Báo cáo thực hành công nghệ vi sinh vật sản xuất protein Đơn bào từ nấm men

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢIKHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO TỪ NẤM MEN Giảng viên hướng dẫn: TS.TRỊNH ĐÌN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO TỪ NẤM MEN

Giảng viên hướng dẫn: TS.TRỊNH ĐÌNH KHÁ

Sinh viên thực hiện: Vũ Thảo Uyên

Mã sinh viên : 2251195877 Lớp: 64CNSH1

Hà Nội, 2024

Bài 1+2 SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO TỪ NẤM MEN

I. MỤC TIÊU

Hiểu nguyên lý của quá trình lên men sản xuất chủng, giống vi sinh vật đảm bảochất lượng và có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm; làm nguồn dinhdưỡng bổ sung cho con người, vật nuôi, cây trồng…

II. CHUẨN BỊ

1. Địa điểm thực hành: Phòng thí nghiệm.

2. Thiết bị dụng cụ:

- Giống vi sinh vật: Các đĩa giống nấm men Saccharomyces cerevisiae.

- Hóa chất: sử dụng để hoạt hóa giống và nuôi cấy giống nấm men

III. TIẾN HÀNH:

1 Pha chế môi trường nhân sinh khối nấm men

-Thực hiện pha chế 1 lít môi trường dinh dưỡng lỏng nhân sinh khối nấm mentheo công thức như sau:

Lưu ý: Cân, đong chính xác từng chất rồi hòa tan vào nước cất Sau khi cân đủ hóa

chất thì dẫn nước cất đến đủ định mức và điều chỉnh pH môi trường bằng máy đopH

-Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào các bình tam giác 250 ml (50ml/bình) và 1000 ml (285 ml/bình) Dán nhãn ghi tên môi trường, ngày pha chếmôi trường, người pha môi trường lên từng bình môi trường Làm nút bông và nútgiấy cho các bình môi trường

- Khử trùng môi trường ở 121ºC trong 20 phút

-Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ đựng môitrường ở nhiệt độ phòng

2 Cấy và hoạt hóa giống nấm men

- Dùng que cấy đầu tròn lấy giống nấm men Saccharomyces cerevisiae trong ống

giống

- Cấy giống vào bình môi trường dung tích 250 ml đã chuẩn bị Lắc đều Ghi ký hiệu giống, thời điểm cấy giống và người cấy giống lên thành bình

(Nếu dùng giống đông khô thì cân 100mg cho vào bình môi trường dung tich 250 ml)

- Nuôi hoạt hóa nấm men trên máy lắc ở 28ºC, chế độ lắc 150 vòng/phút qua đêm

3 Nhân sinh khối và thu nhận sinh khối nấm men

-Cấy giống nấm men đã hoạt hóa sang bình tam giác dung tích 1000 ml chứa môi trườngnhân sinh khối nấm men đã chuẩn bị Lượng tiếp giống 5%

- Nuôi cấy nấm men trong máy lắc ổn nhiệt ở 28ºC, chế độ lắc 150 vòng/phút

và thu hồi sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm: Sau 0h, 4h, 8h, 12h, 16h,20h, 24h, 28h, 32h lên men

Lưu ý: Ở mỗi thời điểm thu nhận sinh khối nấm men, các bình lên men chứa sinh

khối nấm men được mang vào box cấy vô trùng Dùng pipet vô trùng hút 1.5 mldịch nấm men từ bình lên men sang một ống nghiệm vô trùng để kiểm tralượng sinh khối nấmmen tạo thành Tiếp theo đậy nắp bình nhân giống nấm men

a. Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành

Xác định lượng sinh khối tạo thành để vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men bằng mộttrong hai phương pháp sau:

* Phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng:

- Nguyên tắc: Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào Có thể đo độ

tán xạ ánh sáng bằng máy so màu quang phổ (spectrophotometer) Nồng độ nấmmen càng tăng thì độ đục của canh trường nuôi cấy cũng tăng theo và làm cản trởánh sáng đi qua dịch nuôi

- Các bước thực hiện:

+ Hút 1ml dịch lên men chứa sinh khối nấm men, cho vào cuvet, đặt vào vị trí củamẫu cần đo độ đục của máy so màu quang phổ (mặt trong của cuvet phải đặtvào vị tríánh sáng tán xạ chiếu qua);

+ Đồng thời hút 1 ml dịch lên men vô trùng (không chứa sinh khối nấm men) vàomột cuvet khác và đặt vào vị trí dành cho mẫu trắng của máy so màu quang phổ;+ Đo độ đục của canh trường nuôi cấy nấm men bằng máy so màu ở bước sóng 600nm

* Phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào

- Nguyên tắc: Sấy khô tế bào nấm men, sau đó xác định khối lượng khô của sinhkhối nấm men thu nhận ở các thời điểm khác nhau bằng cân trên cân phân tích

- Các bước thực hiện:

+ Sấy khô và cân xác định trọng lượng của ống li tâm trên cân phân tích;

+ Hút dịch nấm men vào ống li tâm, tiến hành li tâm thu nhận sinh

khối tế bàonấm men ở 6.000 vòng/phút trong 15 phút;

+ Loại bỏ dịch nổi, thu nhận sinh khối nấm men ở dưới đáy ống li tâm;

+ Rửa tế bào nấm men với nước cất vô trùng;

+ Ly tâm lần 2, thu hồi sinh khối ở đáy ống li tâm;

+ Sấy khô sinh khối nấm men trong tủ sấy ở 50ºC;

+ Cân xác định trọng lượng khô của sinh khối nấm men được tạo thành (trọnglượng khô của sinh khối nấm men bằng trọng lượng của ống li tâm chứa sinh khối

khô của nấm mentrừ trọng lượng của ống li tâm khi không chứa tế bào nấm men).

b. Kiểm tra chất lượng nấm men bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học

Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với Xanh methylen Loeffler Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x40 và x100

Cách thực hiện:

+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính

+ Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;

+ Đặt lá kính lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí (để mộtmép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống) Nếu giọt dịch nhiềuquá tràn ra ngoài phần tiếp xúc của lá kính và phiến kính thì dùng giấy thấm bớtnước đi;

+ Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi

-Chỉ tiêu quan sát, thống kê: Thống kê các chỉ số: tỷ lệ tế bào nấm men sống; tỷ lệ

tế bàonấm men nảy chồi; tỷ lệ tế bào nấm men chết Các tỷ lệ này được xác địnhtheo công thức:

Lưu ý: Tế bào nấm men chết là tế bào bắt màu xanh của thuốc nhuộm; tế bào sống

không cho thuốc nhuộm thấm qua thành và màng tế bào nên không bắt màu xanhcủa thuốc nhuộm; tế bào nảy chồi là các tế bào đang phát triển và có nhiều chồimọc chồng chất lên nhau (Hình 1)

Hình 1 Hình thái tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi quang học

5 Yêu cầu đánh giá:

(i) Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm khác nhau sau lên menvà thống kê kết quả vào bảng

(ii)Vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men trong một hệ thống kín dựa trên lượng sinh khối nấm men tạo thành đã xác định ở các thời gian thu hồi sinh khối khác nhau

(iii) Đánh giá chất lượng nấm men bằng phương pháp làm tiêu bản và quan

sát dưới kính hiển vi khi giống đang ở pha phát triển, thống kê kết quả vào

bảng:

IV. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN:

+ VSV đang trong giai đoạn bào tử và chưa sinh sản

+ Trong khoảng thời gian 4h, nấm men có hiện tượng phát triển và sinh trưởng chưa mạnh

- Từ 4h đến 16h (pha lũy thừa – log phase) nấm men sinh trưởng mạnh, số lượng tế bào nhân lên nhanh chóng

- Từ 20h đến 24h (pha cân bằng – Stationary Phase) số lượng tế bào duy trì

ổn định:

+ Sự hạn chế của chất dinh dưỡng

+ Sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại cho VSV

+ Sự giới hạn của điều kiện nuôi cấy

- Từ 24h đến 32h (pha suy vong – Death Phase) số lượng tế bào giảm mạnh:

+ Do sự cạn kiệt của các chất dinh dưỡng

+ Tích lũy các chất thải độc hại làm cho số lượng TB sống giảm

+ Hiện tượng tự phân do các enzim nội bào và các chất ngoại bào

* Phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào:

Thời gian sinh

khối nấm men

tạo thành

(giờ)

Khối lượng sinh khối Cam (g)

Khối lượng sinh khối Xoài (g)

Nhận xét:

- Lượng sinh khối tế bào nhân lên mạnh và đạt đỉnh điểm vào lúc 24h và không cógiấu hiệu suy giảm vì các tế bào chết cũng tạo ra một trọng lượng nhất định, song các tế bào chết nhẹ hơn tế bào sống nên vào mốc thời gian 28h đã có sự suy giảm

về khối lượng sinh khối

* Kiểm tra chất lượng nấm men bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học:

Số TB sống

Tỷ lệ TBsống (%)

Số TB nảy chồ i

Tỷ lệ TBnảy chồi (%)

Số TB chết

Tỷ lệ TB chết (%)

Tỷ lệ TBsống (%)

Số TB nảy chồ i

Tỷ lệ

TB nảy chồi (%)

Số TB chết

Tỷ lệ TB chết (%)

V. KẾT LUẬN:

- Đánh giá chất lượng nấm men:

+ Tiêu bản tế bào nấm men sau khi được xử lí và tiến hành nhuộm Xanh Metylen

Loeffler phân tích dưới kính hiển vi Kết quả cho thấy tỉ lệ sống của tế bào chủng Cam thấp hơn tỉ lệ sống của tế bào chủng Xoài Tuy nhiên tỉ lệ nảy chồi và kích thước tế bào của chủng Cam lớn hơn so với chủng Xoài Chủng Cam sẽ thu được lượng sinh khối nhiều hơn so với chủng Xoài

+Từ kết quả phân tích sinh trưởng và kết quả kiểm tra chất lượng nấm men của 2

chủng nấm men, ta thấy:

 Chủng Cam có đặc điểm ưu việt hơn chủng Xoài Từ đó tiến hành nuôi

cấy 500ml dung dịch của chủng Cam

 Tiến hành tiếp giống 5% nuôi ở 28oC lắc 150 vòng/phút, thu dịch ở thời

điểm 24h sau khi ly tâm và sấy khô thu được 1.5789g thành phẩm của Cam

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1)Nguyễn Lân Dũng (2016), Giáo trình vi sinh vật, NXB Giáo dục

2)Nguyễn Phúc Trường, Nguyễn Văn Thành, Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rượu vang cam sành, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tập 58, Số 1B (2022):121-13

3) TS.Trịnh Đình Khá ,Bài giảng thực hành Công nghệ Vi Sinh, Bộ môn

Công nghệ sinh học, Khoa Hóa và Môi trường, Trường Đại học Thủy Lợi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ VI SINH

Giảng viên hướng dẫn: TS Trịnh Đình Khá Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm 3

Hà Nội, 2023

Đo od 8h Sơn, Ly, Thảo 600,T.Linh, Hoàng Anh

Nuôi gối Nam, Nhi, Khánh Huyền,Thành

(bình nuôi gối) Mây, My, Đức, Vũ Hương

Pha hóa chất Nhi, Duy, Khánh Huyền, Nam,Trần Anh.

Phân công công việc bài 3+4

Pha hóa chất Nam, Duy, Sơn, My,K.Huyền,Trần Anh, Mây

20h,24h:

Duy,My, Tống Linh,Ly,Mây ,Thành

28h,32h:

Ngân,Hà Trần Anh, Oanh, Đức, Thảo 600

Phân công công việc bài 5

II. CHUẨN BỊ

1. Địa điểm thực hành: Phòng thí nghiệm.

2. Thiết bị dụng cụ:

- Giống vi sinh vật: Chủng vi khuẩn sinh enzyme Bacillus subtilis.

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật như: peptone, cao nấm men,NaCl, tinh bột

- Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác (250ml, 500ml), pipet, que cấy vi sinh vật đầutròn, cuvet, lam kính, lamen…

- Thiết bị: box cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ định ôn nuôi cấy vi

sinh vật, máy somàu quang phổ, kính hiển vi quang học, máy li tâm, cânphân tích…

III. TIẾN HÀNH

1 Pha chế môi trường nhân giống vi khuẩn

- Thực hiện pha chế 0,5 lít môi trường dinh dưỡng lỏng nhân giống vi

khuẩn theo công thức như sau:

pha môi trường lên từng bình môi trường Làm nút bông và nút giấy cho các bình môi trường.

- Khử trùng môi trường ở 121ºC trong 20 phút

-Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ đựngmôi trường ởnhiệt độ phòng

2 Cấy và hoạt hóa giống vi khuẩn

- Dùng que cấy đầu tròn lấy giống vi khuẩn Bacillus subtilis trong ống giống.

- Cấy giống vào bình môi trường dung tích 250 ml đã chuẩn bị Lắc đều Ghi ký hiệugiống, thời điểm cấy giống và người cấy giống lên thành bình

- Nuôi hoạt hóa vi khuẩn trên máy lắc ở 37ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút qua đêm

3. Lên men thu nhận enzyme:

Pha 1 lít môi trường lên men với

Lưu ý: Ở mỗi thời điểm thu mẫu, các bình lên men được mang vào box cấy

vô trùng Dùng pipet vô trùng hút 1.5 – 2 ml dịch lên men từ bình lên mensang một ống nghiệmvô trùng để kiểm tra hoạt tính enzyme Tiếp theo đậynắp bình nhân giống nấm men và tiếp tục nuôi cấy trong tủ định ôn cho thumẫu ở các thời điểm tiếp theo

3 Yêu cầu:

- Sinh viên biết cách pha và chuẩn bị môi trường lên men

- Sinh viên biết cách nhân giống, tiếp giống và thu mẫu phân tích trong lên men

- Báo cáo kết quả thí nghiệm theo các nội dung như sau:

(i) Xác định hoạt tính enzyme amylase ở các thời điểm khác nhau sau lênmen và thốngkê kết quả vào bảng:

thời gian lên men (h) Hoạt tính amylase (D-d, mm)0h

 4h-16h: VSV đang ở Pha Log phát triển mạnh mẽ theo lũy thừa số

lượng tế bào tăng nhanh do gặp được môi trường nuôi cấy thuận lợi và đầy đủ dưỡng chất để phát triển

 16h-24h: Khi này số lượng VSV đã đạt tới cực đại ở Pha Cân Bằng, số lượng tế bào trong khoảng thời gian này ổn định không có sự thay đổi lớn Do sự hạn chế của các chất dinh dưỡng trong môi trường và giới hạn của điểu kiện nuôi cấy

 24-32h: Khi này VSV đã chuyển sang Pha Suy Vong Nồng độ VSV giảm nhanh chóng theo lũy thừa, VSV sinh bào tử sẽ được hình thành trong giai đoạn này Nguyên nhân là do sự cạn kiệt dinh dưỡng của môi trường, sau nhiều thế hệ thì VSV đã bị thoái hóa giống dần, Tích lũy các chất thải độc hại làm cho số lượng tế bào sống giảm đi

BÀI 5 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO PHƯƠNG

PHÁP HEINKEL I/ MỤC TIÊU:

Sinh viên nắm được nguyên lý chung xác định hoạt độ enzyme và cách tiến hành xác định hoạt độ enzyme α-amylase theo phương pháp Heinkel

Dung dich A (NaH2PO4 0,1M): 12g NaH2PO4 + 1000 ml H2O

Dung dịch B (Na2HPO4 0,1 M): 14,2g Na2HPO4 + 1000 ml H2O

Đệm phosphat pH 6,8: 51 ml dung dịch A + 49 ml dung dịch B giữ nguyên

- Dung dịch tinh bột 1% pha trong đệm photphat

- Dung dịch tinh bột chuẩn 1%: 0,5g + 50 ml đệm photphat, đun sôi đến khidung dịch trong Định mức lên 50 ml

- 9 ml dung dịch I2 pha loãng 150 lần.

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 560 nm trên máy quang phổ

0,25 ta: Số mg tinh bột ở ống kiểm tra.

b: Số mg tinh bột ở ống thí nghiệm

c: Độ pha loãng dung dịch enzyme

t: Thời gian phản ứng

8 6

5.2 Thí nghiệm 2:

- Dựa vào công thức đường chuẩn: y = 0.0261x + 0.0062

Ta tính được lượng cơ chất tinh bột chuyển hóa:

+ Nồng độ 1% khả năng hoạt hóa cao nhất ở lúc 16h là 1,578 u/ml.

+ Nồng độ 0,5% khả năng hoạt hóa cao nhất ở lúc 28h là 0,521 u/ml

 Ở môi trường nuôi cấy có nồng độ tinh bột càng cao thì khả năng hoạt hóa của enzyme Amylase càng hiệu quả

V.TÀI LIỆU THAM KHẢO:

TS.Trịnh Đình Khá ,Bài giảng thực hành Công nghệ Vi Sinh, Bộ môn Côngnghệ sinh học, Khoa Hóa và Môi trường, Trường Đại học Thủy Lợi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH

HỌC

-BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ VI SINH

Giảng viên hướng dẫn: TS.Trịnh Đình Khá

Hà Nội, 2023.

Bảng phân công công việc Công việc Sinh viên thực hiện

Pha hóa chất My,Mây, Hà, Tống Linh

Làm môi trường, khử

trùng

Ngân, Thảo 600, V.Hương, Mây, Oanh, Hoàng Anh

Thu bào tử Trần Anh, Duy, Tiến, Vân Anh, Khánh Huyền

Cấy nấm vào môi

Bài 5+6: SẢN XUẤT BÀO TỬ NẤM TRICHODERMA TẠO

CHẾ PHẨM ỨC CHẾ NẤM BỆNH.

I MỤC TIÊU:

Trang bị cho sinh viên nguyên lý của quá trình lên men sản xuất chế phẩm bào

tử nấm Trichoderma đảm bảo chất lượng và có thể ứng dụng trong nôngnghiệp kiểm soát nấm hại cây trồng

II CHUẨN BỊ

1 Địa điểm thực hành: Phòng thí nghiệm.

2 Thiết bị dụng cụ:

- Giống vi sinh vật: Chủng vi nấm Trichoderma

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật như: dịch

chiết khoai tây, glucose, agar, thóc

- Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác (250ml, 500ml), pipet, que cấy vi

sinh vật đầu tròn, cuvet, lam kính, lamen, buồng đếm bào tử, túi nilon 1

kg…

-Thiết bị: box cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ định ôn nuôi cấy vi sinh vật, máy so màu quang phổ, kính hiển vi quang học, máy li tâm, cân phân tích…

III TIẾN HÀNH

1 Pha chế môi trường nhân giống nấm Trichoderma

- Thực hiện pha chế 1lít môi trường PDA nhân giống Trichoderma theo

công thức như sau:

Thành phần:

 Dịch chiết của 200 g khoai tây (Khoai tây gọt vỏ, thái mỏng, bổ

sung 700ml nước cất, đung sôi cách thủy trong 30 phút

- Khử trùng môi trường ở 121ºC trong 20 phút

- Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ

đựng môi trường ở nhiệt độ phòng

2 Cấy và hoạt hóa giống Trichoderma - Pha dịch huyền phù bào tử nấm

Trichoderma

- Đổ đĩa môi trường PDA

- Nuôi hoạt hóa nấm Trichoderma trên môi trường thạch 3-5 ngày để nấm sinhbào tử màu xanh

3 Lên men thu nhận bào tử nấm:

Bước 1: Hòa 20g đường glucose với 0,5 lít nước sạch Tưới đều vào hỗn hợp

1kg cám gạo + 500gr vỏ trấu + 500gr thóc (hoặc gạo) Sau đó đảo thật đều

Bước 2: Phân phối vào các túi nilon loại 1kg với môi trường chiếm ¼ thể tích,

buộc miệng túi bằng dây chun Khử trùng môi trường ở 121ºC trong 20 phút

Bước 3: Cấy bào tử nấm trichoderma

– Sau khi thanh trùng xong, để nguội, trộn 1 đĩa bào tử nấm trichoderma

và đảo đều

– Để nia ở nơi khô thoáng, tránh ánh sáng trực tiếp thực hiện lên men

nhân sinh khối

–Thời gian sinh khối nấm trichoderma là 5 – 7 ngày

Nhận biết cấy bào tử nấm thành công: Sau khi cấy khoảng 48h, nấm

trichoderma bắt đầu mọc có tơ nấm màu trắng, sau 4 – 6 ngày sợi nấm chuyển sang màu xanh Khi thời gian sinh khối được 7 ngày là tiến hành thu hoạchnấm trichoderma

Bước 4: Thu hoạch nấm trichoderma tạo chế phẩm

– Lấy toàn bộ nấm trichoderma trong túi cho vào chậu nhựa sạch Tiếp tục cho 5 lít nước sạch vào và khuấy đảo đều, thật kỹ để nấm trichoderma tan vào nước

– Tiến hành đổ hỗn hợp trên vào khay lọc để loại bỏ xác vỏ trấu, cám gạo vàthu hoạch dung dịch nấm trichoderma

- Tiến hành đếm số lượng bào tử của chế phẩm bằng buồng đếm và kính hiển