Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bản

Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi tế bào cho trong nuôi in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản .... Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệuĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bảnĐánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn ỉ nhân bản

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI ĐẾN

HIỆU QUẢ TẠO PHÔI LỢN Ỉ NHÂN BẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viiii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát chung về lợn Ỉ Việt Nam 3

1.2 Cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) 4

1.3 Các dạng tế bào soma sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma 6

1.4 Đồng pha chu trình nguyên bào sợi (tế bào cho) về giai đoạn G0/G1 bằng huyết thanh 7

1.5 Thời gian nuôi đồng pha 9

1.6 Cơ sở khoa học để xác định được giai đoạn phát triển của nhân tế bào 10

1.7 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi (tế bào cho) trong nuôi in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản 10

1.8 Vai trò của dòng tế bào cho đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản 11

1.9 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Phương pháp thu mẫu mô tai lợn 14

2.2.2 Phương pháp phân lập nguyên bào sợi từ mẫu mô tai lợn 16

2.2.3 Phương pháp cấy chuyển nguyên bào sợi 16

2.2.4 Đồng pha chu trình nguyên bào sợi 17

2.2.5 Kiểm tra, đánh giá nhân nguyên bào sợi bằng hệ thống FACS 17

2.2.6 Đông lạnh nguyên bào sợi 18

2.2.7 Giải đông nguyên bào sợi 18

2.2.8 Thu, lựa chọn và nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn 18

2.2.9 Phương pháp loại nhân tế bào trứng lợn in vitro không có màng sáng (ZP) 19

2.2.10 Phương pháp cấy chuyển nhân tế bào soma (tế bào cho) vào tế bào trứng nhận không có màng sáng 20

2.2.11 Phương pháp hoạt hóa tế bào trứng không có màng sáng sau SCNT 21

2.2.12 Phương pháp nuôi phôi lợn 21

2.2.13 Nhuộm phôi bằng Hoechst 33342 21

2.2.14 Xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 23

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ 23

3.1.2 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào chất của tế bào trứng nhận 26

3.1.3 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 28

3.2 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 32

3.3 Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 36

3.3.1 Ảnh hưởng của giới tính nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 36

3.3.2 Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi

lợn Ỉ nhân bản 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

KẾT LUẬN 46

ĐỀ NGHỊ 46

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SCNT Somatic cell nuclear transfer Cấy chuyển nhân tế bào soma PHA Phytohemagglutinin Phytohemagglutinin

NCSU-37 North Carolina State

University-37

Môi trường nuôi cấy của Đại học Bang Bắc Carolina

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

PZM3 Porcine zygote medium 3 Môi trường nuôi hợp tử lợn 6-DMAP 6-(Dimethylamino)purine 6-(Dimethylamino)purine DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered

Saline

Nước muối đệm photphat Dullbecco

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle

FCS Fetal Calf Serum Huyết thanh thai bê

TALP Tyrode albumin lactate

Acid Solution

Dung dịch amino acid không thiết yếu MEM

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ 233 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của việc đồng pha đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào chất của tế bào trứng nhận 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 28

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 33

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của giới tính nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 36 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào trứng nhận 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Lợn Ỉ 3

Hình 2.1 Lợn Ỉ đực thuần trước khi thu mẫu mô tai 14

Hình 2.2 Lợn Ỉ cái thuần trước khi thu mẫu mô tai 15

Hình 2.3 Thu mẫu mô tai lợn Ỉ 15

Hình 2.4 Loại nhân tế bào trứng lợn không có màng sáng trong môi trường TALP-Hepes có bổ sung 0,5μg/ml Cytochalasin B bằng micro pipette 20

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 24 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS 24

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 48 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS 25

Hình 3.3 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 72 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS 25

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 96 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS 26

Hình 3.5 Phôi lợn Ỉ nhân bản không có màng sáng phân chia ở ngày thứ 2 sau hoạt hóa 29

Hình 3.6 Phôi nang lợn Ỉ nhân bản không có màng sáng được tạo ra từ nguyên bào sợi lợn Ỉ đã được đồng pha về giai đoạn G0/G1 của chu trình tế bào 30

Hình 3.7 Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi chưa đồng pha được nhuộm với Hoechst 33342 30

Hình 3.8 Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi đã đồng pha được nhuộm với Hoechst 33342 31

Hình 3.9 Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi lợn Ỉ ở lần cấy chuyển thứ 4 được nhuộm với Hoechst 33342 34

Hình 3.10 Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi lợn Ỉ ở lần cấy chuyển thứ 5 được nhuộm với Hoechst 33342 34

Hình 3.11 Nguyên bào sợi dạng sợi dài (nguyên bào sợi của lợn Ỉ cái 9155, 9157) 40

Hình 3.12 Nguyên bào sợi dạng hình sao (nguyên bào sợi của lợn Ỉ cái 6004,

9154, 9156) 41 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản 43 Hình 3.14 Phôi nang lợn Ỉ nhân bản được nuôi trong hệ thống WOW 41

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việc ứng dụng thành công kỹ thuật cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) để tạo ra động vật nhân bản đã mở ra nhiều hướng ứng dụng tiềm năng trong nghiên cứu cơ bản, y học và nông nghiệp SCNT là một phương pháp đang được nghiên cứu và ứng dụng trong việc lai tạo các động vật có chất lượng tốt, bảo tồn các loài động vật đang bị suy giảm về mặt số lượng Nhân bản động vật bằng SCNT ở động vật có vú là một kỹ thuật để tạo ra một động vật từ một nhân tế bào soma kết hợp với một tế bào trứng đã loại nhân [1] và đã được thực hiện thành công ở một số loài động vật [2] Tuy nhiên, tỷ

lệ thành công vẫn thấp và có một số yếu tố vẫn chưa được hiểu rõ, đặc biệt là

ở lợn khi được so sánh với một số loài khác Việc áp dụng SCNT để nhân bản lợn thành công đã giúp cho các nhà khoa học có nhiều định hướng nghiên cứu mới, đặc biệt là những nghiên cứu có liên quan tới y sinh Nhiều nghiên cứu ứng dụng SCNT đã được thực hiện ở trên lợn [3]; nhưng tỷ lệ tạo phôi lợn SCNT thấp, tỷ lệ sảy thai cao, con non sinh ra có sức sống kém Chất lượng phôi lợn nhân bản SCNT có một vai trò quan trọng trong việc tạo được lợn nhân bản Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra một số yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo phôi nhân bản SCNT như: cấy chuyển nhân tế bào soma [4], dòng tế bào cho [5], sự bất thường trong đặc điểm di truyền ở nhiễm sắc thể của tế bào cho [6] trong đó tế bào cho đóng vai trò quan trọng cho sự hình thành phôi lợn nhân bản sau SCNT

Những dòng tế bào cho sử dụng trong SCNT gồm có: tế bào tuyến vú,

tế bào cumulus, tế bào ống dẫn trứng, tế bào hạt, tế bào cơ, nguyên bào sợi [7], trong đó nguyên bào sợi thường được ưu tiên lựa chọn để sử dụng cho quá trình tạo phôi SCNT Kết quả tạo phôi nhân bản chịu tác động của một số yếu tố liên quan đến tế bào cho như: nguồn gốc tế bào cho, số lần cấy chuyển của tế bào cho, giai đoạn phát triển của nhân tế bào cho tại thời điểm được cấy chuyển… Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả tạo phôi SCNT nói chung

và phôi lợn SCNT nói riêng các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các yếu

tố liên quan đến tế bào cho

Nghị định 13/2020/NĐ-CP ngày 21/01/2020 của Chính phủ đã xếp lợn

Ỉ vào danh sách những loài vật nuôi cần được bảo tồn bởi sự suy giảm về mặt

số lượng của chúng hiện nay tại Việt Nam Nguyên nhân của sự suy giảm số lượng lợn Ỉ là do ảnh hưởng của dịch bệnh như dịch tả lợn Châu Phi, sự gia tăng của các giống lợn thương mại Việc tạo ra lợn Ỉ nhân bản bằng SCNT không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen lợn Ỉ, đảm bảo sự đa dạng sinh học, mà còn

mở ra hướng bảo tồn, phát triển các động vật nuôi có giá trị khác Chính vì

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản”

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá được ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn

Ỉ nhân bản

3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi

lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

- Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

- Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu

quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về lợn Ỉ Việt Nam

Lợn Ỉ là một trong 26 giống lợn bản địa của Việt Nam được nuôi hầu

như ở khắp các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Thanh Hoá trước những năm 70 [8] Lợn Ỉ có hai dòng: lợn Ỉ gộc và lợn Ỉ mỡ Lợn Ỉ có hình dáng bên ngoài đặc trưng với lớp da đen bóng, mặt nhăn, mắt híp, nọng cổ và má chảy sệ, lưng võng, chân và mõm ngắn, bụng sệ sát đất [9] Lợn Ỉ cái có dáng đi chữ bát, trung bình đẻ 2 lứa/năm, 8-11 con/lứa đẻ Khối lượng sơ sinh của lợn Ỉ thấp, chỉ khoảng 0,4kg/con, trọng lượng giai đoạn 1 năm tuổi đạt 36-45kg/con, giai đoạn 3 năm tuổi đạt 50-75kg/con Tỷ lệ mỡ ở dòng Ỉ mỡ lên tới 48%, Ỉ gộc lên tới 42% so với thịt xẻ [9] Tuy nhiên, lợn Móng Cái với sức sinh sản tốt hơn, ngày càng chiếm ưu thế và gia tăng về mặt số lượng, điều này đã khiến cho số lượng lợn Ỉ giảm dần Từ cuối những năm 70, số lượng lợn Ỉ ngày càng ít dần đến mức độ nguy kịch và có nguy cơ bị tuyệt chủng [8]

Hình 1.1 Lợn Ỉ (Nguồn ảnh: https://trangtraiviet.danviet.vn/gian-nan-phuc-trang-giong-lon-i-co-

truyen-88895838.htm) [9]

Năm 1989, xã Quảng Giao (Quảng Xương) có 145 lợn nái, con già nhất

15 năm, con trẻ nhất là 2 tháng tuổi, không có gia đình nào nuôi lợn đực giống Năm 1992, chỉ còn khoảng 465 con nái Ỉ được nuôi tại một số xã tiếp giáp huyện Quảng Xương- Thanh Hóa, tuy nhiên phần lớn đã già có con tới

14 năm tuổi, không có gia đình nào nuôi lợn đực giống vì sợ lỗ vốn, tình trạng

đó dẫn đến đàn lợn ngày càng bị hủy diệt vì không có hậu bị thay thế Nhờ có chương trình bảo tồn quỹ gen vật nuôi quốc gia, lợn Ỉ Thanh Hóa đã mang lại kết quả bảo tồn được 2 con đực giống Ỉ đưa vào sử dụng khai thác phối giống

để sản xuất lợn Ỉ thuần

Trong những năm gần đây đàn lợn Ỉ vẫn đang ở trong tình trạng khủng hoảng lợn đực giống và việc sử dụng đực giống với cách làm cho con phối giống với mẹ, anh phối giống với em, do đó xảy ra hiện tượng đồng huyết cao: lợn con đẻ ra hay bị chết, còi cọc, số con đẻ ra/lứa thấp v.v Trước tình hình đó, các cán bộ kỹ thuật là những người tham gia công tác bảo tồn quỹ

gen lợn Ỉ đã phải sử dụng phương pháp Exsitu chuyển địa điểm nuôi về Viện

Chăn nuôi bảo tồn con vật sống và sau này tiến hành bảo tồn tinh đông lạnh [10] Đồng thời lợn Ỉ đã được Bộ Nông nghiệp và PTNT, Bộ Khoa học và Công nghệ phê duyệt thực hiện chương trình phục tráng và phát triển nguồn gen lợn Ỉ và giao công ty DaBaCo chủ trì thực hiện giai đoạn 2018-2022 Bên cạnh đó Bộ Nông nghiệp và PTNT cũng đã giao cho Phòng TNTĐ Công nghệ

tế bào động vật- Viện Chăn nuôi thực hiện nhiệm vụ tạo lợn Ỉ nhân bản bằng

kỹ thuật cấy chuyển nhân tế bào soma (giai đoạn 2017-2020 và 2022-2026), với mục đích nghiên cứu ứng dụng công nghệ nhân bản động vật trong việc gìn giữ và phát triển một số loài vật nuôi quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng tại Việt Nam

1.2 Cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT)

Các phương pháp tạo phôi động vật nhân bản gồm có: cắt phôi, chia tách phôi, cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) Tuy nhiên, với những ưu điểm của mình nên hiện nay phương pháp tạo phôi SCNT được ứng dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về nhân bản động vật Cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) là kỹ thuật hỗ trợ sinh sản trong đó tế bào soma được chuyển vào tế bào trứng nhận đã loại nhân, từ đó hình thành các

cá thể mới giống hệt con cho (cá thể cung cấp tế bào cho) về mặt di truyền

SCNT là một trong những kỹ thuật hỗ trợ sinh sản duy nhất có thể tạo ra được những động vật nhân bản từ những động vật quý hiếm, qua đó tăng nhanh và nhân rộng các kiểu gen ưu việt [11]

Quá trình chuyển nhân tế bào soma được thực hiện bằng kỹ thuật vi tiêm hoặc xung điện tùy thuộc vào từng loại tế bào trứng nhận có hoặc không

có màng sáng Chuyển nhân tế bào cho bằng vi tiêm được áp dụng để tạo phôi nhân bản có màng sáng, còn đối với phôi nhân bản không có màng sáng thì sử dụng dòng xung điện Kỹ thuật vi tiêm được thực hiện như sau: Các kỹ thuật viên sẽ tạo một lỗ thủng nhỏ trên màng sáng bằng phương pháp cơ học hoặc chiếu tia lazer Tiếp theo, để đưa được tế bào cho vào bên trong tế bào trứng nhận cần sử dụng một micropipet có chứa một tế bào cho xuyên vào bên trong

tế bào trứng nhận, tạo một lực đẩy để nhẹ nhàng đẩy tế bào cho vào bên trong

tế bào trứng nhận

Hiện nay, phổ biến nhất là sử dụng một dòng xung điện để cấy chuyển nhân tế bào soma vào tế bào trứng nhận và tạo phôi động vật nhân bản phổ biến nhất [12] Để thực hiện được, trước khi cấy chuyển, kết dính tế bào trứng nhận với tế bào soma trong môi trường có bổ sung Phytohemagglutinin (PHA) [13] PHA có tác dụng giúp cho tế bào soma bám dính vào tế bào trứng nhận, từ đó hình thành cặp đôi tế bào trứng nhận – tế bào cho [14] Trong khi đó đối với phôi lợn nhân bản có màng sáng, trước khi cấy chuyển

tế bào cho được đưa vào dưới màng sáng bằng một micropipette thông qua một lỗ thủng trên màng sáng đã được tạo ra trước đó [15] Tiếp theo quá trình dung hợp sẽ được thực hiện bằng một dòng xung điện Dưới tác dụng của dòng xung điện, tế bào cho sẽ từ từ di chuyển vào bên trong tế bào chất tế bào trứng nhận mà không làm tổn thương màng tế bào trứng

Theo Lagutina và cs [16], do tế bào cho được chuyển vào dưới màng zona pellucida, và không được bám dính nên chúng di chuyển bên trong không gian dưới màng sáng, vì vậy tỷ lệ dung hợp thành công của tế bào trứng nhận có màng sáng sẽ thấp hơn so với không có màng sáng Thậm chí ở

bò và ngựa, tỷ lệ dung hợp thành công đối với tế bào trứng nhận không màng sáng lên tới 100% [16]

1.3 Các dạng tế bào soma sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma

Trong quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma, các nhà nghiên cứu thường sử dụng một số loại tế bào khác nhau như: tế bào phôi, nguyên bào sợi, tế bào tuyến vú, tế bào cumulus, tế bào ống dẫn trứng, tế bào hạt, tế bào mầm, tế bào gan [7] Tuy nhiên, do sự thuận tiện của việc phân lập nguyên bào sợi từ bào thai hoặc mô tai của động vật cho, nên nguyên bào sợi thường được các nhà nghiên cứu sử dụng như một nguồn nguyên vật liệu để tạo phôi động vật nhân bản

Hiệu quả tạo phôi và động vật nhân bản của nhiều dạng nguyên bào sợi khác nhau thu từ động vật trưởng thành, động vật mới sinh, bào thai con cái hoặc con đực đã được nghiên cứu và đánh giá Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ phôi nang tạo ra giữa các dạng nguyên bào sợi, ngoại trừ sự khác biệt giữa nguyên bào sợi thu từ cơ của bào thai và nguyên bào sợi thu từ gan của con đực trưởng thành [17] Wakayama và Yanagimachi [18] cũng không nhận thấy sự khác biệt về hiệu quả tạo phôi chuột nhân bản bằng SCNT từ các nguyên bào sợi ở các chủng, giới tính hay độ tuổi khác nhau Điều này cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ tạo phôi nhân bản giữa các dạng nguyên bào sợi

Hiện nay, các nguyên bào sợi chủ yếu được thu từ bào thai của động vật cho hoặc mô tai của động vật cho trưởng thành Theo Miyoshi và cs [19], nguyên bào sợi thu từ bào thai của động vật cho trong quá trình phân lập, nuôi

in vitro sẽ ít chịu những tổn thương về mặt di truyền và tăng sinh tốt hơn so

với nguyên bào sợi thu từ mô tai động vật cho trưởng thành Tuy nhiên, Kato

và cs [17] không nhận thấy sự khác biệt về tỷ lệ phôi nang bò nhân bản được tạo ra từ nguyên bào sợi của bò cho trưởng thành, bò mới sinh và bào thai bò Mặc dù vậy, khi Kato và cs [17] đánh giá khả năng có chửa sau cấy chuyển phôi nhân bản thu từ các nguyên bào sợi của bò cho trưởng thành, bò mới sinh và bào thai bò lại nhận thấy tỷ lệ sảy thai ở những bò nhận được cấy chuyển phôi nhân bản có nguồn gốc từ nguyên bào sợi của bò cho trưởng thành là cao hơn so với các nhóm nguyên bào sợi còn lại Tương tự như vậy, theo Niemann và cs [20] mặc dù không có sự khác nhau về tỷ lệ dung hợp thành công của tế bào cho, khả năng phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi nang của tế bào trứng nhận sau cấy chuyển nhân nguyên bào sợi bào thai

bò hoặc bò trưởng thành, tuy nhiên hiện tượng sảy thai sau cấy chuyển phôi

bò nhân bản lại chỉ xảy ra đối với những bò nhận được cấy chuyển phôi nhân bản có nguồn gốc từ nguyên bào sợi bò trưởng thành

Bất chấp những rủi ro có thể xảy ra khi cấy chuyển phôi nhân bản có nguồn gốc từ nguyên bào sợi của động vật cho trưởng thành, hiện nay nguyên bào sợi của động vật cho trưởng thành vẫn là sự lựa chọn hàng đầu cho quá trình tạo dòng tế bào cho, sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma tạo động vật nhân bản Nguyên nhân là do việc thu, phân lập nguyên bào sợi

từ bào thai của động vật cho sẽ phức tạp hơn so với việc thu nguyên bào sợi

từ mô tai của động vật cho trưởng thành Bên cạnh đó, đối với những động vật nuôi quý hiếm hoặc bị chết đột ngột thì việc thu nguyên bào sợi từ bào thai là việc làm bất khả thi Chính vì vậy, đối với những động vật nuôi quý hiếm hoặc có giá trị các nhà nghiên cứu vẫn sử dụng nguyên bào sợi có nguồn gốc từ mô tai của động vật cho trưởng thành Để cải thiện hiệu quả nhân bản

từ nguyên bào sợi dạng này, các nhà nghiên cứu đã chuẩn hóa các điều kiện liên quan đến tế bào cho trước khi cấy chuyển nhân như: đồng pha chu trình

tế bào cho, điều kiện nuôi phôi nhân bản, nguồn gốc nguyên bào sợi…

1.4 Đồng pha chu trình nguyên bào sợi (tế bào cho) về giai đoạn G0/G1 bằng huyết thanh

Việc ứng dụng kỹ thuật SCNT để tạo ra động vật nhân bản với mục đích sử dụng chúng như là nguồn nguyên liệu dùng trong y học với mục đích cấy ghép nội tạng; trong đó lợn là một loài động vật thích hợp nhất sử dụng cho mục đích này đang rất được quan tâm [21] Nguyên nhân là do một số bộ phận của lợn có sự tương đồng về mặt giải phẫu và vật lý đối với con người Mặc dù đã có một số nghiên cứu trên thế giới công bố về việc nhân bản lợn thành công bằng kỹ thuật SCNT [22], tuy nhiên hiệu quả tạo lợn con nhân bản vẫn còn thấp, và đó cũng là một trong những trở ngại lớn của việc ứng dụng

kỹ thuật SCNT trên động vật [23]

Hiệu quả thấp của kỹ thuật SCNT thể hiện bởi tỷ lệ phát triển phôi thấp

và tỷ lệ sảy thai cao trong suốt thời kỳ mang thai, dẫn đến tỷ lệ sống của con non kém Có nhiều nguyên nhân cũng như lý do để giải thích cho điều này như: sự không đồng bộ giữa tế bào cho và tế bào nhận [24]; những biểu hiện

di truyền và nhiễm sắc thể bất thường của tế bào cho [25]; kỹ thuật cấy chuyển nhân [26]

Các ứng dụng của SCNT trong việc tạo phôi và động vật nhân bản đang được cải thiện từng ngày Nhân tế bào soma được cấy chuyển vào tế bào trứng nhận ở giai đoạn MII trước khi kích hoạt Các dòng tế bào cho sử dụng trong SCNT bao gồm: các tế bào tuyến vú, tế bào cumulus, tế bào ống dẫn trứng, tế bào hạt, tế bào cơ, nguyên bào sợi [7] Nguyên bào sợi (Fibroblast)

là nguồn nguyên liệu thường được dùng trong quá trình tạo phôi SCNT, tốc

độ phát triển của phôi nhân bản được tăng cường khi nhân của tế bào cho ở giai đoạn G0 trong chu trình tế bào [27] Nguyên nhân có thể là do sự khác biệt về ADN của nhân tế bào cho ở mỗi giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào

Các giai đoạn của nhân tế bào cho trong chu kỳ tế bào là một yếu tố rất quan trọng đối với sự thành công của quá trình tạo phôi nhân bản SCNT [28] Một chu trình của tế bào nhân chuẩn bắt đầu từ giai đoạn G0 (ngừng hoạt động) đến giai đoạn G1 (không có sự tổng hợp ADN), sau đó là đến giai đoạn

S (tổng hợp ADN), rồi đến giai đoạn G2 (không có sự tổng hợp ADN) và cuối cùng là giai đoạn M (phân chia tế bào) Theo Campbell và cs [29] tế bào cho

có nhân ở giai đoạn G0 là thuận lợi nhất cho việc tái lập trình nhân của nhân

tế bào cho; tuy nhiên đến nay theo một số báo cáo đã được công bố thì cho dù nhân tế bào cho ở pha G0 hay pha G1 cũng sẽ không tác động nhiều đến kết quả nhân bản [30] Tỷ lệ phôi nang phát triển từ nhân tế bào cho ở pha G0 hoặc G1 là như nhau Để tăng tỷ lệ này, nhân các tế bào cho phải ở pha G0/G1 khi chuyển vào tế bào trứng nhận thành thục loại nhân Mặc dù Ono

và cs [31] cho rằng khi cấy chuyển nhân tế bào cho ở giai đoạn G2/M vẫn tạo được phôi nhân bản, nhưng hiệu quả là không cao khi được so sánh với giai đoạn G0/G1 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phôi nang được tăng lên khi nhân của tế bào cho ở giai đoạn G0/G1 được chuyển vào tế bào trứng có tế bào chất

đã hoạt hóa và loại nhân [32]

Để có thể thu tế bào cho có nhân được đồng pha ở giai đoạn G0/G1 thì các tế bào này sẽ được nuôi dưới một số điều kiện trước khi cấy chuyển nhân Nuôi ít huyết thanh là một phương pháp thường được sử dụng để đưa nhân tế bào về pha G0/G1 [33] Thông thường để có thể hoàn thành được đầy đủ chu trình tế bào của mình thì tế bào nuôi cần được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng

Nguyên bào sợi của động vật có vú thường đòi hỏi các chất gây phân bào để tăng trưởng thông qua pha G1 của chu trình tế bào Khi các tế bào đã vượt qua được giai đoạn G1 chúng có thể vào giai đoạn S và hoàn thiện chu trình tế bào mà không cần sự kích thích của các yếu tố phân bào [34] Việc không có hoặc có ít huyết thanh trong môi trường nuôi sẽ làm giảm quá trình chuyển hóa tế bào và làm cho các tế bào chuyển về giai đoạn G0/G1 [35] Khi môi trường nuôi ít huyết thanh sẽ làm mất các tín hiệu phân bào, do đó tế bào sẽ nhanh chóng thoát ra khỏi chu trình tế bào trở về trạng thái không phân chia, gọi là pha G0 Đặc trưng của tế bào khi nhân của chúng ở giai đoạn G0 là các hoạt động trao đổi chất rất thấp [36]

Ngoài phương pháp đồng pha chu trình tế bào bằng việc nuôi ít huyết thanh, có thể sử dụng các chất ức chế hóa học để dừng chu trình tế bào ở các giai đoạn khác nhau Ví dụ như Aphidicolin là một chất ức chế thuận nghịch polymerase ADN động vật có vú và dừng chu trình tế bào ở các quá trình chuyển đổi từ pha G1 đến pha S Tuy nhiên các chất ức chế hóa học này thường gây ra những ảnh hưởng bất lợi đến tế bào sau khi đồng pha Theo Mutomba và Wang [37], Aphidicolin dừng chu trình tế bào không thông qua

sự ức chế tổng hợp ADN, mà thông qua con đường không xác định Do đó, nếu tế bào đã bị ngừng chu trình tế bào, sau khi loại bỏ các chất ức chế sẽ không tiếp tục phát triển bình thường ngay sau đó

Theo Michael [38], trong quá trình đồng pha chu trình tế bào động vật

có vú, việc dừng tế bào bằng các chất ức chế hóa học có thể dẫn đến hiện tượng mất cân bằng tăng trưởng tế bào, điều này có thể làm giảm số lượng phôi, động vật nhân bản Chính vì vậy, hiện nay nuôi ít huyết thanh là phương pháp thường được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để đồng pha nhân tế bào

về pha G0/G1 [39]

1.5 Thời gian nuôi đồng pha

Thời gian nuôi đồng pha tế bào cho để nhân của chúng có thể đạt tới giai đoạn G0/G1 là khác nhau giữa các nghiên cứu Theo Oback và Wells [40], đối với nguyên bào sợi bò cần phải nuôi trong môi trường nuôi ít huyết thanh từ 3-7 ngày thì mới có thể giúp cho nhân nguyên bào sợi chuyển sang giai đoạn G0/G1 và đủ điều kiện sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân Trong khi đó, Miranda và cs [39]; Sun và cs [41] nhận thấy chỉ cần nuôi

nguyên bào sợi bò trong 72 giờ ở điều kiện ít huyết thanh là đủ điều kiện để

sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân với tỷ lệ nhân tế bào cho ở giai đoạn G0/G1 đạt > 80% Kues và cs [33] lại cho rằng đối với nguyên bào thai lợn để nhân của chúng đạt tới giai đoạn G0/G1 thì thời gian nuôi ít huyết thanh hợp

Phân tích đo dòng chảy ADN (Flow cytometric DNA) là một phương pháp nhanh chóng và đáng tin cậy, nhằm xác định xem nhân tế bào đang ở giai đoạn G0, G1, G2, M hay S Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng thiết bị này để kiểm tra, đánh giá hiệu quả đồng pha nhân tế bào đến khả năng tạo phôi nhân bản SCNT [43] ở lợn [33], mèo [44] Theo Katska và cs [43] thiết

bị này giúp họ đánh giá được chính xác tỷ lệ nguyên bào sợi và tế bào cumulus bò có nhân ở giai đoạn G0/G1; do đó nó được sử dụng như một công

cụ để xác định được hiệu quả đồng pha tế bào cho trước khi cấy chuyển

1.7 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi (tế bào cho) trong

nuôi in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản

Tế bào cho là một trong những yếu tố chính có ảnh hưởng đến hiệu quả tạo lợn nhân bản Hiệu quả tạo động vật nhân bản chịu ảnh hưởng của số lần

cấy chuyển của tế bào cho trong quá trình nuôi in vitro [45] Những tổn thương di truyền có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro tế bào cho trước khi cấy chuyển nhân Điều kiện nuôi in vitro có thể gây ra những thay

đổi ảnh hưởng đến nhiễm sắc thể và sự biểu hiện của gen [46], qua đó sẽ làm giảm khả năng tạo phôi động vật nhân bản SCNT

Nhân tế bào cho sau khi hoàn thành việc di chuyển vào tế bào trứng nhận sẽ phản ứng với các yếu tố phân tử của tế bào chất tế bào trứng nhận để từ đó bắt đầu quá trình tái lập trình sửa đổi hệ gen [47] Một số kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển sớm hoặc cấy chuyển muộn sẽ làm gia tăng sự bất thường nhiễm sắc thể, ADN bị hư hỏng và làm methyl hóa ADN của phôi nhân bản [48]; [49] Jin và cs [45] cho rằng, sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển lần 1 cho tỷ lệ lợn nhận có chửa và đẻ con cao hơn ở lần cấy chuyển thứ 4, 5, 6 Việc sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển thứ 4, 5, 6 không ảnh hưởng đến tỷ lệ lợn nhận có chửa Tuy nhiên khi sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển lần 5 cho số lượng lợn con nhân bản sinh ra nhiều nhất Đặc biệt, theo Jin và cs [45], khi sử dụng tế bào cho ở lần cấy chuyển 7 trở lên sẽ làm giảm tỷ lệ mang thai và có chửa Jin

và cs [45] cho rằng việc sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển cao sẽ làm giảm hiệu quả nhân bản lợn

Trong khi đó, Kubota và cs [50] lại cho rằng, đối với bò việc sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển từ 10-15 cho tỷ lệ tạo phôi nang nhân bản cao hơn khi sử dụng tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển thấp hơn Thậm chí Kubota và cs [50] còn báo cáo rằng để cải thiện hiệu quả tạo bê nhân bản nên cấy chuyển phôi bò nhân bản từ tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển cao Miyoshi và cs [19] cũng đồng quan điểm khi nhận thấy số lượng phôi nang bò nhân bản có nguồn gốc từ tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển 15 cao hơn so với tế bào cho ở giai đoạn cấy chuyển 10, 11 và 13

1.8 Vai trò của dòng tế bào cho đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản

Việc phát triển tiếp theo của phôi nhân bản sau cấy chuyển phôi hoặc tạo động vật nhân bản còn khác nhau giữa các dòng tế bào cho ngay cả khi chúng có nguồn gốc từ cùng một mô hoặc cơ quan [17] Miyoshi và cs [19] nhận thấy sự không giống nhau về tỷ lệ tạo phôi, tỷ lệ có chửa và tạo bê nhân bản từ các dòng tế bào cho trưởng thành thu từ các bò cho tế bào cho khác nhau Kuhholzer và cs [51] cũng thu được kết quả tương tự trong quá trình nghiên cứu nhân bản lợn Kuhholzer và cs [51] khi nghiên cứu 9 dòng tế bào cho từ 9 lợn cho tế bào cho khác nhau nhận thấy chỉ có 4/9 dòng tế bào cho có khả năng mang thai và chỉ duy nhất một dòng tế bào cho đạt tới giai đoạn ngày 90 của thai kỳ Thậm chí, sự khác biệt giữa các dòng tế bào cho còn thể

hiện ở số lượng tế bào cho được dung hợp thành công với tế bào nhận, cũng như số lượng phôi SCNT được tạo ra

Theo Kuhholzer và cs [51], sự khác nhau về hiệu quả dung hợp của các dòng tế bào có thể là do sự sai khác về kích thước cũng như sự ổn định màng

và bề mặt tế bào cho Kuhholzer và cs [51] nhận thấy ở dòng tế bào cho có tỷ

lệ dung hợp thấp nhất thì phần lớn các tế bào cho đều có bề mặt hơi gồ ghề hoặc có kích thước lớn Sự khác biệt giữa các dòng tế bào cho ở cả bò và lợn

có thể là do sự khác nhau trong quá trình sinh trưởng Những thay đổi xảy ra trong quá trình nuôi cấy tế bào sơ cấp có thể ảnh hưởng đến việc tái lập trình

tế bào cho sau cấy chuyển [19] Chính vì vậy việc lựa chọn dòng tế bào cho cũng là một trong những nhân tố có ảnh hưởng đến kết quả tạo phôi và lợn nhân bản

1.9 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh sản trong chăn nuôi ở Việt Nam được các nhà khoa học rất quan tâm Các nghiên cứu ứng

dụng công nghệ sinh sản trên lợn như: nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn, tạo phôi lợn in vitro… đã được các nhà khoa học thực hiện tại Việt Nam

từ đầu những năm 2000 Nguyễn Thị Ước và cs [52] công bố về việc tạo

thành công phôi lợn bằng thụ tinh in vitro và nhân bản vô tính Theo các tác giả này, khi nuôi phôi lợn thụ tinh in vitro 2 ngày đầu trong môi trường

NCSU-37 + BSA +β-mercaptoethanol + pyruvate + lactate hoặc nuôi cùng

với nguyên bào sợi, tế bào ống dẫn trứng cho tỷ lệ phôi nang lợn in vitro đạt >

Nguyễn Thị Nhung [60] đã đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi đến sự phát triển của phôi lợn nhân bản vô tính và nhận thấy số lượng

phôi lợn nhân bản sẽ được cải thiện khi dùng môi trường PZM3 trong quá trình nuôi phôi Nguyen Thi Nhung và cs [61] nhận thấy trong các dạng tế bào cho: tế bào cumulus, tế bào hạt và nguyên bào sợi thì nguyên bào sợi (fibroblast) cho tỷ lệ phôi nang lợn nhân bản cao hơn so với tế bào cumulus,

tế bào hạt Theo Huỳnh Thị Hường và cs [62] giới tính của dòng tế bào cho không ảnh hưởng đến việc tạo phôi nang lợn Bản nhân bản Các tác giả này nhận thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ tạo phôi nang nhận bản khi sử dụng

tế bào cho từ con cái hoặc con đực

Cho đến nay, tại Việt Nam, mặc dù đã có nhiều công bố về việc tạo phôi lợn SCNT, tuy nhiên kết quả tạo phôi nang lợn nhân bản vẫn còn thấp

Để cải thiện các nhà khoa học đã nghiên cứu thêm một số yếu tố tác động như: tế bào trứng nhận, các chất sử dụng cho quá trình hoạt hóa tế bào trứng sau SCNT Nguyễn Khánh Vân và cs [58] lần đầu tiên đã so sánh việc tạo phôi lợn Ỉ nhân bản có và không có màng sáng Kết quả thấy việc tạo phôi lợn

Ỉ nhân bản không có màng sáng giúp nâng cao hiệu quả tạo phôi nang với tỷ

lệ > 24% Cũng theo Nguyễn Khánh Vân và cs [57], khi sử dụng 6-DMAP hoặc Cytochalasin B làm chất hoạt hóa không ảnh hưởng đến tỷ lệ phôi nang lợn Ỉ nhân bản được tạo ra Van và cs [59] đã nhận thấy số lượng phôi nang Ỉ nhân bản tăng lên khi bổ sung FCS ở ngày thứ 5 sau hoạt hóa vào môi trường nuôi phôi PZM3

Lợn Ỉ là một trong những giống lợn quý hiếm, có số lượng bị suy giảm

và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng tại Việt Nam Việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nhân bản động vật nhằm lưu giữ và tái tạo lại đàn lợn Ỉ khi cần thiết là một hướng nghiên cứu mới tại Việt Nam Trong giai đoạn 2017-

2020, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi đã nhân bản thành công lợn Ỉ đực bằng kỹ thuật SCNT, tuy nhiên hiệu quả vẫn còn thấp Chính vì vậy, giai đoạn 2022-2026, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi tiếp tục được Bộ Nông nghiệp và PTNT tin tưởng giao nhiệm vụ nghiên cứu, hoàn thiện quy trình tạo lợn Ỉ nhân bản với mục đích nâng cao hiệu quả tạo lợn Ỉ nhân bản Kết quả nghiên cứu của luận văn này là một phần nội dung công việc của nhiệm vụ nghiên cứu, hoàn thiện quy trình tạo lợn Ỉ nhân bản

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: nguyên bào sợi lợn Ỉ

- Vật liệu nghiên cứu: Buồng trứng lợn được thu từ lợn hậu bị Landrace x Yorkshire 6-8 tháng tuổi tại lò mổ

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi

- Thời gian nghiên cứu: 06/2022 – 12/2023

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu mô tai lợn

- Mô tai thu từ lợn Ỉ đực và cái được nuôi dưỡng tại Trung tâm lợn giống

Dabaco-Bắc Ninh (Hình 2.1; hình 2.2)

- Cạo lông, sát trùng cẩn thận bằng cồn 70oC tại vị trí lấy mẫu; trước khi lấy mẫu dùng panh kẹp tại vị trí lấy mẫu để cầm máu rồi dùng kìm bấm tai để bấm lấy mẫu và cho vào đĩa petri vô trùng (Hình 2.2)

Hình 2.1 Lợn Ỉ đực thuần trước khi thu mẫu mô tai

Hình 2.2 Lợn Ỉ cái thuần trước khi thu mẫu mô tai

Hình 2.3 Thu mẫu mô tai lợn Ỉ

- Mẫu sau khi thu được lau bằng giấy có thấm cồn rồi rửa nhiều lần trong môi trường thu mẫu mô tai, sau đó đem ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 3

giờ

2.2.2 Phương pháp phân lập nguyên bào sợi từ mẫu mô tai lợn

- Mẫu mô tai lợn Ỉ sau khi thu và đưa về phòng thí nghiệm sẽ được rửa nhiều lần bằng môi trường rửa mẫu DPBS có bổ sung kháng sinh, sau đó nhúng thẳng vào cồn 90oC, rồi lại cho vào môi trường rửa mẫu rửa sạch

- Cạo bỏ hết lông, mỡ thừa trên mẫu mô tai để thu phần biểu bì; tiếp theo cắt mẫu mô tai thành từng mảnh nhỏ (diện tích mỗi mảnh khoảng 1mm2), rửa lại các mảnh này trong môi trường nuôi tế bào DMEM + 10% huyết thanh thai

bê (FCS) + kháng sinh Đặt nhẹ nhàng các mảnh này vào đĩa nuôi, sau vài phút cho nhẹ nhàng môi trường nuôi tế bào DMEM + 10% FCS + kháng sinh vào đĩa nuôi Φ 35mm (12-15 mảnh nhỏ mô tai 1mm2/đĩa), tránh cho mẫu bị long khỏi đáy đĩa nuôi, lượng môi trường nuôi phải bổ sung đủ để ngập mẫu

- Đĩa nuôi được nuôi ở điều kiện 5% CO2, 37oC, độ ẩm không khí bão hòa; thời gian nuôi khoảng 9-10 ngày

- Trong thời gian nuôi mẫu từ 9-10 ngày phải thường xuyên kiểm tra môi trường nuôi; nếu thấy môi trường nuôi chuyển màu vàng thì phải thay môi trường hoặc có hiện tượng bị nhiễm khuẩn thì phải loại bỏ luôn đĩa nuôi đó Cách thay môi trường: hút bỏ nhẹ nhàng toàn bộ môi trường nuôi trong đĩa nuôi; rửa lại bằng môi trường nuôi mới từ 2-3 lần sau đó bổ sung môi trường nuôi mới vào

- Sau 9-10 ngày sẽ loại bỏ mảnh mô tai và thay môi trường nuôi nếu thấy có nguyên bào sợi phát triển từ mảnh mô tai, nuôi cho đến khi nguyên bào sợi phát triển, phủ kín khoảng 80-90% đáy đĩa nuôi thì bắt đầu tiến hành cấy chuyển lần 1

2.2.3 Phương pháp cấy chuyển nguyên bào sợi

- Hút bỏ hết môi trường nuôi trong các đĩa nuôi với lượng nguyên bào sợi đã phủ kín 80-90% đáy đĩa nuôi; rửa lại 2-3 lần bằng môi trường nuôi sau đó bổ sung Trypsin EDTA để trong vòng 5 phút (búng nhẹ đáy đĩa để các tế bào bong ra hết), tiếp theo bổ sung môi trường nuôi có thể tích bằng thể tích Trypsin EDTA đã bổ sung để bất hoạt Trypsin EDTA

- Hút toàn bộ lượng dịch trong đĩa nuôi cho vào ống facol, ly tâm ở 37oC với tốc độ 2000 vòng/phút trong vòng 5 phút Sau khi ly tâm xong, hút bỏ phần dịch nổi rồi bổ sung môi trường nuôi vào, hút đẩy nhẹ nhàng để hòa tan phần cặn Hút toàn bộ phần dịch này cho vào các đĩa nuôi; bổ sung thêm môi trường nuôi và nuôi tiếp trong tủ nuôi ở điều kiện 5% CO2; 38,5oC, độ ẩm không khí bão hòa cho tới khi các nguyên bào sợi phủ kín 80 - 90% đáy đĩa nuôi thì lại tiếp tục cấy chuyển 2-3 lần nữa

2.2.4 Đồng pha chu trình nguyên bào sợi

- Các nguyên bào sợi sau khi nuôi đến giai đoạn cấy chuyển lần thứ 3 sẽ được

sử dụng để đồng pha chu kỳ tế bào Hút bỏ nhẹ nhàng toàn bộ môi trường nuôi trong đĩa nuôi, rửa lại bằng môi trường DMEM 2-3 lần và sau đó bổ sung môi trường nuôi DMEM có 0,2% huyết thanh thai bê (FCS) và nuôi trong điều kiện 5% CO2; 37oC, độ ẩm không khí bão hòa

2.2.5 Kiểm tra, đánh giá nhân nguyên bào sợi bằng hệ thống FACS

- Các nguyên bào sợi sau khi đồng hóa sẽ được xử lý bằng Trypsin EDTA và rửa với PBS Tiếp theo hòa đều các tế bào trong PBS để đảm bảo tế bào tách riêng rẽ với nhau hoàn toàn, mật độ tế bào 1x106

– 1x107 tế bào/500μl PBS

- Ủ các nguyên bào sợi trong dung dịch cồn ethanol 70% duy trì ở 4oC trong

2 giờ, có thể để ở trong tủ lạnh 2 – 8oC hoặc để trên đá lạnh Sau khi cố định,

li tâm tại tốc độ 200vòng/5 phút Loại bỏ cồn Hòa đều tế bào trong 5ml DPBS, đợi 60 giây sau đó lại li tâm tiếp với tốc độ và thời gian tương tự Loại

bỏ dịch nổi

- Hòa đều tế bào trong 5ml PBS có Triton-X 100, thuốc nhuộm propidium iodide (PI), có chứa RNAse A, ủ 15-20 phút ở 37oC hoặc 30-45 phút ở nhiệt

độ phòng

- Phân tích trên hệ thống flow: mẫu được phân tích bởi hệ thống FACS Canto

II (BD) được kích thích bởi nguồn laser argon bước sóng 488nm Ánh sáng phát ra được thu nhận bởi hệ kính lọc cho các dải sóng đỏ

2.2.6 Đông lạnh nguyên bào sợi

- Các nguyên bào sợi sau khi thu sẽ được chuyển vào môi trường đông lạnh DMEM + 10% Dimethyl sulfoxide + 10% huyết thanh thai bê + kháng sinh, tiếp theo nạp ngay vào cọng rạ 0,25ml và để ở 4o

2.2.7 Giải đông nguyên bào sợi

- Cọng rạ có chứa các nguyên bào sợi sẽ được lấy ra khỏi dung dịch nitơ lỏng cho vào bể ấm 37oC (khoảng 10 giây), tiếp theo các nguyên bào sợi sẽ được chuyển vào môi trường 0,5M sucrose và sau 5 phút sẽ được ly tâm ở 200 vòng/10 phút Tiếp theo rửa vài lần trong môi trường DMEM + 10% FCS trước khi chuyển sang nuôi môi trường này

2.2.8 Thu, lựa chọn và nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn

2.2.8.1 Thu và lựa chọn tế bào trứng lợn từ buồng trứng lò mổ

- Buồng trứng lợn thu từ lò mổ, được để trong dung dịch bảo quản buồng trứng (PBS + 100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml), nhiệt độ 30 –

35oC, đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3 giờ

- Rửa buồng trứng lợn trong dung dịch bảo quản buồng trứng 2-3 lần ở nhiệt

- Các tế bào trứng sau khi soi tìm dưới kính hiển vi soi nổi sẽ được tiến hành đánh giá phân loại dựa theo phân loại của Goodhand và cs (2000) [63] Các tế

bào trứng loại A, B sẽ có ≥ 4 lớp tế bào cumulus chặt chẽ bao xung quanh, khối tế bào chất đồng nhất

2.2.8.2 Nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn

- Tế bào trứng lợn được nuôi thành thục in vitro trong vòng 40 – 44 giờ trong

hai môi trường nuôi IVM1 và IVM2

+ Môi trường IVM1: môi trường POM có bổ sung hormone, dbcAMP, EGF

22 giờ tiếp theo Sử dụng hệ thống đĩa 4 giếng để nuôi thành thục in vitro tế

bào trứng lợn, 30 – 50 tế bào trứng/giếng Các tế bào trứng được nuôi ở điều kiện 38,5o

C; 5% CO2, độ ẩm không khí bão hòa

2.2.8.3 Kiểm tra sự thành thục in vitro của tế bào trứng lợn

- Loại bỏ tế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng lợn sau nuôi thành thục bằng dung dịch Hyaluronidase trong TALP – Hepes với thời gian 3 phút Sau

đó tế bào trứng sẽ được rửa 2-3 lần bằng môi trường TALP – Hepes + FCS

- Tế bào trứng lợn sau khi không còn lớp tế bào cumulus bao xung quanh sẽ được chuyển sang quan sát dưới kính hiển vi soi nổi để quan sát thể cực thứ nhất (PB1) Những tế bào trứng lợn có sự xuất hiện của PB1 được coi là thành thục

2.2.9 Phương pháp loại nhân tế bào trứng lợn in vitro không có màng

sáng (ZP)

- Tế bào trứng lợn với sự xuất hiện của PB1 trước khi loại nhân sẽ được chuyển sang môi trường TALP-Hepes + 1,5μg/ml Pronase trong vòng 3 – 6 phút; sau đó các tế bào trứng không có màng sáng được chuyển sang môi trường TALP-Hepes + 10% CS

- Các tế bào trứng lợn không có ZP được chuyển sang môi trường PZM3 + 4μM Demecolcine trong vòng 20- 40 phút Sau 20-40 phút, quan sát và kiểm tra tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi, lựa chọn các tế bào trứng có xuất

hiện một khối hình nón lồi ra để từ đó định vị được vị trí của nhân và tiếp tục

sử dụng để tiến hành loại nhân

- Sau khi đã xác định chính xác vị trí của khối hình nón lồi ra trên màng tế bào trứng và tiến hành loại bỏ chúng trong môi trường TALP-Hepes + 0,5μg/ml Cytochalasin B bằng dao cắt vi phẫu thuật hoặc micro pipette dưới kính hiển vi vi thao tác Lưu ý rằng phần tế bào chất bị loại có thể tích tối đa dao động từ 5-10% thể tích tế bào trứng

Tế bào chất lồi ra sau xử lý

với Demelcocine có chứa nhân

Hình 2.4 Loại nhân tế bào trứng lợn không có màng sáng trong môi trường TALP-Hepes có bổ sung 0,5μg/ml Cytochalasin B bằng micro pipette

2.2.10 Phương pháp cấy chuyển nhân tế bào soma (tế bào cho) vào tế bào trứng nhận không có màng sáng

2.2.10.1 Tạo cặp tế bào cho – tế bào trứng nhận

- Sử dụng môi trường TCM 199 + 1mg/ml Phytohemagglutinin (PHA) để dính tế bào cho với tế bào trứng nhận Tế bào trứng nhận được để từ 2 – 3

giây trong môi trường TCM 199 + 1mg/ml Phytohemagglutinin (PHA) và được dính với 1 tế bào cho

2.2.10.2 Dung hợp tế bào trứng nhận với tế bào cho

- Cặp tế bào cho - tế bào trứng nhận được chuyển sang môi trường dung hợp trong vòng 2-3 phút cho đến khi chìm xuống đáy đĩa thì đưa sang buồng dung hợp chứa môi trường dung hợp kết nối với máy dung hợp và được dung hợp ở điều kiện 1,2kV/cm trong 30μs

- Chuyển cặp tế bào cho – tế bào trứng nhận vào môi trường PZM3 + 2,5% FCS ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2, 5% O2, độ ẩm không khí bão hòa Sau 2 giờ kiểm tra, loại bỏ những cặp tế bào cho – tế bào trứng nhận không dung hợp được Quá trình dung hợp thành công khi tế bào soma di chuyển vào bên trong tế bào trứng nhận

2.2.11 Phương pháp hoạt hóa tế bào trứng không có màng sáng sau SCNT

Sau SCNT, tế bào trứng nhận được hoạt hóa bằng cách xung điện lại ở điều kiện 1kV/cm trong 80μs, và chuyển sang môi trường PZM3 + 7,5µg/ml Cytochalasin B trong vòng 3 giờ ở 38,5oC; 5% CO2, 5% O2, độ ẩm không khí bão hòa

2.2.12 Phương pháp nuôi phôi lợn

Tế bào trứng nhận sau hoạt hóa được chuyển sang hệ thống nuôi

microwell có chứa môi trường nuôi phôi lợn in vitro ở 38,5oC; 5% CO2, 5%

O2, độ ẩm không khí bão hòa Sử dụng môi trường PZM3 cho quá trình nuôi phôi lợn nhân bản, bổ sung FCS ở ngày thứ 5 sau hoạt hóa Xác định tỷ lệ phân chia, tạo phôi nang ở ngày thứ 2 và 6 sau hoạt hóa

2.2.13 Nhuộm phôi bằng Hoechst 33342

- Phôi được rửa trong môi trường rửa phôi (PBS + 0,3% PVP); tiếp theo chuyển vào dung dịch nhuộm phôi có chứa 50µl Hoechst 33342 stock (250µg Hoechst 33342/ml Ethanol tuyệt đối ) + 450µl Ethanol tuyệt đối và để qua đêm ở 4o

C

- Sau đó, tiến hành rửa phôi trong Ethanol tuyệt đối, và chuyển sang rửa trong Glycerol Tiếp theo chuyển phôi sang lam kính, xếp hàng dọc từng phôi theo

chiều dọc lam kính Đậy nhẹ nhàng lamen lên lam kính và soi kiểm tra dưới

kính hiển vi huỳnh quang

2.2.14 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, kiểm tra sự sai khác bằng kiểm định One-way ANOVA, sự sai khác có ý nghĩa với P<0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha nguyên bào sợi lợn Ỉ thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4 Kết quả cho thấy thời gian đồng pha ảnh hưởng đến hiệu quả đồng pha nguyên bào sợi lợn Ỉ Kết quả kiểm tra nguyên bào sợi có nhân ở giai đoạn G0/G1 sau đồng pha thể hiện ở hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4 cho thấy sự đặc trưng riêng của các phân tích chu trình tế bào bằng hệ thống FACS Đỉnh huỳnh quang 50 thể hiện với các tế bào có nhân ở giai đoạn G0/G1 và đỉnh 100 thể hiện các tế bào

ở nhân ở pha G2/M (với lượng ADN gấp đôi) Tỷ lệ tế bào có nhân ở giai đoạn G0/G1 tương ứng với giá trị P3, giai đoạn G2/M tương ứng với P6 và giai đoạn S tương ứng với giá trị P4 trong bảng thống kê của phần mềm FACS DIVA trong hệ thống FACS

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha chu

trình nguyên bào sợi lợn Ỉ

Giai đoạn phát

triển của nhân

nguyên bào sợi

Thời gian đồng pha

G0/G1

% (Mean ± SE) 80,85b ± 1,34 89,78a ± 1,82 87,15a ± 1,89 73,86c ± 1,66

Ghi chú: Thí nghiệm được lặp lại 6 lần Các giá trị trong cùng một hàng có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P <0,05)

Dựa vào các kết quả phân tích của hệ thống FACS, chúng tôi nhận thấy

tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở G0/G1 tăng lên đáng kể khi kéo dài thời gian nuôi nguyên bào sợi trong điều kiện nuôi ít thuyết thanh từ 24 giờ lên 48 giờ,

72 giờ (tương ứng 80,85% so với 89,78% và 87,15%; P < 0,05) Tuy nhiên khi tăng thời gian nuôi lên 96 giờ thì tỷ lệ nguyên bào sợi với nhân ở G0/G1

có xu hướng giảm đi (tương ứng 73, 86% so với 80,85%, 89,78% và 87,15%;

P < 0,05, bảng 3.1) Kết quả này cũng phù hợp với báo cáo của Goissis và cs [64], Sun và cs [65] Theo Goissis và cs [64], tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở

pha G0/G1 sau đồng pha đạt cao nhất ở nhóm 48 giờ và có xu hướng giảm dần ở nhóm 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ và 144 giờ

Hiệu quả tạo phôi và động vật nhân bản bằng SCNT được cải thiện khi nhân của tế bào cho ở giai đoạn G0/G1 Phương pháp phổ biến để đưa nhân tế bào cho về giai đoạn G0/G1 là sử dụng môi trường nuôi ít huyết thanh [39];

có nghĩa là tế bào cho được nuôi trong môi trường nuôi có hàm lượng huyết thanh rất ít so với hàm lượng huyết thanh thường được bổ sung vào môi trường nuôi tế bào cho (10% huyết thanh) Theo Miranda và cs [39], hàm lượng huyết thanh thường được sử dụng để đồng pha nguyên bào sợi dao động từ 0,2-0,5%, do đó trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ huyết thanh cho quá trình đồng pha là 0,2% Thời gian đồng pha được đánh giá ở 4 mức: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ Để xác định được giai đoạn phát triển của nhân nguyên bào sợi chúng tôi sử dụng hệ thống đo dòng chảy

tế bào FACS Hiệu quả đồng pha dựa trên tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở pha G0/G1 cho từng nhóm thí nghiệm

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 24 giờ

bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 48 giờ

bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS

Hình 3.3 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 72 giờ

bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 96 giờ

bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS

Ghi chú: P3-tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở pha G0/G1

P4-tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở pha S

P6-tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở pha G2/M

Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc tăng thời gian đồng pha không đồng nghĩa với việc tăng tỷ lệ nguyên bào sợi có nhân ở G0/G1 Theo Miranda và cs [39], khi nguyên bào sợi được đồng pha một thời gian dài trong môi trường nuôi ít huyết thanh sẽ làm giảm các yếu tố sinh trưởng, steroids, một số yếu tố cần thiết cho quá trình kích thích phân bào và khả năng sống của nguyên bào sợi Đây cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến hiện tượng nguyên bào sợi có nhân ở pha G0/G1 giảm dần khi kéo dài thời gian đồng pha nguyên bào sợi Kết quả bảng 3.1 của chúng tôi cho thấy, thời gian phù hợp

để đồng pha nguyên bào sợi lợn Ỉ là 48 giờ

3.1.2 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào chất của tế bào trứng nhận

Sự thành công của việc cấy chuyển nhân tế bào soma vào tế bào trứng nhận chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong đó có liên quan đến quá trình đồng pha tế bào cho Để xác định việc đồng pha có tác động như thế nào đến khả năng cấy chuyển nhân nguyên bào sợi vào tế bào chất của tế bào trứng nhận, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng những nguyên bào sợi lợn Ỉ ở giai đoạn cấy chuyển lần 5-10 không đồng pha (đối chứng) và đã được đồng

pha 48 giờ trong môi trường đồng pha có chứa 0,2% huyết thanh thai bê Chúng tôi xác định hiệu quả cấy chuyển nhân dựa trên tỷ lệ nguyên bào sợi được cấy chuyển thành công vào bên trong tế bào trứng nhận Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của việc đồng pha đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế

bào cho vào tế bào chất của tế bào trứng nhận

nhân nguyên bào sợi (n)

Tế bào trứng được cấy chuyển nhân nguyên bào sợi thành công

Ghi chú: Thí nghiệm được thực hiện 8 lần

Kết quả ở bảng 3.2 của chúng tôi cho thấy không có sự khác biệt về tỷ

lệ cấy chuyển nhân thành công đối với nhóm đồng pha và không đồng pha (tương ứng 88,26% so với 88,75%; P > 0,05) Kết quả này thể hiện quá trình đồng pha nguyên bào sợi không làm ảnh hưởng đến hiệu quả cấy chuyển nhân nguyên bào sợi

Kết quả cấy chuyển nguyên bào sợi ở nhóm được đồng pha trong nghiên cứu này thấp hơn so với báo cáo của Lagutina và cs [16] nhưng lại cao hơn so với công bố của Samiec và cs [66] Tỷ lệ cấy chuyển thành công nguyên bào sợi đã đồng pha của Lagutina và cs [16] ở bò, ngựa, lợn và cừu dao động từ 95%-100%; trong khi đó theo báo cáo của Samiec và cs [66] chỉ

có 85,8% nguyên bào sợi đã đồng pha được cấy chuyển thành công Sự không thống nhất về kết quả giữa các nghiên cứu có thể là do nguồn gốc nguyên bào sợi, điều kiện thí nghiệm, khả năng thao tác của kỹ thuật viên…

Quá trình cấy chuyển nguyên bào sợi của chúng tôi được thực hiện với

tế bào trứng nhận không có màng sáng, do đó việc cấy chuyển nhân được thực hiện thông qua một dòng xung điện trong dung dịch dung hợp Trước khi thực hiện xung điện, một nguyên bào sợi sẽ được dính với một tế bào trứng nhận bằng môi trường TCM199 có chứa Phytohemaglutinin (PHA) PHA là một chất có tính chất tương tự chất keo dính giúp nguyên bào sợi bám dính vào bề màng tế bào chất tế bào trứng Tuy nhiên, đôi khi do quá trình thao tác của kỹ thuật viên hoặc do chính bản thân nguyên bào sợi mà sau khi xung

điện nguyên bào sợi sẽ không bám dính vào màng tế bào chất tế bào trứng

nhận Khi nguyên bào sợi không được bám dính vào màng tế bào chất tế bào

trứng nhận thì nguyên bào sợi sẽ không thể hoàn thành việc di chuyển vào

bên trong tế bào chất tế bào trứng nhận, do đó quá trình cấy chuyển nhân sẽ bị

thất bại Đây cũng có thể là một trong những lý do giải thích tại sao tỷ lệ

nguyên bào sợi được cấy chuyển vào bên trong tế bào trứng nhận của chúng tôi không đạt 100%

3.1.3 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến

hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Tỷ lệ phân chia, tạo phôi nang của tế bào trứng lợn sau cấy chuyển

nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ, trung bình tổng số tế bào/phôi nang là các chỉ tiêu được chúng tôi sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của việc đồng pha nguyên bào

sợi lợn Ỉ đến khả năng tạo phôi lợn Ỉ nhân bản Nguyên bào sợi lợn Ỉ không đồng pha được chúng tôi sử dụng như là nhóm đối chứng Kết quả thể hiện ở

bảng 3.3

Kết quả bảng 3.3 cho thấy sự sai khác về tỷ lệ phân chia của tế bào

trứng sau cấy chuyển nhân giữa nhóm được đồng pha và nhóm không đồng

pha là không có ý nghĩa thống kê (tương ứng 84,89% so với 80,32%; P >

0,05) Ngược lại, tỷ lệ tạo phôi nang của nhóm được đồng pha lại cao hơn có

ý nghĩa so với nhóm không được đồng pha (tương ứng 24,56% so với

16,42%, P < 0,05)

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ

đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

được cấy chuyển nhân thành công

Tế bào trứng phân chia

n, % (Mean ± SE)

Phôi nang

n, % (Mean ± SE)

Trung bình tổng số tế bào/phôi nang (Mean ± SE)

Được đồng pha

84,89 ± 2,24

76 24,56a ± 1,26 45,06

a

± 2,2 Không đồng pha

80,32 ± 2,19

82 16,42b ± 1,39 38,44

b ± 2,65

Ghi chú: Thí nghiệm được thực hiện 8 lần lặp lại Các giá trị trong cùng một cột có chữ

cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P < 0,05)

Hình 3.5 Phôi lợn Ỉ nhân bản không có màng sáng phân chia ở ngày thứ 2 sau

hoạt hóa

Các kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy việc đồng pha nguyên bào sợi trước khi cấy chuyển sẽ làm tăng tỷ lệ phôi nang nhân bản được tạo ra Trung bình tổng số tế bào/phôi nang là một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng phôi nang Điều này cũng phù hợp với nhận định của Tani và cs [32] Theo Tani và cs [32], việc sử dụng tế bào cho với nhân ở giai đoạn G0/G1 để tạo phôi nhân bản SCNT sẽ làm tăng số lượng phôi nang nhân bản được tạo ra so với tế bào cho có nhân ở giai đoạn không phải G0/G1

Chất lượng phôi trước khi sử dụng cho quá trình cấy chuyển phôi được đánh giá dựa vào quan sát hình thái và tổng số tế bào/phôi nang Trong nghiên cứu này, trung bình tổng số tế bào/phôi nang của nhóm đã được đồng pha cao hơn nhóm không đồng pha (tương ứng 45,06 so với 38,44; P < 0,05) Kết quả này cho thấy, việc sử dụng nguyên bào sợi lợn Ỉ được đồng pha cho quá trình cấy chuyển nhân tạo phôi nhân bản không chỉ làm gia tăng số lượng phôi nang nhân bản mà còn nâng cao chất lượng phôi nang được tạo ra