Bài báo cáo thực hành hóa thực phẩm

Các cation và anion của dung dịch muối có tác dụng loại bỏ lớp vỏ nước bao quanh phân tử protein, tác dụng tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu làm trung hòa điện tích làm cho protei

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG

BÀI BÁO CÁO

THỰC HÀNH HÓA THỰC PHẨM

SVTH: ……….

NHÓM: 5

Lớp: D22CNTP01

THÁNG 2/2024

Bài 3 Định tính và định lượng protein (15 tiết) 3.1 Tính tan của protein

3.1.1 Kết tủa thuận nghịch bằng

Nguyên tắc

Dưới tác dụng của muối trung tính kim loại kiềm, kiềm thổ ở nhiệt độ thấp (0 -4°C), ethanol, aceton protein có thể bị kết tủa Loại bỏ nhanh các nhân tố gây kết tủa, protein lại trở về trang thái dung dịch keo bền Đây là hiện tượng kết tủa thuận nghịch Các cation và anion của dung dịch muối có tác dụng loại bỏ lớp vỏ nước bao quanh phân tử protein, tác dụng tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu làm trung hòa điện tích làm cho protein kết tủa

Tùy thuộc vào nồng độ anion và cation sẽ gây kết tủa các loại protein tương ứng

Nguyên liệu

Lòng trắng trứng (pha loãng 1:4 với nước cất),

Ethanol 99%,

Cách thực hiện

Cho vào mỗi ống 1mL lòng trắng trứng Thêm vào ống nghiệm 5 mL Ethanol, lắc nhẹ, xuất hiện kết tủa

Phần tủa được hòa tan trong 10 mL nước cất

Kết quả và giải thích

Hình 1a Kết quả dung dịch Hình 1b Kết quả dung dịch cho

xuất hiện kết tủa thêm 10ml nước cất, kết tủa tan

Giải thích:

Hình 1: Sau khi cho 1ml lòng trắng trứng và 5ml ethanol vào, lắc nhẹ, xuất hiện kết tủa và hút nước bên trên ra

Hình 2: Sau khi hút nước bên trên ra, cho vào thêm 10ml nước cất, lắc mạnh Sau

đó kết tủa tan

3.1.2 Kết tủa không thuận nghịch bằng acid hữu cơ

Nguyên tắc

Protein bị kết tủa không thuận nghịch sẽ không thể trở lại trạng thái ban đầu khi loại bỏ các tác nhân gây kết tủa

Acid hữu cơ tạo nên kết tủa không thuận nghịch của protein Acid trichloroacetic (TCA) và acid sulphosalisylic là những acid đặc biệt nhạy cảm với kết tủa protein

Nguyên liệu

Lòng trắng trứng (pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:4) Acid trichloroacetic 10%; acid sulphosalisylic 10%

Cách thực hiện

Đánh số thứ tự hai ống nghiệm Cho vào mỗi ống 1 mL lòng trắng trứng Thêm vào ống 1: 1 mL acid trichloroacetic 10% Ống 2: 1 mL acid sulphosalisylic 10% Lắc nhẹ, trong hai ống xuất hiện kết tủa protein So sánh lượng tủa và giải thích kết quả

Kết quả và giải thích

Hình 2a Kết quả dung dịch Hình 2b Kết quả dung dịch sau khi cho

xuất hiện kết tủa thêm 10ml nước cất

Giải thích:

Hình 2a

Ống 1: Sau khi cho vào 1ml lòng trắng trứng và 1ml acid trichloroacetic 10%, lắc nhẹ Xuất hiện kết tủa protein

Ống 2: Sau khi cho vào 1ml lòng trắng trứng và 1ml acid sulphosalisylic 10%, lắc nhẹ Xuất hiện kết tủa protein

Hình 2b

Cả 2 ống đều xuất hiện kết tủa protein, sau đó cho vào thêm 10ml nước, lắc nhẹ Sau đó kết tủa không tan

3.2 Các phản ứng màu của amino acid và protein

3.2.1 Phản ứng Ninhydrin

Nguyên tắc

Khi phản ứng với Ninhydrin ở nhiệt độ cao, các amino acid bị deamine hóa, oxy hóa và decarboxyl hóa tạo thành NH3, CO2 và aldehyd tương ứng có mạch carbon ngắn hơn amino acid 1 carbon Ninhydrin bị khử tạo thành diceto oxy ninhydriden, chất này sau đó kết hợp với NH3 và một ninhydrin khác tạo thành một hợp chất có màu xanh tím với độ hấp thu cực đại vào khoảng 570 nm Phản ứng giữa ninhydrin với proline sẽ cho hợp chất có màu vàng

Tất cả các α-amino acid của protein đều phản ứng với ninhydrin Ngoài ra, các protein, peptid, muối amon, NH3 cũng tạo thành màu với ninhydrin Muốn xác định chính xác các amino acid phải loại bỏ các chất này Để xác định amino acid liên kết trong thành phần peptid hoặc protein, phải thủy phân chúng để tạo thành các amino acid tự do sau đó mới thực hiện phản ứng ninhydrin Phản ứng này có độ nhạy cao, nên được dùng để định tính và định lượng amino acid Đây cùng là cơ sở của phương pháp sắc kí amino acid

Nguyên liệu

Glycine 0,1 %;

Albumine 0,5 %;

Ninhydrin 0,1 %

Cách thực hiện

Đánh số thứ tự 3 ống nghiệm:

Cho vào ống 1: 1mL glycine 0,1%, ống 2: 1 mL albumine 0,5 % Ống 3: 1 mL lòng trắng trứng Thêm vào mỗi ống 5 mL ninhydrin 0,1% Đun nóng cả ba ống nghiệm cho đến khi dung dịch chuyển thành màu xanh

Chụp hình và giải thích kết quả

Kết quả và giải thích

Hình 3 Kết quả 3 ống màu xanh Giải thích:

Ống 1: 1ml glycine 0,1% và 5ml ninhydrin 0,1%

Ống 2: 1ml albumin 0,5% và 5ml ninhydrin 0,1%

Ống 3: 1ml lòng trắng trứng và 5ml ninhydrin 0,1%

Sau khi đun cả 3 ống nghiệm thì dung dịch chuyển thành màu xanh , nguyên nhân là do khi phản ứng với Ninhydrin ở nhiệt độ cao, các amino acid bị deamine hóa, oxy hóa và decarboxyl hóa tạo thành NH3, CO2 và aldehyd tương ứng có mạch carbon ngắn hơn amino acid 1 carbon Ninhydrin bị khử tạo thành diceto oxy ninhydriden, chất này sau đó kết hợp với NH3 và một ninhydrin khác tạo thành một hợp chất có màu xanh tím

3.2.2 Phản ứng Lowry

Nguyên tắc

Đặc trưng cho sự tạo thành phức chất màu của các gốc amino acid vòng với thuốc thử Folin-Ciocalteu Ngoài ra, trong thuốc thử Folin còn có acid

phosphomolydic và acid phosphovonphramic làm tăng độ nhạy của phức chất đồng – protein (biure)

Nguyên liệu

Glycine 0,1 %;

Albumine 0,5 %;

Lòng trắng trứng

Dung dịch Na2CO3 0,5 M

Thuốc thử Folin: pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:4

Cách thực hiện

Đánh số 3 ống nghiệm Cho vào ống 1: 1 mL Albumine 0,5 % Ống 2: 1 mL Glycine 0,1% Ống 3: 1 mL lòng trắng trứng Thêm vào mỗi ống 5 mL dung dịch

Na2CO3 0,5 M, để yên trong 10 phút Thêm 1 mL thuốc thử Folin, để yên trong 5 phút Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống và giải thích kết quả

Kết quả và giải thích

Hình 4 Kết quả 3 ống có sự xuất hiện màu khác nhau Giải thích:

Ống 1: 1ml albumine 0,5% và 5ml dung dịch Na2CO3 0,5 M, để yên trong 10 phút Ống 2: 1ml glycine 0,1% và 5ml dung dịch Na2CO3 0,5 M, để yên trong 10 phút

Ống 3: 1ml lòng trắng trứng và 5ml dung dịch Na2CO3 0,5 M, để yên trong 10 phút Sau đó cả 3 ống nghiệm thêm vào mỗi ống 1ml thuốc thử Folin để yên trong 5 phút Ống 1 và ống 3 xuất hiện màu xanh, ống 2 không xuất hiện màu Nguyên nhân ống 2

không có màu là do tính kiềm của Na2CO3 và sự thay đổi màu xảy ra khi nồng độ pH thay đổi

3.3 Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry

Nguyên tắc

Hầu hết các protein đều chứa Tyrosine và Tryptophan Hàm lượng của amino acid này tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, những protein cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid này như nhau Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu Cường độ màu này tỷ lệ với hàm lượng Tyrosine và Tryptophan (cũng là hàm lượng protein) Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu

để xác định hàm lượng protein

Nguyên liệu

Dung dịch Albumin 0,1%;

Dung dịch NaOH N/10;

Dung dịch A: hòa tan 2,0 g Na2CO3 trong NaOH N/10 thành 100 ml;

Dung dịch Trisodium citrate 1%: hòa tan 1,0 g Trisodium citrate trong nước cất thành 100 ml;

Dung dịch B: hòa tan 0,5 g CuSO4.5H2O trong dung dịch Trisodium citrate 1% thành 100 mL dung dịch có màu xanh da trời nhạt);

Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 49:1 (pha trước khi

sử dụng 30 phút);

Thuốc thử Folin: pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:4

Cách thực hiện

Dựng đường chuẩn

Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường sử dụng

là albumin theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn có nồng độ protein

từ 0 đến 250 g/mL:

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Dung dịch Albumin 0,5%

Từ các ống nghiệm trên, hút 0,4 mL dung dịch protein vào 2 ống nghiệm sạch khác Thêm vào đó 2 ml dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm vào 0,2 mL thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm 5 mL nước cất rồi đo mật độ quang ở bước sóng 750 nm

Dùng các dung dịch protein này để dựng đường chuẩn với trục X là nồng độ protein và trục Y là OD (OD= ODi - OD0)

Xác định hàm lượng protein trong mẫu CẶN 1

Pha loẵng mẫu CẶN 1 trong nước cất đến độ pha loãng thích hợp.

Hút 0,4 mL dung dịch có chứa protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch và đã sấy khô Thêm vào đó 2 mL dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó thêm vào 0,2 mL thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút Thêm nước cất cho đủ 5 mL Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750 nm Dựa vào đường chuẩn này ta xác định được nồng độ protein có trong dung dịch mẫu là a (g/mL).

Cách tính kết quả

Hàm lượng protein (X) có trong 1 g nguyên liệu hay 1 mL mẫu được tính theo công thức:

X = a L 10-3 (mg/mL CP) m

a: là hàm lượng protein (g/ml dung dịch)

L: hệ số pha loãng

m: Khối lượng nguyên liệu đã lấy phân tích (g)

Kết quả:

Bảng 1 : Dựng đường chuẩn albumin

Ống

0.017 0.074

Nồng độ

protein

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250

f(x) = 0.000145028571428571 x + 0.0121904761904762 R² = 0.974017506207214

Nồng độ protein ( µg/g)

Hình 1: Đồ thị đường chuẩn albumin

Tên mẫu

Độ pha loãng

Thử không Thử thật DOD x

Nồng

độ protein ( µg/g) của cặn 1

Nồng độ protein ( µg/g) trong mẫu

2 0.078 0.474 0.469 0.362 296.2295082

2962.3

0 17181.31148

6 0.004 0.438 0.382 0.400 327.7868852

3277.8

Bảng 2: Kết quả phân tích hàm lượng protein hòa tan trong mẫu

Nhận xét:

- Theo tác giả USDA , người ta công bố trong 100g hạt điều có chứa 18,2g hàm

lượng protein Phân tích của chúng tôi thấp hơn

- Theo CÔNG TY CP CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LƯƠNG GIA sản xuất trong

100g mức xoài có chứa 0,07g protein Phân tích của chúng tôi thấp hơn

3.4 Xác định hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Kjeldalh

Nguyên tắc

Phân hủy các hợp chất nitơ có trong mẫu thử bằng axit sulfuric đặc nóng, có mặt chất xúc tác, để thu được amoni sulfat Sản phẩm phân hủy được kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxit và giải phóng amoniac bằng cách chưng cất vào lượng dư dung dịch H2SO4 Chuẩn độ amoniac bằng dung dịch chuẩn axit (TCVN 10791:2015)

Cách thực hiện

Xay nhuyễn và trộn đều MẪU PHÂN TÍCH

Phân hủy mẫu: Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần MẪU PHÂN TÍCH đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg, chuyển định lượng vào bình Kjeldahl khô Thêm khoảng 2 g hỗn hợp xúc tác dạngbột hoặc dạng viên, trộn đều Thêm 10 mL acid sulfuric 98%, xoay nhẹ bình

để trộn và làm ẩm lượng chứa trong bình Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp cho đến khi dung dịch có màu xanh trong suốt Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl Để nguội dịch phân hủy Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng acid dư đã bị thất thoát trong quá trìnhphân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi

Chưng cất: Cẩn thận pha loãng dịch phân hủy với nước cất cho đủ 100 mL nước cất Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch axit H2SO4 0,01 N Bật sẵn thiết bị gia nhiệt trước khi nối bình, để giảm thiểu nguy hiểm do chất lỏng chảy ngược trở lại qua sinh hàn Ngay sau khi trộn, cần tháo bình chứa acid H2SO4 để làm khô đầu ra của bình sinh hàn và để cân bằng áp suất trong bình chưng cất Chưng cất amoniac vào bình hứng chứa lượng dư axit H2SO4 nồng độ 0,01 N, có chứa 2-3 giọt chất chỉ thị methyl red

Cách chưng cất ammoniac bằng thiết bị Parnas-wargner

Đốt bình cầu a cho đến khi sôi, rửa máy cất đạm, chúng ta tiến hành cất đạm bằng cách sau:

Đặt bình tam giác f có chứa 10 mL dung dịch H2SO4 0,01N và vài giọt methyl red,

rồi đặt vào vòi ống sinh hàn d, sao cho đầu nhọn ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch Hút 10 mL dung dịch đạm vô cơ hóa đã pha loãng trên cho vào phễu e của máy cất đạm, mở khóa cho vào bình c từ từ cho đến khi hết, tráng phễu e 3 lần, mỗi lần với một ít nước cất rồi cho xuống bình c Cho 10 mL dung dịch NaOH đậm đặc và cũng cho xuống bình c từ từ, tráng một ít nước cất (mỗi lần cần chừa lại một ít để hệ thống

kín) Để máy lôi cuốn trong vòng 3 phút rồi hạ bình tam giác xuống, để thêm 2 phút nữa Rửa vòi bằng một tia nước cất (nước rửa cho vào bình tam giác) Rồi lấy bình tam giác ra, định phân với dung dịch NaOH có chuẩn độ đúng là x.0,01 N cho đến khi

có màu vàng cam

Chuẩn độ: bình hứng được chuẩn độ lượng dư H2SO4 bằng dung dịch NaOH 0,01

N Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển màu hồng đỏ sang màu vàng cam

Mẫu trắng: Thực hiện mẫu trắng thuốc thử, dùng 1,0 g sacarose thay cho phần mẫu thử

Tính kết quả

Tính lượng nitơ tổng số có trong 1 lít nguyên liệu

Gọi Vo là thể tích dung dịch NaOH x.0,01N (trị số trung bình của 3 lần thử không)

Gọi V1 là thể tích dung dịch NaOH x.0,01N (trị số trung bình của 3 lần thử thật) Vậy V = Vo – V1 là lượng NaOH tương đương với lượng đạm ammoniac phóng thích bởi 10 mL dung dịch vô cơ pha loãng

1 mol ammoniac tương đương với 1 mol NaOH

Do đó số mol ammoniac phóng thích bởi 10 mL dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:

Số g đạm tổng số có trong 10 mL dịch vô cơ đã pha loãng là:

14 V x 10-5 g

→ 14 2,37.10-6 5,275 10-5 = 1,75.10-9g

Số gam đạm tổng số có trong 100 mL dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1 mL nguyên liệu:

14 V x 10 − 5 100

10 =14 V x 10 − 4

g

Số gam đạm tổng có trong một lít nguyên liệu:

14 V x 10 − 4 1000

1 =1, 4 V x

1000 =V x 10 −5

mol

V1 = 0,45

V = Vo – V1 = 8,6 - 0,45 = 8,15

→ 8 ,15 x (0 , 01)

1000 =8 , 15 x 10 −5

→ x = 2,37.10-6

→ 1,4 5,275 10 ,610 = 4,30407 5 = 21,7035 (g/l)

Thực hiện 3 mẫu thử thật, 2 mẫu thử không để lấy trị số trung bình Phải xác định hệ số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH 0,01N bằng dung dịch (COOH)2 0,01N Hàm lượng protein tổng số

P = N x 6,25 = 15,434 x 6,25 = 96,463 gprotein/kg = 9,6463%

Trong đó:

6,25: là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng protein Giải thích kết quả: Theo tác giả USDA , người ta công bố trong 100g hạt điều có 18,2g protein, hàm lượng protein của chúng tôi thấp hơn