Tóm tắt luận Án tiếng việt nghiên cứu sự lưu hành và Đặc Điểm di truyền của virus gây bệnh marek trên gà Ở một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông cửu long

Để phòng bệnh Marek cần có những nghiên cứu về thực trạng bệnh, tính chất độc lực của virus gây bệnh cũng như sự lưu hành của virus trên các gia cầm nuôi là rất cần thiết.. CHƯƠNG 2 PHƯƠ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Mã ngành: 9640102

HUỲNH NGỌC TRANG

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM

DI TRUYỀN CỦA VIRUS GÂY BỆNH MAREK TRÊN GÀ Ở MỘT SỐ TỈNH THUỘC ĐỒNG

BẰNG SÔNG CỬU LONG

Cần Thơ, 2024

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn: PGS.TS Hồ Thị Việt Thu

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

Tạp chí quốc tế

1 Huynh Ngọc Trang, Nguyen Tran Phuoc Chien, Ho Thi Viet Thu

(2022) Prevalence of Marek’s disease virus in unvaccinated healthy backyard chickens in Cantho city, Vietnam and genetic

characterization of meq gene, Veterinary Integrative Sciences, 20

(3), 709-718

2 Huynh Ngoc Trang, Nguyen Le Hung Phong, Nguyen Tran Phuoc

Chien, Ho Thi Viet Thu (2024) The survey on the circulation of Marek’s disease virus in local chickens in Tra Vinh province,

Vietnam, Veterinary Integrative Sciences, 22(3), 823-830

2 Huỳnh Ngọc Trang, Nguyễn Trần Phước Chiến, Hồ Thị Việt Thu

(2023) Khảo sát bệnh Marek trên gà ở tỉnh An Giang và Tiền Giang

(2023) Tạp Chí Khoa học Kỹ Thuật Thú y, 30(6), 40-44.

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án

Bệnh Marek là bệnh truyền nhiễm gây khối u ác tính ở gà do Gallid

alphaherpesvirus 2 Virus gây bệnh Marek gây ức chế miễn dịch ở gà và

làm tăng tính mẫn cảm đối với mầm bệnh, nên gà dễ bị kế phát các bệnh

khác (Gimeno & Schat, 2018; Rozins et al., 2019) Bệnh Marek gây ra

những tổn thất cho chăn nuôi do gà bệnh giảm chuyển hóa thức ăn, giảm trọng lượng, giảm sản lượng trứng, tỷ lệ bệnh và chết cao (Payne &

Venugopal, 2000)

Trong tự nhiên, gà là ký chủ quan trọng của virus gây bệnh Marek

Gà nhiễm virus sẽ mang virus trong thời gian dài, từ đó làm tăng sự bài thải virus ra môi trường, tăng nguy cơ truyền ngang và tỷ lệ mắc bệnh Ngoài ra, những loài khác như chim cút, gà tây, gà gô, gà lôi đỏ và một

số loài vịt và ngỗng có thể bị nhiễm virus và phát bệnh (Schat & Nair, 2013)

Hiện nay, đã có vaccine phòng bệnh nhưng bệnh Marek vẫn thường xảy ra trên đàn gà đã tiêm vaccine và là mối đe dọa đối với ngành chăn nuôi gà do sự xuất hiện nhiều biến chủng của virus theo hướng gia tăng

độc (Dunn et al., 2019) Theo Lee et al (2008) gene meq là gene quan

trọng liên quan đến tính chất độc lực của virus gây bệnh Marek serotype

1 (MDV-1) Những đột biến điểm trên gene meq liên quan đến thay đổi độc lực của virus (Shamblin et al., 2004)

Trong những năm gần đây các đàn gà giống bản địa ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) mắc bệnh có triệu chứng nghi ngờ bệnh Marek, nhưng nghiên cứu về bệnh Marek còn hạn chế Đồng thời sự mang trùng virus gây bệnh Marek trên các loài vật nuôi khác như vịt và cút vẫn chưa được nghiên cứu Để phòng bệnh Marek cần có những nghiên cứu về thực trạng bệnh, tính chất độc lực của virus gây bệnh cũng như sự lưu hành của virus trên các gia cầm nuôi là rất cần thiết Từ thực tiễn trên, nghiên cứu này được thực hiện

1.4 Những đóng góp mới

Nghiên cứu đầu tiên ở ĐBSCL phát hiện vịt mang trùng MDV-1 Nghiên cứu đầu tiên ở ĐBSCL về bệnh Marek trên các giống gà bản địa một cách đầy đủ và hệ thống với đặc điểm dịch tễ, bệnh lý và di truyền.

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát sự lưu hành của MDV-1 trên gà giống bản địa, vịt và cút

Nội dung 2: Khảo sát tình hình bệnh Marek trên các đàn gà giống bản địa

Nội dung 3: Phân tích đặc điểm di truyền gene meq của MDV-1

Nội dung 4: Khảo sát đặc điểm bệnh lý bệnh Marek trên gà nhiễm

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Gà khỏe giống bản địa, các giống vịt Xiêm, vịt Cỏ và Siêu thịt, giống cút Nhật Bản được nuôi tại các địa phương của ĐBSCL

48 đàn gà giống bản địa của các trại, hộ chăn nuôi ở một số địa phương của ĐBSCL có triệu chứng nghi ngờ bệnh Marek

Chủng virus MDV/Ck/BT và MDV/Ck/VL từ các đàn gà bệnh trong thực địa

Gà Nòi lai 5 ngày tuổi Gene meq của MDV-1 trên gà khỏe, vịt khỏe

và gà bệnh

2.3 Phương tiện nghiên cứu

2.3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ 12/2020 - 10/2023

Địa điểm: mẫu nang lông gà, vịt, cút khỏe, bệnh phẩm gà bệnh được

thu thập tại các hộ, trại chăn nuôi ở một số địa phương của ĐBSCL Xét nghiệm mẫu bằng PCR và Nested PCR được thực hiện tại phòng thí nghiệm, nuôi gà thí nghiệm tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của Khoa Thú y, Trường Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ

Kiểm tra mẫu mô bệnh học được thực hiện tại Chi cục Thú y vùng

VI, TP Hồ Chí Minh Các mẫu giải trình tự được thực hiện tại Công ty Nam Khoa (TP Hồ Chí Minh)

2.3.2 Vật liệu, thiết bị và sinh phẩm dùng trong nghiên cứu

Vật liệu, thiết bị cần thiết cho lấy mẫu nang lông, mổ khám, thu mẫu bệnh phẩm, bảo quản mẫu, máy PCR, tủ an toàn sinh học, micropippet các loại

Kít ly trích DNA (TopPURE® Tissue viral extraction), sinh phẩm cần thiết cho PCR, Nested PCR

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát sự lưu hành của MDV-1 trên gà giống bản địa, vịt

và cút

2.4.1.1 Khảo sát sự lưu hành của MDV-1 trên gà giống bản địa

a Đối tượng nghiên cứu

Gà khỏe thuộc giống gà bản địa gồm Nòi lai, Tàu lai và Tre lai, tất cả

gà này đều chưa tiêm vaccine phòng bệnh Marek; có độ tuổi từ 1 tháng

và được nuôi tại các hộ chăn nuôi ở TP Cần Thơ, tỉnh Đồng Tháp và Trà Vinh

b Phương pháp thực hiện

Phương pháp điều tra: Nghiên cứu được thực hiện theo phương

pháp điều tra cắt ngang Trên các đàn gà được khảo sát sẽ thu thập thông tin về tổng đàn, giống, lứa tuổi, phương thức nuôi, tình trạng tiêm vaccine, tiêu độc sát trùng

Phương pháp lấy mẫu : Dung lượng mẫu được tính theo công thức

của Thrusfield (2007) Số lượng mẫu thu thập trên mỗi đàn sẽ được lấy mẫu theo công thức hiệu chỉnh Những đàn có số lượng từ 30 con trở lên

sẽ lấy mỗi đàn 7-8 con Trên mỗi gà khỏe thu lấy 5 mẫu nang lông cánh

và được gộp thành 1 mẫu (López-Osorio et al., 2019)

Công thức lấy mẫu khảo sát theo Thrusfield (2007)

Z2 (1 - p) p

n =

d2 Trong đó: n: số mẫu thu thập

Z: giá trị phân phối chuẩn ở độ tin cậy 95% (Z = 1,96)

d: sai khác không quá 5% (d = 0,05); p: tỷ lệ nhiễm ước đoán

Giá trị p dựa vào kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu và ctv

(2021), với p = 27,27%

Bảng 2.1: Số lượng mẫu thu thập trên gà khỏe

Địa phương Số đàn gà khảo sát Số lượng mẫu khảo sát (con)

Phương pháp xét nghiệm : Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định

gà nhiễm MDV-1 qua phát hiện gene meq từ mẫu nang lông gà Bộ kit

TopPURE® Tissue viral extraction được sử dụng để ly trích DNA của MDV-1 Trình tự cặp mồi, kích thước sản phẩm và chu trình nhiệt được

sử dụng phát hiện gene meq của MDV-1 dựa trên nghiên cứu của (López-Osorio et al., 2017)

c Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên gà

- Các yếu tố nguy cơ liên quan đến tình trạng mang trùng MDV-1 ở gà

2.4.1.2 Khảo sát sự lưu hành MDV-1 trên vịt và cút

a Đối tượng nghiên cứu

Vịt Xiêm, vịt Cỏ và vịt Siêu thịt, cút Nhật Bản có độ tuổi từ 1 tháng, được nuôi tại các hộ, trại ở TP Cần Thơ, tỉnh Đồng Tháp và Trà Vinh

b Phương pháp thực hiện

Phương pháp điều tra: Nghiên cứu được thục hiện theo phương

pháp điều tra cắt ngang Trên các đàn vịt, cút lấy mẫu được ghi lại thông tin tổng đàn, lứa tuổi, giống

Phương pháp lấy mẫu: Dung lượng mẫu khảo sát được ước tính

dựa vào công thức Thrusfield (2017) Tỷ lệ nhiễm trên vịt dựa trên khảo sát thăm dò 70 mẫu với tỷ lệ vịt mang trùng MDV-1 là 8,5% Trên đàn cút do có số lượng hạn chế nên chỉ lấy mẫu được 10 đàn Mỗi đàn vịt, cút được lấy mẫu 7 con Mỗi vịt hoặc cút cũng được thu lấy 5 nang lông

và gộp thành 1 mẫu

Bảng 2.2: Số lượng mẫu thu thập trên vịt và cút

Phương pháp xét nghiệm: Kỹ thuật Nested PCR được sử dụng

nhằm tăng độ nhạy phát hiện gene meq của MDV-1 từ nang lông vịt và

cút Trình tự cặp mồi, chu trình nhiệt cho PCR lần 1 và lần 2 dựa trên

nghiên cứu của Chang et al (2002)

c Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên vịt và cút

Loài Số đàn khảo sát Số lượng mẫu khảo sát (con)

2.4.2 Khảo sát tình hình bệnh Marek trên các đàn gà giống bản địa 2.4.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bốn mươi tám đàn gà giống bản địa ở các tỉnh Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Vĩnh Long, An Giang, Đồng Tháp và TP Cần Thơ có triệu chứng và bệnh tích của bệnh Marek

2.4.2.2 Phương pháp thực hiện

a Phương pháp điều tra

Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp điều tra cắt ngang Trên các đàn gà khảo sát được ghi nhận về tổng đàn, giống, số gà bệnh, chết, tiêm vaccine phòng bệnh Marek

b Phương pháp lấy mẫu

Việc lấy mẫu bệnh phẩm trên đàn gà bệnh được thực hiện theo Tiêu chuẩn quốc gia 8400-30 năm 2015 (TCVN 8400-30, 2015) Trên những

gà được chọn mổ khám sẽ ghi lại những triệu chứng, bệnh tích và thu lấy bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm thu thập gồm: gan, lách, phổi, thận, dạ dày tuyến

Bảng 2.3: Số lượng mẫu thu thập từ những đàn gà nghi ngờ bệnh Marek Địa phương Số đàn khảo sát Số lượng gà khảo sát (con)

Xét nghiệm PCR: Kỹ thuật PCR được thực hiện tương tự như xét

nghiệm mẫu nang lông Trên cùng cá thể xét nghiệm mẫu gộp Đàn gà được xác định bệnh Marek khi có ít nhất 1 gà cho kết quả PCR dương tính đồng thời có bệnh tích đại và vi thể đặc trưng của bệnh Marek

Kiểm tra mô bệnh học: Phương pháp thực hiện tiêu bản mô bệnh

học được thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2005 Mỗi đàn chọn bệnh phẩm của 1-2 con, mỗi con chỉ chọn 1 loại bệnh phẩm có bệnh tích đại thể nghi ngờ Tiêu bản mô bệnh học được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10X, 20X và 40X

Bảng 2.4: Số lượng mẫu nội tạng được thực hiện tiêu bản mô bệnh học

Loại mẫu Số lượng mẫu khảo sát (mẫu)

2.4.3 Khảo sát đặc điểm di truyền gene meq của MDV-1

2.4.3.1 Giải trình tự gene meq

Giải trình tự được thực hiện bằng phương pháp Sanger trên hệ thống ABI 3130 (Mỹ) và kiểm tra trình tự thu được bằng phần mềm BioEdit 7.0

Bảng 2.5: Các chủng trong nghiên cứu được chọn giải trình tự

18 MDV/Ck/TPCT/TL TP Cần Thơ Gà Nang lông

Phân tích độ tương đồng nucleotid, amino acid cũng như lập cây phả

hệ của các chủng MDV-1 được phát hiện ở các tỉnh ĐBSCL với các chủng tham chiếu bằng phần mềm Mega X Phương pháp tiếp cận cực đại (Maximum likelihood) với hệ số kiểm định tin tưởng bootstrap là

1000 lần lặp lại được sử dụng để phân tích cây phả hệ giữa các chủng đại diện lưu hành tại các địa phương với các chủng tham chiếu Các chủng tham chiếu được chọn dựa trên serotype1, tính chất độc lực, quốc gia và thời điểm phát hiện

2.4.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

Phân nhóm độc lực của các chủng virus trong nghiên cứu

Mối quan hệ di truyền giữa các chủng phát hiện và chủng tham chiếu

Tỷ lệ proline và số lượng motif PPPP của các chủng nghiên cứu

Số vị trí thay thế các amino acid trên protein Meq của các chủng nghiên cứu

2.4.4 Khảo sát đặc điểm bệnh lý bệnh Marek trên gà gây nhiễm 2.4.4.1 Đối tượng nghiên cứu

Gà Nòi lai 5 ngày tuổi được ấp nở từ nguồn trứng của đàn gà mẹ chưa tiêm vaccine phòng bệnh Marek và được xác định âm tính với

MDV-1 qua xét nghiệm gene meq từ mẫu nang lông bằng kỹ thuật PCR

2.4.4.2 Phương pháp gây nhiễm

Huyễn dịch virus dùng để gây nhiễm được tạo từ mẫu gan của đàn gà bệnh Mẫu bệnh phẩm được nghiền và pha với dung dịch PBS 0,9% tạo huyễn dịch 20,0% để tiêm truyền Huyễn dịch được xử lý vô khuẩn bằng kháng sinh (1000 UI penicillin và 1 mg streptomycin cho 1 ml huyễn dịch) trước khi tiêm truyền Trước khi gây nhiễm cho gà, huyễn dịch được gây nhiễm cho phôi để xác đinh liều gây chết 50,0% cho phôi

(ELD50%) Trong nghiên cứu này, mỗi gà được gây nhiễm bằng 2,5ELD50

Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm gây nhiễm cho gà 5 ngày tuổi

Chủng gây

nhiễm Đường cấp virus

Liều gây nhiễm (ELD50)

Số lượng gà gây nhiễm Tổng Trống Mái

MDV/Ck/BT Tiêm bắp 2,5ELD50 6 9 15 MDV/Ck/VL Tiêm bắp 2,5ELD50 8 7 15

2.4.4.3 Theo dõi gà thí nghiệm, thu mẫu và xét nghiệm

Các triệu chứng của gà thí nghiệm được theo dõi và ghi nhận đến 60 ngày sau gây nhiễm Tất cả gà thí nghiệm được thu mẫu nang lông sau 2 ngày gây nhiễm và lặp lại 2 ngày/lần cho đến thời điểm tất cả gà đều dương tính với MDV-1 qua kiểm tra nang lông Tại mỗi thời, 2 mẫu nang lông được thu thập từ mỗi gà thí nghiệm

Những gà chết trong thời gian thí nghiệm và những gà còn sống tại thòi điểm kết thúc thí nghiệm được mổ khám quan sát bệnh tích và lấy mẫu nội tạng (gan, lách, thận và dạ dày tuyến) Riêng những gà chết đầu tiên được thu thêm mẫu nang lông để đánh giá thời gian tồn tại của virus

ở nang lông

Các mẫu nang lông cũng như mẫu bệnh phẩm được sử dụng mẫu gộp cho xét nghiệm bằng PCR để xác định sự hiện diện của MDV-1 qua

kiểm tra gene meq

2.4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ gà bệnh và tỷ lệ gà chết

Tỷ lệ gà có MDV-1 hiện diện ở nang lông theo thời gian

Tần suất xuất hiện các triệu chứng và bệnh tích bệnh Marek trên gà thí nghiệm

2.5 Xử lý số liệu

Các số liệu thô được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 Phép thử Chi square của phần mềm Minitab version 16 và Yates của phần mềm Microsoft Execel được sử dụng để so sánh các giá trị tỷ lệ Phần mềm Mega X được sử dụng để phân tích cây phả hệ giữa các chủng trong nghiên cứu với các chủng tham chiếu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát sự lưu hành MDV-1 trên gà giống bản địa, vịt và cút

3.1.1 Kết quả khảo sát sự lưu hành MDV-1 trên gà giống bản địa

Bảng 3.1: Tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên gà theo địa phương khảo sát Địa phương Số mẫu khảo sát (con) Số mẫu dương (con) Tỷ lệ (%)

TP Cần Thơ 353 26 7,37b Đồng Tháp 352 46 13,07aTrà Vinh 343 45 13,12a

a, b: Các số trong cùng một cột có chữ mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê với P≤ 0,05

Kết quả Bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên gà khảo sát

ở tỉnh Trà Vinh và Đồng Tháp cao hơn so với đàn gà ở TP Cần Thơ với khác biệt có ý nghĩa thống kê, P=0,021 Sự sai khác về tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên gà giữa các địa phương có thể do khác nhau về giống gà nên có đặc điểm di truyền khác nhau Theo Bumstead & Kaufman (2004) yếu tố di truyền của gà cũng có liên quan đến tính đề kháng hay mẫn cảm đối với sự cảm nhiễm virus gây bệnh Marek

Bảng 3.2: Tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên gà theo giống

Giống Số mẫu khảo sát (con) Số mẫu dương (con) Tỷ lệ (%)

Nòi lai 929 99 10,66b Tre lai 28 10 35,71a Tổng 1.048 117 11,16

a, b: Các số trong cùng một cột có chữ mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê với P≤ 0,05

Tỷ lệ mang trùng MDV-1 trên gà Tre lai (35,71%) cao hơn so với gà Tàu lai (8,79%) và Nòi lai (10,66%) và sự khác biệt này có ý nghĩa

thống kê với P=0,001 Bacon et al (2001) đã đưa ra nhận định các

giống gà có đặc điểm di truyền khác nhau có tính mẫn cảm hay đề kháng đối với MDV cũng khác nhau Nghiên cứu của Hartawan & Dharmayanti (2016) về tình hình nhiễm MDV-1 trên gà ở Indonesia qua