đa dạng, đảm bảo an toàn, chất lượng, và khả năng cạnh tranh cao, nhằm đáp ứng đủ nhu cầu sử dụng dược liệu trong nước cũng như xuất khẩu.

Sản phẩm chứa dược liệu có thể ở dạng không chế biến, bào chế dạng cao và các chế phẩm tương tự như thuốc hóa dược Việc quản lý và quy định chất lượng các chế phẩm này, bao gồm dược liệu, thuốc dược liệu, thuốc cổ truyền, vị thuốc cổ truyền và thực phẩm bảo vệ sức khỏe, đã được quy định trong Luật Dược và Luật Thực phẩm cùng với các nghị định và thông tư hướng dẫn Đặc biệt, Luật Dược năm 2016 có chương IV với 8 điều quy định riêng về dược liệu và thuốc cổ truyền sản xuất và lưu hành tại Việt Nam.

Cơ quan quản lý đã chỉ ra tình trạng sử dụng trái phép thuốc hóa dược trong các chế phẩm dược liệu, gây ra nguy cơ và tác động xấu cho sức khỏe Để kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng, nhiều quy định đã được ban hành Trong “Hướng dẫn xây dựng các yêu cầu thử nghiệm đối với thuốc từ dược liệu và TPBVSK” của nhóm làm việc về “Khoa học sức khỏe và quy định cho các sản phẩm liên quan đến sức khỏe” của FHH, có quy định về việc phát hiện chất độc hại và các chất trộn trái phép Tại Việt Nam, Thông tư 10/2021/TT-BYT của Bộ Y tế đã công bố danh mục 80 loại thuốc hóa dược và dẫn chất cấm trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, bao gồm các thuốc kháng histamin H1 như cyproheptadin, clorpheniramin, cinnarizin và thuốc điều trị tăng huyết áp như furosemid.

Đến nay, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về phương pháp phát hiện các loại thuốc giảm đau chống viêm steroid và không steroid, nhưng vẫn còn thiếu các công bố nghiên cứu về việc phát hiện chất kháng histamin và thuốc điều trị tăng huyết áp Đây là hai nhóm thuốc có nguy cơ bị trộn lẫn cao, đặc biệt trong các chế phẩm chứa dược liệu tại Việt Nam, nơi mà việc sử dụng các loại thuốc này kéo dài có thể dẫn đến tác dụng phụ nghiêm trọng.

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá nguy cơ của 5 dược chất kháng histamin H1 thường dùng trong điều trị dị ứng, bao gồm Cinarizin, clorpheniramin, cyproheptadin, loratadin và promethazin Đồng thời, 4 dược chất điều trị cao huyết áp như Furosemid, amlodipin, felodipin và nifedipin cũng được lựa chọn Những dược chất này dễ bị lạm dụng và trộn trái phép trong các chế phẩm dược liệu do tính phổ biến, dễ kiếm và giá thành thấp, đồng thời đã được phát hiện trong các sản phẩm dược liệu không rõ nguồn gốc ở nhiều quốc gia khác.

Nghiên cứu này nhằm phát triển phương pháp phân tích cho 9 loại thuốc hóa dược thuộc hai nhóm tác dụng dược lý, bao gồm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp.

Về xây dựng các nền mẫu chế phẩm chứa dược liệu

Nhu cầu sản xuất và sử dụng chế phẩm thảo dược trong nước ngày càng tăng do nhận thức về tính an toàn của sản phẩm tự nhiên Tài nguyên cây thuốc phong phú và nền y học cổ truyền lâu đời của Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho thuốc dược liệu được người tiêu dùng tin tưởng Hiện nay, các chế phẩm dược liệu phát triển đa dạng, bao gồm bài thuốc gia truyền, thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng Thành phẩm từ dược liệu được bào chế dưới nhiều dạng như viên nén, viên nang, dung dịch, cốm, bột, viên hoàn, chè thuốc, cao và thuốc, và đều trải qua quy trình sản xuất nghiêm ngặt, bao gồm cả đóng gói và dán nhãn.

Dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển,

Danh mục thuốc cổ truyền và dược liệu thiết yếu được quy định tại Thông tư số 19/2018/TT-BYT và Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT Các chế phẩm từ dược liệu có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, mề đay, cảm cúm hiện đang chiếm thị phần lớn trên thị trường Trong số đó, ba bài thuốc nổi bật là Ngân kiều tán, Liên kiều bại độc tán và Tiêu phong tán, sử dụng 18 dược liệu để làm mẫu nền trong việc thẩm định quy trình phân tích các chất hóa dược có trong sản phẩm điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa.

Trong quá trình thẩm định phương pháp phân tích các dược chất điều trị tăng huyết áp, thành phần nền mẫu được xây dựng dựa trên các bài thuốc kinh điển và thông tư danh mục thuốc cổ truyền của Bộ Y tế Các chế phẩm thuốc điều trị và hỗ trợ cho bệnh cao huyết áp chiếm thị phần lớn trên thị trường, bao gồm ba bài thuốc chính: Giáng áp hợp tễ, Hoàn lục vị gia giảm và Hạ áp thể đờm thấp, với 14 dược liệu được lựa chọn Những dược liệu này thường xuất hiện trong các công thức của mẫu thu thập và lượng sử dụng được tính toán tương đối dựa trên tỷ lệ có trong các mẫu này.

Các nền mẫu được chế tạo theo hướng dẫn của chuyên luận “Cao thuốc” trong Dược điển Việt Nam, bao gồm nền cao khô (nền mẫu rắn N1) và cao lỏng (nền mẫu lỏng N2) Qui trình bào chế cao thuốc thường trải qua hai giai đoạn: chiết xuất dược liệu bằng dung môi thích hợp và cô dịch chiết để thu được cao lỏng, cao đặc hoặc cao khô Đối với sử dụng đường uống, hầu hết các cao dược liệu đều được chiết xuất bằng nước Các phương pháp chiết xuất bao gồm ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, và các phương pháp khác Mục tiêu của nghiên cứu này là phân tích các dược chất bị trộn lẫn trong chế phẩm chứa dược liệu, với phương pháp chế tạo nền mẫu được lựa chọn là sắc với nước nhằm đánh giá nguy cơ ảnh hưởng đến việc phân tích.

Thành phần của nền mẫu lỏng và khô tương tự nhau, nhưng tỷ lệ chất chiết từ dược liệu ở nền mẫu khô cao hơn Để đánh giá chính xác ảnh hưởng của nền mẫu đến việc phân tích các chất trong các dạng chế phẩm khác nhau, cần xây dựng nền mẫu gần nhất với các dạng bào chế đó Theo quy định ISO/IEC 17025, việc xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích phải thực hiện trên từng loại nền mẫu cho từng dạng bào chế, hoặc tối thiểu ba nền mẫu để áp dụng cho tất cả Nếu nền mẫu ảnh hưởng đến kết quả phân tích, tỷ lệ nền mẫu trong dung dịch càng thấp thì ảnh hưởng càng nhỏ, dẫn đến quy trình phân tích chính xác hơn và giá trị LOD, LOQ càng thấp.

Thực tế, kết quả nghiên cứu đã cho thấy nền mẫu rắn và nền mẫu lỏng có mức độ ảnh hưởng không có nhiều sự khác biệt.

Về xây dựng phương pháp phân tích

Để xác định chất trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu, quá trình xử lý mẫu cần đạt hiệu suất chiết cao và ổn định Nghiên cứu đã khảo sát từng nhóm hoạt chất dược lý dựa trên cấu trúc hóa học và đặc tính của các chất phân tích, cùng với tài liệu đã công bố, nhằm xây dựng qui trình xử lý mẫu phù hợp.

Xử lý mẫu là bước quan trọng trong phân tích, ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phương pháp phân tích Việc lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phù hợp giúp chiết xuất hoạt chất với hiệu suất cao và giảm thiểu nhiễu nền Thị trường hiện có nhiều chế phẩm chứa dược liệu dạng rắn và lỏng với thành phần đa dạng, đòi hỏi một phương pháp xử lý mẫu nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm chi phí và phù hợp với điều kiện phân tích Nghiên cứu đã khảo sát các yếu tố trong quá trình xử lý mẫu như số lần chiết, cách chiết, thời gian chiết, dung môi chiết và thời gian siêu âm để tối ưu hóa quá trình chiết mẫu.

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích các chất bị trộn lẫn trong sản phẩm từ dược liệu thông qua phương pháp chiết mẫu trực tiếp, nhằm đảm bảo tính toàn vẹn và hiệu suất chiết cao Methanol được chọn làm dung môi chính vì khả năng chiết tốt hơn so với ethanol và acetonitril, mặc dù ethanol là dung môi rẻ và ít độc Kết quả cho thấy phương pháp chiết bằng methanol đạt hiệu suất chiết trên 96%, đáp ứng yêu cầu xây dựng quy trình xử lý mẫu hiệu quả, loại bỏ nhiều chất nền không mong muốn Phương pháp này sẽ được áp dụng cho cả ba kỹ thuật phân tích sắc ký: HPLC, HPTLC và LC-MS/MS, trong việc phân tích các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp.

Phương pháp xử lý và dung môi chiết mẫu cũng phù hợp với các công bố đối với các chất phân tích đã được nghiên cứu [15], [18], [19]

HPTLC có ưu điểm nổi bật là khả năng phân tích đồng thời nhiều mẫu trong cùng một điều kiện sắc ký, giúp tiết kiệm thời gian và hóa chất Với bản mỏng kích thước 20 cm × 10 cm, HPTLC có thể phân tích tối đa 20 mẫu chỉ trong khoảng 30 phút, rất phù hợp cho các phân tích sàng lọc với số lượng mẫu lớn.

Nghiên cứu hiện nay thường sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 với chi phí hợp lý, kết hợp cùng các dung môi dễ tìm như cyclohexan, aceton, triethylamin, ethyl acetat, toluen, methanol, amoniac, acid acetic băng và cloroform, nhằm khảo sát và xây dựng các điều kiện sắc ký hiệu quả.

4.3.2.1 Qui trình phát hiện các thuốc nhóm thuốc kháng histamin H1 bằng HPTLC

Trong nghiên cứu về nhóm thuốc kháng histamin H1, việc lựa chọn hệ dung môi phù hợp được thực hiện dựa trên tài liệu tham khảo [18], [41] Các chất thuộc nhóm điều trị tăng huyết áp cũng được xây dựng tương tự, sử dụng chương trình sắc ký với bản mỏng Silica gel 60 F254 và phát hiện ở bước sóng 254 nm Nồng độ dung dịch chất phân tích được thiết lập ở mức 0,1 mg/mL, với thể tích chấm là 10 µL, tương ứng với lượng chất cần phân tích trên bản mỏng là 1 µg/vết.

Kết quả đánh giá hệ dung môi khai triển cho các chất nhóm thuốc kháng histamin cho thấy các chất phân tích đều là các chất phân cực, do đó hệ dung môi khai triển chủ yếu là dung môi hữu cơ ít phân cực với sự có mặt của triethylamin Điều này giúp các pic tách hoàn toàn khỏi nhau, với hệ số di chuyển Rf nằm trong khoảng tối ưu từ 0,2 đến 0,8 Hệ số match của cả 5 chất khi chồng phổ vết trên sắc ký đồ đạt lớn hơn 0,997, chứng tỏ phương pháp đảm bảo độ đặc hiệu trong việc phát hiện các chất nghiên cứu trên hai nền chế phẩm chứa dược liệu khảo sát.

Quy trình xác định các chất thuốc kháng histamin H1 thông qua quét phổ UV-Vis cho thấy độ hấp thụ cao ở bước sóng 254 nm, do đó bước sóng này được chọn để phát hiện Độ nhạy của phương pháp nghiên cứu có LOD khoảng 6 - 10 àg/mL, tương ứng với lượng chất phân tích từ 0,06 – 0,20 mg/g Tương tự như nghiên cứu về dược chất điều trị tăng huyết áp, giá trị LOD cho 5 dược chất CLOR, LOR, PRO, CYP và CIN cho phép phát hiện lượng rất nhỏ trong mẫu chứa dược liệu, với liều dùng thấp nhất là 2 mg cho clorpheniramin maleat Phương pháp cũng có thể phát hiện mẫu dương tính khi trộn ở mức 5% và 10% liều trong chế phẩm chứa dược liệu dạng lỏng và rắn.

4.3.2.2 Qui trình phát hiện các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC

Kết quả khảo sát hệ dung môi khai triển cho các thuốc điều trị tăng huyết áp cho thấy amlodipin không di chuyển trong hệ dung môi có tính acid với acid acetic, phù hợp với tính chất khó tan và phân cực của amlodipin besylat Do đó, hệ 2 và hệ 4 không phù hợp do chứa acid acetic Hệ dung môi 1 và 3 có amoniac phù hợp để tách amlodipin, nhưng nifedipin và felodipin khó tách do tính chất và cấu trúc tương tự Hệ 1, với sự bổ sung toluen bên cạnh ethyl acetat và methanol, đã điều chỉnh hệ số di chuyển, giúp các vết tách rõ ràng hơn.

Sử dụng tính năng quét phổ của phần mềm HPTLC giúp tăng tính chọn lọc trong việc phát hiện và phân biệt các chất, đặc biệt là trong nghiên cứu 4 dược chất điều trị tăng huyết áp Furosemid có cấu trúc và tính chất khác biệt, di chuyển nhanh hơn trong hệ sắc ký 2 và 4, nhưng chỉ đạt giá trị Rf khoảng 0,1 trong hệ 1, dễ bị xen phủ bởi các thành phần khác Việc chỉ dựa vào màu sắc và Rf có thể dẫn đến kết luận dương tính giả; tuy nhiên, sử dụng phổ đặc trưng và kết quả chồng phổ từ mẫu thử và mẫu chuẩn giúp tăng tính đặc hiệu và loại trừ dương tính giả Điều này được chứng minh qua thẩm định độ đặc hiệu, với hệ số match của cả 4 chất đều đạt trên 0,997 khi chồng phổ tại vị trí tương ứng trên sắc ký đồ.

Trong nghiên cứu này, quy trình xác định các dược chất điều trị tăng huyết áp đã lựa chọn 2 bước sóng tối ưu là 254 nm cho NIF và FUR, cùng 366 nm cho AML và FEL Việc chọn lựa bước sóng phát hiện tối ưu giúp giảm ảnh hưởng của nền mẫu và tăng độ nhạy của phương pháp Độ nhạy của phương pháp nghiên cứu đạt LOD khoảng 10 – 20 àg/mL, tương ứng với lượng chất phân tích từ 0,10 – 0,40 mg/g, tuy nhiên giá trị này cao hơn so với LOD của phương pháp TLC-SERS (24,0 μg/g) và HPLC-PDA (0,3 – 1,0 àg/mL).

Nghiên cứu cho thấy giá trị LOD xác định cho 4 dược chất AML, FEL, FUR và NIF cho phép phát hiện chúng ở mức rất nhỏ trong mẫu chứa dược liệu Cụ thể, với liều dùng thấp nhất của amlodipin là 5 mg/lần, phương pháp phát triển có khả năng phát hiện mẫu dương tính khi trộn ở mức 2% và 4% liều khi sử dụng 1 g chế phẩm dạng lỏng và dạng rắn.

4.3.2.3 Bàn luận chung về phương pháp HPTLC

Hai quy trình sắc ký đã tách thành công 9 chất thuộc 2 nhóm tác dụng dược lý khác nhau Sử dụng thiết bị HPTLC Camag với bộ phận Scanner, kết quả phân tích cho phép loại trừ kết luận dương tính giả khi có tín hiệu không phải của chất phân tích Qua thực nghiệm HPTLC, phát hiện 11/55 mẫu chứa từ 1 đến 2 chất trong nhóm 5 chất kháng histamin H1, trong khi không tìm thấy mẫu nào trong 56 mẫu có chứa 4 dược chất điều trị tăng huyết áp Các mẫu này sẽ được phân tích tiếp bằng phương pháp HPLC và LC-MS/MS để đưa ra kết luận chính xác.

Nghiên cứu này cho thấy rằng bản mỏng sử dụng có kích thước hạt silica gel thông thường, cho phép hầu hết các phòng thử nghiệm thực hiện Dựa trên nguyên lý phân tích, quy trình này có thể áp dụng cho bản mỏng với kích thước hạt mịn hơn (HPTLC plates), mang lại hiệu năng tách tốt hơn Việc sử dụng bản mỏng thông thường mở rộng khả năng ứng dụng của phương pháp, giúp các phòng thí nghiệm không có thiết bị HPTLC (có bộ phận quét phổ) vẫn có thể đánh giá sơ bộ các mẫu thông qua giá trị Rf của các vết sắc ký.

Nghiên cứu đã phát triển phương pháp HPTLC để phân tích 5 dược chất kháng histamin (cyproheptadin, clorpheniramin, loratadin, promethazin và cinnarizin) trong chế phẩm dược liệu điều trị dị ứng, mẩn ngứa và cảm cúm Đồng thời, cũng xây dựng phương pháp HPTLC để phân tích 4 dược chất điều trị tăng huyết áp và lợi tiểu (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trong chế phẩm dược liệu hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp Các phương pháp này đã được thẩm định theo các tiêu chí độ đặc hiệu và LOD theo quy định của AOAC 2016.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Xác Định Một Số Dược Chất Nhóm Kháng Histamin Và Điều Trị Tăng Huyết Áp Trộn Trái Phép Trong Chế Phẩm Chứa Dược Liệu
Tác giả	Trần Thúy Hạnh
Người hướng dẫn	PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS. Trần Thị Hồng Anh
Trường học	Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
Thể loại	Luận Án Tiến Sĩ Dược Học
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	423
Dung lượng	91,6 MB