đề tài nuôi cấy và phân lập vi khuẩn salmonella

Một số lòai Salmonella không có khả năng sinh H2S như Salmonella Paratyphi A phát triển trên môi trường XLD có màu hồng với tâm hồng đậm, Salmonella có lactose dương tính phát triển trên

NHÓM 2

BÁO CÁO Chuyên đề:

NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP

VI KHUẨN SALMONELLA

Hình ảnh vi khuẩn Salmonella

1 Đặc điểm vi khuẩn

Giống Salmonella có khoảng 2300 serotype và thuộc họ Enterobacteriacaea Salmonella spp có những đặc điểm sau: Gram âm, hình que, kỵ khí tùy nghi, với đường kính khoảng 0,7-1,5 micromet, dài 2-5 micromet, và roi mà cấp theo mọi hướng Di động bằng tiên mao nhưng những dạng đột biến có thể không di động và có một serotype (Gallinarum) là không di động

1 Đặc điểm vi khuẩn

Giống Salmonella được chia thành nhiều serotype theo xếp loại của Kauffmann-White, dựa theo kháng nguyên thân (somatic) O và kháng nguyên H (flagella) Một số serotype như Enteritidis, Typhi, Paratyphi và Typhimurium được xếp loại theo phage

2 Đặc tính sinh lý

- Kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá huỷ bởi quá trình tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur & đun nấu kỹ

- Tuy nhiên Samonella có thể sống sót trong thời gian dài ở các thực phẩm khô & ướp lạnh, do đó khi làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này

- Sức đề kháng yếu: sống sót kém ở pH < 5, và chết ở 60OC trong vòng 20 phút, 700C trong 2

phút và 850C trong 1 giây, dưới ánh sáng 5h

chết Sự đóng băng có thể làm giảm số lượng vi khuẩn nhưng Salmonella có thể còn tồn tại trong thời gian rất dài ở các thực phẩm đã đóng băng như thịt, cá

- Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối, nồng độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở nồng độ 6-8% vi khuẩn phát triển chậm, ở nồng độ 8-19% vi khuẩn ngừng phát triển.

9

Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối, nồng độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở nồng độ 6-8% vi khuẩn phát triển chậm, ở nồng độ 8-19% vi khuẩn ngừng phát triển.

3 Đặc tính sinh hóa

Salmonella có tính ưa ngọt với đường

glucoce

MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

– Buffered peptone water – BPW

– Rappaport-Vassiliadis soy peptone broth –

RV Tryptic soy agar

– TSA

– Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar

– Brilliant green phenol red lactose sucrose

agar – BLPS

- Triple sugar iron agar – TSI

- Urea broth

- Lysine decarboxylase broth

- BOrnithine decarboxylase broth

3 Đặc tính sinh hóa

Bảng một số đặc tính sinh hóa của Salmonella

4 Phương pháp phân lập

Giai đoạn phân lập này được thực hiện đồng thời trên hai môi trường thạch XLD (Xylose lysine desoxycholate agar) và BPLS (Brilliant green phenol red lactose sucrose agar) Sau khi ủ 24 + 3, dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ ống RV, cấy ria sang hai môi trường thạch XLD và BPLS Lật ngược các đĩa và ủ

4 Phương pháp phân lập

Trên môi trường XLD: Khuẩn lạc Salmonella

spp điển hình có vùng trong, hơi nhuốm đỏ do chất chỉ thị màu thay đổi trong môi trường, và

có tâm đen

Trên môi trường BPLS: Khuẩn lạc Salmonella

spp điển hình hơi trong có màu hơi đỏ trong môi trường

4 Phương pháp phân lập

Chú ý Một số lòai Salmonella không có khả năng sinh H2S như Salmonella Paratyphi A phát triển trên môi trường XLD có màu hồng với tâm hồng đậm, Salmonella có lactose dương tính phát triển trên môi trường XLD có màu vàng có tâm đen hoặc không đen

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA

5.1 Triple sugar iron agar (TSI agar)

a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ sinh khối trên NA, cấy ria trên mặt nghiêng ống thạch TSI Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy) Ủ các ống trong tủ ủ 37,0 ± 10C /24 + 3 giờ

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

b) Kết quả: Sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ

ủ được mô tả như sau

Đáy ống

Vàng … ……… Glucose dương tính

Đỏ ………… Glucose âm tính

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

Mặt nghiêng

Vàng ……… Lactose hoặc Sucrose dương tính

Đỏ ………… Lactose và Sucrose âm tính

Ống TSI cấy Salmonella điển hình có mặt nghiêng kiềm (màu đỏ), đáy ống acid (vàng), có khí và 90% có màu đen(H2S được hình thành)

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

Chú ý 1 Khi đọc kết quả ống TSI, không được đọc sớm (ví dụ sau 12 giờ ủ) do sẽ cho kết quả dương tính giả hoặc đường lên men nhưng chưa đủ lượng acid để thay đổi chất chỉ thị pH (phenol red) Nếu đọc sau 24 giờ sẽ cho kết quả đỏ/ đỏ sai do vi khuẩn sử dụng peptone làm môi

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

Chú ý 2 Một vi khuẩn sinh H2S có thể tạo ra nhiều kết tủa đen (FeS) che khuất màu vàng ở đáy ống Tuy nhiên, nếu đáy ống không có màu vàng dù là không thể quan sát được và nên ghi nhận kết quả như thế

1.00C /24 + 3 giờ Nếu phản ứng dương tính, sự phân cắt ure giải phóng NH làm thay đổi màu

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

b) Kết quả: Dương tính khi màu đỏ hồng khắp

cả ống (Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Providencia rettgeri). Âm tính khi môi trường không đổi màu

Chú ý 1 Tiến hành thử nghiệm song song với mẫu đối chứng âm (không có ure) để loại trừ trường hợp NH3 do thủy phân protein mà ra

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

5.3 Lysin decarboxylation và Ornithin

5.3 Lysin decarboxylation và Ornithin

decarboxylase

a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ sinh khối trên TSA ống nghiệm chứa khoảng 5 ml môi trường Lysin decarboxylation

và ống nghiệm chứa khoảng 5 môi trường Ornithine decarboxylation Sau khi cấy, phủ lên trên một lớp mỏng dầu khóang Ủ các ống trong tủ ủ 37.0 ± 1.00C /24 + 3 giờ 25

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

b) Kết quả: Dương tính khi môi trường có màu tím, đục Âm tính khi môi trường có màu vàng Chú ý 1 Kết quả có thể cho thấy hai lớp màu khác nhau trong ống nghiệm: tía & vàng Nên

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

Chú ý 2 Thường thì khó đọc thử nghiệm Decarboxylase dương tính do sự hiện diện màu tía-vàng nhạt không rõ ràng Nếu điều này xảy

ra, nên só sánh với ống không cấy mẫu Bất kỳ

có vết màu tía nào thì kết quả được xem là dương tính nếu được ủ ít nhất là 24 giờ

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

5.6 Thử nghiệm sử dụng đường

a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối

từ môi trường TSA sau khi ủ, cấy lần lượt sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Mannitol Ủ các ống trong tủ ủ ở 37.0±

1.00C/24 – 48 giờ

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

b) Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng Âm tính khi dung dịch đường không đổi màu (màu đỏ)

Chú ý Thông thường phản ứng dương tính xảy ra trong khoảng 24 – 48 giờ Nếu có thể ủ tiếp cho đến 5 ngày

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

b) Kết quả: nếu có những hạt ngưng kết thì ngừng phản ứng, nếu huyền dịch vẫn đục đều thì tiến hành thực hiện phản ứng kháng huyết

thanh với kháng nguyên O và H

b)Kết quả: Phản ứng dương tính khi xuất hiện những hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính khi huyền dịch vẩn đục

5 Thử nghiệm và cách

nhận biết

5.9 Thử ngưng kết kháng nguyên Ha) Thực hiện: sử dụng khuẩn lạc thuần không

có khả năng tự ngưng kết cấy vào môi trường thạch mềm TSA ủ 37.0 ± 10C /24 + 3 giờ Sau khi ủ lấy sinh khối trên thạch mềm tiếp tục qui trình giống như thử nghiệm tự ngưng kết, thay

LƯU Ý

Không thể kết luận dương tính hoặc âm tính

Salmonella spp trong mẫu thử khi chỉ dựa vào hoặc thử nghiệm sinh hóa hoặc thử nghiệm huyết thanh kháng Do:

a) Thử nghiệm sinh hóa không thể phát hiện tất

cả các serotype, ngoài ra các dòng Salmonella

LƯU Ý

Nếu phản ứng ngưng kết kháng nguyên O là dương tính, khi đó chưa thể kết luận là

Salmonella spp được vì có một số loài khác

(E.coli, Citrobacter, Shigella và Enterobacter)

hoặc có cùng chung một số kháng nguyên O hoặc cũng có những kháng nguyên tương tự với kháng nguyên của Salmonella spp

LƯU Ý

Nếu phản ứng ngưng kết kháng nguyên O là

dương tính, khi đó chưa thể kết luận là

Salmonella spp được vì có một số loài khác

(E.coli, Citrobacter, Shigella và Enterobacter)

hoặc có cùng chung một số kháng nguyên O hoặc cũng có những kháng nguyên tương tự với

kháng nguyên của Salmonella spp

LƯU Ý

Do đó, để kết luận mẫu dương tính hoặc âm tính

Salmonella spp., cần phải kết hợp kết quả của hai thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh kháng để kết quả đạt được là cao nhất, chính xác nhất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Định tính Salmonella trong thực phẩm theo NMKL 71:1999;

2 Vi sinh vật–Ths Đoàn Thị Nguyện;

3 Thí nghiệm Vi sinh vật họ c – Nguyễn Đức Lượng;4.Công nghệ Vi sinh vật (Tậ p 1,2) – Nguyễn Đức Lượng;