Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa của một số dẫn chất hydroxyauron

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa của một số dẫn chất hydroxyauron

ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu gồm 6 dẫn chất auron mang nhóm hydroxy trên vòng A (Hình 2.22) và hoạt tính sinh học của chúng

Hình 2.22 Cấu trúc 6 dẫn chất auron Tên khoa học của các dẫn chất auron được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1.Ký hiệu và tên khoa học của các dẫn chất auron

Ký hiệu Tên khoa học

TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT DUNG MÔI

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong tổng hợp

STT Tên thiết bị Nhà cung cấp Xuất xứ

1 Cân kỹ thuật GS622N Shinko Việt Nam

2 Cân phân tích Sartorius Đức

4 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA C-MAG

5 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 600 MHz Mỹ

Bảng 2.3 Dung môi hóa chất dùng trong tổng hợp STT Hóa chất và dung môi Xuất xứ Tiêu chuẩn

1 Phloroglucinol Trung Quốc Tổng hợp

2 Kẽm chlorid Trung Quốc Tổng hợp

3 Natri chlorid Trung Quốc Tổng hợp

4 Acid sulfuric 98% Trung Quốc Tổng hợp

5 Cloroacetonitril 98% Trung Quốc Tổng hợp

6 Resorcinol Trung Quốc Tổng hợp

7 Diethyl ether Việt Nam Phân tích

8 Acid hydroclorid 36,5% Trung Quốc Tổng hợp

9 Natri methoxid Trung Quốc Tổng hợp

10 Methanol Trung Quốc Phân tích

11 Kali hydroxyd Trung Quốc Tổng hợp

12 Ethanol Việt Nam Phân tích

13 Aceton Trung Quốc Phân tích

15 Ethyl acetat Trung Quốc Phân tích

16 2-thiophencarboxaldehyd Trung Quốc Tổng hợp

17 3-pyridincarboxaldehyd Trung Quốc Tổng hợp

18 4-pyridincarboxaldehyd Trung Quốc Tổng hợp

19 2,5-dimethoxybenzaldehyd Trung Quốc Tổng hợp

20 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd Trung Quốc Tổng hợp

21 3,4-dimethoxybenzaldehyd Trung Quốc Tổng hợp

22 Dimethyl sulfoxid Trung Quốc Phân tích

2.2.2 Dùng trong thử hoạt tính

Hóa chất: dimethyl sulfoxid (DMSO) mua từ công ty Merck

Vi sinh vật thử nghiệm:

- Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300

Dụng cụ và trang thiết bị

- Ống nghiệm, pipette, micropipette, eppendorf, microwave, que cấy, que bông, đèn cồn, bông gòn

- Bể ổn nhiệt, tủ sấy, tủ ấm

- Máy đo quang Gene Quant 1300

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tổng hợp dẫn chất hydroxyauron

Các dẫn chất hydroxyauron với nhóm thế khác nhau trên vòng B được tổng hợp qua

- Tổng hợp vòng 6-hydroxybenzofuran-3(2H)-on hay 4,6-dihydroxybenzofuran- 3(2H)-on

- Tổng hợp dẫn chất auron thế

Hình 2.23 Quy trình tổng hợp dẫn chất auron 2.3.1.1 Phương pháp tổng hợp sản phẩm trung gian

Phản ứng đi từ nguyên liệu đầu là resorcinol 1a và phloroglucinol 2a để thu được sản phẩm trung gian lần lượt là 6-hydroxybenzofuran-3(2H)-on 1c và 4,6- dihydroxybenzofuran-3(2H)-on 2c (Hình 2.24)

Hình 2.24 Quy trình tổng hợp chất trung gian Quá trình tổng hợp bắt đầu từ phản ứng Houben – Hoesch giữa resorcinol 1a hoặc phloroglucinol 2a với cloroacetonitril, HCl khí hoạt hoá bởi ZnCl2 khan trong ether ở nhiệt độ 0–5 ℃ để thu được muối iminium Tiếp theo là quá trình thủy phân muối iminium trong HCl 1M để thu được ceton 1b hoặc 2b Phản ứng đóng vòng tạo 1c hoặc 2c được diễn ra trong môi trường kiềm với tác chất là natri methoxid, thu được sản phẩn trung gian cuối cùng là dẫn chất hydroxy của benzofuran-3(2H)-on.20,46,76,77

Sản phẩm được tinh chế bằng cách kết tinh lại trong nước

2.3.1.2 Phương pháp tổng hợp auron

Các auron được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ Claisen–Schmidt giữa 1c và 2c với lần lượt các aldehyd trong môi trường kiềm và dung môi là hỗn hợp cồn-nước Sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại hoặc sắc ký cột

Hình 2.25 Quy trình tổng hợp auron 2.3.2 Phương pháp xác định độ tinh khiết và cấu trúc

2.3.2.1 Phương pháp xác định độ tinh khiết

Các chất tổng hợp được xác định độ tinh khiết bằng các phương pháp sau:

- Cảm quan và tính chất vật lý: trạng thái vật lý, màu sắc, độ tan trong các dung môi khác nhau

- Nhiệt độ nóng chảy: các chất hữu cơ rắn tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy xác định

- Sắc ký lớp mỏng: mẫu được triển khai trên bản mỏng silicagel GF254 với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau

2.3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định bằng các phương pháp sau:

- Phổ hồng ngoại (IR): căn cứ vào cấu trúc dự kiến của một chất, xác định các đỉnh hấp thụ tương ứng với kiểu dao động của nhóm chức

- Khối phổ (MS): trên phổ khối xuất hiện đỉnh có m/z tương ứng với các phân mảnh của cấu trúc dự kiến

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): dựa vào độ dịch chuyển hóa học, diện tích các đỉnh và sự chẻ định của các tín hiệu để xác định các proton trên cấu trúc chất dự kiến 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm

2.3.3.1 Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm

Sử dụng phương pháp khuếch tán trong thạch

- Môi trường tăng sinh: TSA (Tryptic soy agar) đối với vi khuẩn, SDA (Sabouraud dextrose agar) đối với vi nấm

- Môi trường thử nghiệm kháng sinh: Thạch Mueller-Hinton (MHA) đối với vi khuẩn, MHA + 2% Glucose đối với vi nấm

Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ thử nghiệm 10,24 mg/mL

- Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ℃ trong 16 – 24 giờ

- Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường lỏng

- Ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 ℃ để hoạt hóa

- Chỉnh độ đục bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5, là khoảng 1,5 x 10 8 CFU/mL

- Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

- Cấy ria nấm thử nghiệm trên môi trường thạch SDA, ủ ở 30 ℃ trong 48 – 72 giờ

- Chỉnh độ đục nấm bằng nước muối sinh lý, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5 là khoảng 1-5 x 10 6 CFU/mL

- Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

- Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, nấm đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Lập lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60 o

- Để hộp mở nắp trong tủ cấy 3 - 5 phút cho ráo mặt

- Đục lỗ đường kính 8 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng

- Chất thử được nhỏ vào trong lỗ lượng 50 μl

- Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

- Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35 – 37 ℃ trong 16 - 24 giờ đối với vi khuẩn, ở 30 ℃ trong

48 giờ đối với nấm Đọc kết quả

Lỗ chứng âm DMSO không ức chế sự phát triển của vi khuẩn, vi nấm

Chất thử có khả năng kháng nấm khi xung quang lỗ có vòng kháng khuẩn, kháng nấm

2.3.3.2 Xác định MIC của chất thử nghiệm

Phương pháp pha loãng hay phương pháp pha loãng bán định lượng (Semi – quantitative dilution test)

Những thử nghiệm này nói chung được gọi là thử nghiệm MIC Kết quả được thể hiện bằng nồng độ chất thử tối thiểu có khả năng ức chế sự mọc của vi khuẩn, vi nấm Môi trường

- Môi trường được phân chia vào các ống nghiệm với một thể tích chính xác, để đảm bảo các đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng ở 121 ℃, 15 phút

- Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO đạt nồng độ 40,96 mg/mL Khi sử dụng pha loãng bằng môi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với môi trường thử nghiệm sao cho tạo thành giai nồng độ trong môi trường thử nghiệm như sau: 1024, 512, 256, 128, 64 g/mL Khi pha chất thử vào môi trường phải đảm bảo nồng độ DMSO nằm trong khoảng từ 2 – 5% nhằm tránh việc nồng độ DMSO cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm thử nghiệm

- Cho chất thử vào môi trường đã để nguội về 45 – 50 ℃, lắc đều để đạt được nồng độ cuối cần thử nghiệm

- Đổ vào đĩa, độ dày thạch khoảng 3 – 4 mm

- Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ℃ trong 16 – 24 giờ

- Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ huyền phù trong nước muối sinh lý

- Chỉnh độ đục vi khuẩn sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5, là khoảng 1,5  10 8 CFU/mL

- Pha loãng dịch vi khuẩn 10 lần để đạt mật độ khoảng 10 7 CFU/mL

- Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

- Cấy ria nấm thử nghiệm trên môi trường thạch SDA, ủ ở 30 ℃ trong 48 – 72 giờ

- Chỉnh độ đục nấm bằng nước muối sinh lý, sao cho mật độ thu được tương đương với McFarland 0,5 là khoảng 1–5  10 6 CFU/mL

- Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

- Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử

- Cho 1 – 2 μl huyền phù dịch vi khuẩn, nấm lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn, nấm trên thạch là 10 4 CFU/mL

- Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô

- Ủ trong tủ ấm 35 – 37 ℃ trong 16 – 24 giờ đối với vi khuẩn, ở 30 ℃ trong 48 giờ đối với nấm Đọc kết quả

- Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn, nấm trong đĩa chứng mọc bình thường

- Đặt đĩa thạch trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự tạo thành khóm của vi khuẩn, nấm thử nghiệm Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này làm MIC của chất thử đối với vi khuẩn, nấm thử nghiệm

- Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại không được tính

- Nếu có vi khuẩn, nấm mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể đã bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa

Hoạt tính chống oxi hoá được xác định bằng khả năng bắt gốc tự do DPPH dựa trên phương pháp của HamLaoui và cộng sự (2018) và có một số sửa đổi 92 160 L dung dịch gốc tự do DPPH 0,15 mM trong dung môi ethanol được trộn với 40 L auron được pha trong DMSO ở các nồng độ khác nhau trong đĩa 96 giếng Ủ đĩa 96 giếng

30 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng Sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng 517 nm Tiến hành song song mẫu chứng âm, mẫu thử và mẫu trắng

Mẫu DMSO (L) DPPH 0,15 mM (L) Auron (àL)

Mỗi mẫu thử được thực hiện 3 lần Dùng acid ascorbic chuẩn làm mẫu chứng dương Phần trăm gốc tự do được đánh bắt (I%) được tính theo công thức:

Trong đó: A1, A2 và A3 lần lượt là độ hấp thu của mẫu chứng âm, mẫu thử và mẫu trắng tại bước sóng 517 nm

Xây dựng đường hồi quy tuyến tính bằng phần mềm Graphpad Prism 9 thể hiện mối tương quan giữa log nồng độ chất khảo sát (mg/mL) và phần trăm DPPH được đánh bắt: I% = aC + b

Từ đó tính được IC50 (nồng độ của chất thử mà tại đó 50% gốc tự do DPPH ban đầu được đánh bắt) của các auron khảo sát

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

KẾT QUẢ TỔNG HỢP DẪN CHẤT HYDROXYAURON

Trong bình cầu 3 cổ 250 mL, lần lượt cho vào diethyl ether (100 mL), resorcinol (4,37 g; 39,7 mmol) và ZnCl2 khan (0,54 g; 3,96 mmol) Bình phản ứng sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ 0 – 5 ℃ và tiếp tục cho cloroacetonitril (2,5 mL; 39,7 mmol) vào Tiến hành sục HCl khí vào bình phản ứng trong 45 phút (HCl khí được tạo ra từ phản ứng giữa 20 g natri clorid và 30 mL acid sulfuric 98%) Phản ứng sau đó được khuấy và làm lạnh trong 4 giờ sau đó để ở nhiệt độ phòng trong vòng 21 giờ Sau thời gian phản ứng, xuất hiện tủa Tiến hành lọc và rửa tủa 3 lần với diethyl ether

Tủa thu được được cho vào bình cầu chứa sẵn 10 mL HCl 1M, đun hồi lưu ở nhiệt độ từ 60 – 70 ℃ trong vòng 45 phút đồng hồ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là toluen:aceton (4:1) Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được làm lạnh và lọc áp suất giảm thu tủa, rửa tủa với nước cất lạnh thu được 1b

1b (0,52 g; 2,8 mmol) và natri methoxyd (0,55 g; 10,2 mmol) được thêm lần lượt vào bình cầu đấy tròn 50 mL Thêm vào bình phản ứng 30 mL methanol và tiến hành gia nhiệt (không quá 50 ℃) trong 15 phút Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là toluen:aceton (4:1) Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được đưa về nhiệt độ thường, pha loãng với nước và trung hòa bằng HCl 10% Bình phản ứng được làm lạnh Kết tủa được lọc áp suất giảm thu được 1c

Hiệu suất qua 2 bước: 5,8% (0,35 g) Bột mịn màu trắng nâu, tan nhiều trong nước nóng, ethanol, aceton, ít tan trong cloroform, nước lạnh

Sắc ký lớp mỏng: Rf = 0,45 Hệ dung môi toluen:aceton (4:1)

Trong bình cầu 3 cổ 250 mL, lần lượt cho vào diethyl ether (100 mL), phloroglucinol

(5 g; 39,7 mmol) và ZnCl2 khan (0,54 g; 3,96 mmol) Bình phản ứng sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ 0 – 5 ℃ và tiếp tục cho cloroacetonitril (2,5 mL; 39,7 mmol) vào Tiến hành sục HCl khí vào bình phản ứng trong vòng 20 phút (HCl khí được tạo ra từ phản ứng giữa 10 g natri clorid và 15 mL acid sulfuric 98%) Phản ứng được khuấy và làm lạnh trong 2 giờ sau đó để ở nhiệt độ phòng trong vòng 21 giờ Sau thời gian phản ứng, trong bình xuất hiện tủa Tiến hành lọc và rửa tủa 3 lần với diethyl ether

Tủa thu được (9,8 g) được cho vào bình cầu chứa sẵn 100 mL HCl 1M, đun hồi lưu ở nhiệt độ từ 60 – 70 ℃ trong vòng 45 phút đồng hồ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là cloroform:methanol (10:1) Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được làm lạnh và lọc áp suất giảm thu tủa, rửa tủa với nước cất lạnh thu được hỗn hợp 2b và 2c

Hỗn hợp 2b, 2c (4,18 g) và natri methoxid (4 g; 0,07 mol) được thêm lần lượt vào bình cầu đấy tròn 50 mL Thêm vào bình phản ứng 30 mL methanol và tiến hành gia nhiệt (không quá 50 ℃) trong 15 phút Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là cloroform:methanol (10:1) Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được đưa về nhiệt độ phòng, pha loãng với nước và trung hòa bằng HCl 10% Bình phản ứng được làm lạnh Kết tủa được lọc áp suất giảm thu được 2c

Hiệu suất qua 2 bước: 31,87% (2,10 g) Bột tinh thể màu trắng cam, tan nhiều trong nước nóng, ethanol, aceton, ít tan trong cloroform, nước lạnh

Sắc ký lớp mỏng: Rf = 0,6 Hệ dung môi: cloroform:methanol (10:1)

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất hydroxyauron

Các dẫn chất hydroxyauron có nhóm thế khác nhau trên vòng B được tổng hợp theo quy trình chung như sau:

Dẫn chất c (1,0 mmol) được hòa tan trong 8 mL EtOH 50%, KOH (8 mmol) được hòa tan trong lượng nước tối thiểu và thêm vào bình phản ứng Khuấy đến khi c tan hòa toàn thì cho dẫn chất aldehyd (1,1 mmol) vào Tùy theo dẫn chất aldehyd mà phản ứng được tiếp tục theo những cách khác nhau

Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ thường và để qua đêm Dung dịch sau phản ứng được làm lạnh và pha loãng với nước, acid hóa bằng acid hydroclorid 10% (pH 2–3) Tủa hình thành được lọc và rửa với nước cất, sấy khô Sản phẩm được kết tinh lại trong hỗn hợp cồn-nước

Hiệu suất: 64,01% (0,210 g) Tinh thể màu vàng, không tan trong nước, tan trong cồn, DMSO, ít tan trong cloroform Nhiệt độ nóng chảy 251–252 ℃

Sắc ký lớp mỏng Rf: toluen:aceton (4:1) hexan:ethyl acetat (2:1) cloroform:ethyl acetat (3:1)

Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) (ppm): 11,17 (s, 1H, 6-OH), 7,62 (d, J = 8,4

Hz, 1H, H4), 7,32 (s, 2H, H2’ và H6’), 6,83 (d, J = 2 Hz, 1H, H7), 6,76 (s, 1H,=CH- ), 6,73 (dd, J = 8,4 và 2,0 Hz, 1H, H5), 3,86 (s, 6H, 3’,5’-OCH3), 3,74 (s, 3H, 4’- OCH3) (Phụ lục 1)

Phổ MS: đỉnh [M-H] - xuất hiện tại m/z = 327,30 phù hợp với dự kiến [C18H15O6] - là 327,09 (Phụ lục 7)

Phổ IR ν (cm -1 ): 3118,9 (ν=C-H), 1577,77 (νC=O) (Phục lục 7)

Hiệu suất: 89,57% (0,267 g) Bột màu vàng, không tan trong nước, tan trong cồn, DMSO, ít tan trong cloroform Nhiệt độ nóng chảy 293-295 ℃

Sắc ký lớp mỏng: toluen:aceton (4:1) hexan:ethyl acetat (4:1) cloroform:ethyl acetat (3:1)

= 9,0 và 2,8 Hz, 1H, H4’), 7,01 (s, 1H, =CH-), 6,81 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H7), 6,72 (dd, J = 8,4 và 2,0 Hz, 1H, H5), 3,84 (s, 3H, 2’-OCH3), 3,79 (s, 3H, 5’-OCH3) (Phụ lục 2)

Phổ IR ν (cm -1 ): 3057,17 (ν =C-H ), 1602,85 (ν C=O ) (Phục lục 8)

Hiệu suất: 72,46% (0,216 g) Bột màu vàng, không tan trong nước, tan trong cồn, DMSO, ít tan trong cloroform Nhiệt độ nóng chảy 220-221 ℃

Sắc ký lớp mỏng: toluen:aceton (3:1) hexan:ethyl acetat (2:1) cloroform:ethyl acetat (3:1)

Hz, 1H, H4), 7,57 (m, 2H, H2’ và H6’), 7,09 (d, J =8,3 Hz, 1H, H5’), 6,80 (d, J 2,0 Hz, H7), 6,77 (s, 1H, =CH-), 6,72 (dd, J = 8,4 và 2,0 Hz, 1H, H5), 3,834 (s, 3H, 3’-OCH3), 3,828 (s, 3H, 4’-OCH3) (Phụ lục 3)

Phổ IR ν (cm -1 ): 3253,91 (νOH), 1579,70 (νC=O) (Phục lục 9)

(Z)-4,6-dihydroxy-2-(pyridin-4-ylmethylen)benzofuran-3(2H)-on (2d-1)

Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt Sau đó phản ứng được làm lạnh và trung hòa bằng

NH4Cl, kết tủa được lọc và kết tinh lại trong cồn

Hiệu suất: 52,86% (0,135 g) Bột màu cam, không tan trong nước, tan trong cồn, DMSO, ít tan trong cloroform Phẩn hủy ở 258 ℃ trước khi nóng chảy

Sắc ký lớp mỏng: toluen:aceton (1:2) clorform:methanol (5:1) hexan:ethyl acetat (1:3)

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) (ppm): 11,08 (s, 2H, 4,6-OH), 8,63 (d, J = 6,0

Hz, 2H, H3’ và H5’), 7,78 (d, J = 6,1 Hz, 2H, H2’ và H6’), 6,57 (s, 1H, =CH-), 6,24 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H7), 6,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H5) (Phụ lục 4)

Phổ MS: đỉnh [M-H] - xuất hiện tại m/z = 254,00 phù hợp với dự kiến [C14H8NO4] - là 254,05 (Phụ lục 10)

Phổ IR ν (cm -1 ): 3392,79 (ν OH ) ,3034,03 (ν =C-H ), 1600,92 (ν C=O ) (Phục lục 10) (Z)-4,6-dihydroxy-2-(pyridin-3-ylmethylen)benzofuran-3(2H)-on (2d-2)

Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt Sau đó phản ứng được làm lạnh và trung hòa bằng lượng HCl tương đương với lượng KOH đã cho vào (đã được chuẩn độ thể tích trước đó với chỉ thị là đỏ phenol) Kết tủa được lọc, kết tinh lại trong cồn và tiến hành sắc ký cột với dung môi là cloroform:methanol

Hiệu suất thấp Bột màu vàng, không tan trong nước, tan trong cồn, DMSO, ít tan trong cloroform Phân hủy ở 264 ℃ trước khi nóng chảy

Sắc ký lớp mỏng: cloroform:methanol (5:1) toluen:aceton (1:2) hexan:ethyl acetat (1:3)

Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) (ppm): 11,14 (s, 1H, 4-OH), 11,10 (s, 1H, 6- OH), 9,11 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H2’), 8,68 (dd, J = 5,1 và 1,6 Hz, 1H, H4’), 8,58 (dt, J

= 8,1 và 1,9 Hz, 1H, H6’), 7,76 (dd, J = 7,8 và 5,1 Hz, 1H, H5’), 6,74 (s, 1H, =CH- ), 6,28 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H7), 6,15 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H5) (Phụ lục 5)

Phổ MS: đỉnh [M-H] - xuất hiện tại m/z = 254,00 phù hợp với dự kiến [C14H8NO4] - là 254,05 (Phụ lục 11)

Phổ IR ν (cm -1 ): 3292,49 (νOH), 1608,63 (νC=O) (Phục lục 11)

(Z)-4,6-dihydroxy-2-(thiophen-2-ylmethylen)benzofuran-3(2H)-on (2d-3)

Hiệu suất: 65,69% (0,171 g) Tinh thể màu vàng đậm, không tan trong nước, tan tốt trong cồn, DMSO, ít tan trong cloroform Phân hủy ở 238 ℃ trước khi nóng chảy Sắc ký lớp mỏng: toluen:aceton (2:1) cloroform:methanol (10:1) hexan:ethyl acetat (5:1)

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) (ppm): 10,91 (s, 1H, 4-OH), 10, 86 (s, 1H, 6- OH), 7,80 (d, J = 5,1 Hz, 1H, H3’), 7,59 (d, J = 3,3 Hz, 1H, H5’), 7,17 (dd, J = 5,1 và 3,6 Hz, 1H, H4’), 6,97 (s, 1H, =CH-), 6,17 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H7), 6,06 (d, J 1,8 Hz, 1H, H5) (Phụ lục 6)

Phổ MS: đỉnh [M-H] - xuất hiện tại m/z = 259,00 phù hợp với dự kiến [C13H7O4S] - là 259,01 (Phụ lục 12)

Phổ IR ν (cm -1 ): 3383,14 (ν OH ) 3095,75 (ν =C-H) , 1591,27 (ν C=O ) (Phục lục 12).

KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN KHÁNG NẤM

Các dẫn chất auron tổng hợp được định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trong thạch Kết quả được trình bày trong Bảng 3.4 (Phục lục 13)

Bảng 3.4 Kết quả đường kính vòng vô khuẩn (mm)

E coli P aeruginosa S faecalis S aureus MRSA C albicans A niger

Ghi chú: “-“: là không có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm; đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm bao gồm cả đường kính lỗ là 8 mm

MIC của những auron dương tính với thử nghiệm khuếch tán trong thạch được xác định bằng phương pháp pha loãng (Phục lục 14)

Bảng 3.5 Kết quả MIC (àg/mL)

Chất thử Chủng thử nghiệm

E coli P aeruginosa S faecalis S aureus MRSA C albicans A niger

KẾT QUẢ CHỐNG OXI HÓA

Các dẫn chất auron được thử nghiệm khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp đánh bắt DPPH Kết quả được trình bày trong Bảng 3.6 (Phục lục 15).

Bảng 3.6 Kết quả chống oxi hóa của 6 dẫn chất auron 1d-1 1d-2 1d-3 2d-1 2d-2 2d-3 VitaminC

BÀN LUẬN

Có thể dự đoán các auron tổng hợp được tồn tại ở cấu hình Z, do cấu hình này bền hơn về nhiệt động lực học Để xác định rõ cấu cấu hình của các auron có thể tiến hành thêm phương pháp 13 C-NMR hay phương pháp nhiễu xạ tia X 93

Phản ứng Houben–Hoesch có bản chất là phản ứng acyl hóa Friedel–Crafts giữa nitril với xúc tác là acid Lewis và HCl Hiệu suất của phản ứng phụ thuộc nhiều vào lượng HCl cho vào bình Đối với nguyên liệu đầu là resorcinol cần thời gian dài hơn để bắt đầu hình thành tủa, có thể do cấu trúc ít hơn một nhóm cho điện tử (OH) nên tác nhân ái nhân khó gắn lên vòng thơm Tủa tạo thành dễ bị chảy lỏng do sinh ra tạp khi phản ứng có lẫn nước

Do trong cấu trúc có nhóm OH nên các phản ứng tổng hợp tiếp theo đều tiến hành ở nhiệt độ không quá 70 ℃ để tránh sinh ra tạp

NH 2 Cl Hình 3.26 Cơ chế đề nghị cho phản ứng 94

Phản ứng Claisen–Schmidt để tạo auron được tiến hành với xúc tác là KOH trong EtOH 50% Phản ứng được thực hiện ở qua đêm ở nhiệt độ phòng Tuy nhiên đối với auron có vòng B là dị vòng pyridin (2d-1, 2d-2), phản ứng xảy ra chậm hơn và không hoàn toàn Trong thời gian phản ứng dài, sinh ra tạp khó tinh chế

Do đó xúc tác cho phản ứng được đổi thành p-toluensulfonic acid, 95 nhưng sau 32 tiếng, vẫn còn nguyên liệu Với xúc tác KOH, tỷ lệ phản ứng giữa 1c và aldehyd được thay đổi thành thành 1:3 với hi vọng là phản ứng xảy ra nhanh hơn Nhưng phản ứng lại sinh ra thêm tạp khác có Rf gần bằng với Rf của 1c khi theo dõi bằng SKLM Cuối cùng chúng tôi tiến hành gia nhiệt phản ứng trong thời gian không quá 2 giờ Các vết nguyên liệu còn lại sẽ được tinh chế sau

Hình 3.27 Cơ chế đề nghị cho sự hình thành auron từ vòng benzofuranon

Bên cạnh đó, việc dừng phản ứng và tinh chế (2d-1, 2d-2) cũng gặp một số khó khăn

Do vừa có 2 nhóm OH phenol, vừa có dị vòng pyridin trong cấu trúc, nên cả 2 auron này đều là những phân tử có tính lưỡng tính và không tìm ra được pI (điểm đẳng điện) của phân tử Tủa thu được sau khi trung tính hóa luôn xuất hiện 2 vết trên bảng mỏng (một vết có Rf = 0 nghi ngờ là muối) Bằng cách acid hóa hỗn hợp phản ứng với HCl, auron dạng muối HCl đã được tổng hợp 38 nhưng không tìm được hệ dung môi SKLM để xác định độ tinh khiết Đề tài đã thử một số cách để đưa về auron về dạng trung tính:

- Pha loãng hỗn hợp phản ứng với nước cất, lắc phân bố và bỏ lớp ethyl acetat để loại tạp có tính kiềm (tạp có vòng pyridin), acid hóa bằng HCl lắc phân bố và bỏ lớp ethyl acetat để loại tạp có tính acid (tạp có OH phenol), sau đó phản ứng được trung hòa bằng NaHCO3 dư Tuy nhiên 2d-1 và 2d-2 tạo muối với cả NaHCO3 và tan trong nước (không thu được sản phẩm)

- Trung hóa phản ứng bằng NH4Cl bão hòa trong nước, lọc và rửa tủa nhiều lần với nước cất lạnh Đối với 2d-1 tủa được kết tinh lại nhiều lần trong cồn để thu được sản phẩm tinh khiết hơn Đối với 2d-2 sản phẩm thu được theo cách trên khi triển khai SKLM vẫn thu được 2 vết

- Sau đó, phản ứng tổng hợp 2d-2 đã được thử trung hòa với lượng HCl vừa đủ (tương đương với lượng KOH cho vào xúc tác) kết tinh lại và cuối cùng là sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, pha động là hỗn hợp cloroform:methanol để thu được 2d-2 với hiệu suất thấp do phần lớn bị hấp phụ trên cột Xác định cấu trúc bằng 1 H-NMR thì các

40 giá trị độ dịch chuyển hóa học, tích phân và sự phân đỉnh phù hợp với cấu trúc dự đoán mặc dù SKLM vẫn cho 2 vết Có thể dự đoán sản phẩm này không phải là muối của auron với HCl do dựa vào độ tan trong cồn (muối của 2d-2 với HCl kém tan trong cồn) Đề tài đã thử tổng hợp lại 2d-2 nhưng không tiến sắc ký cột và thu được sản phẩm với hiệu suất tốt hơn (65,99%) và độ tinh khiết được xác định bằng 1 H-NMR

Thử hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm

Trong các auron được thử nghiệm thì chỉ có 1d-1, 1d-3 và 2d-2 là có hoạt tính ức chế đối với một số chủng vi sinh vật nhưng MIC tương đối cao

1d-1 ức chế E coli với giỏ trị MIC > 1024 àg/mL

1d-3 ức chế MRSA với giỏ trị MIC > 1024 àg/mL

2d-2 ức chế S aureus và MRSA với giỏ trị MIC > 1024 àg/mL

Thử nghiệm chống oxi hóa

Từ kết quả chống oxi hóa của 6 dẫn chất auron, chỉ có 3 auron 2d-1, 2d-2 và 2d-3 là tính được IC50 Trong đó IC50 của chất tốt nhất 2d-2 (2,55 mM) gấp 8 lần vitamin C (0,334 mM) Cả 3 auron có trên đều có 2 nhóm OH trên vòng A và vòng B là dị vòng

Trong phương pháp đánh bắt DPPH Thao tác cần thực hiện nhanh và tránh sáng để tránh sự sai số do DPPH bị oxi hóa trước quá trình thử nghiệm Độ tan của chất thử cũng là một yếu tố dẫn đến không khảo sát được khả năng đánh bắt DPPH của auron 1d-2

Tiêu đề	Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa của một số dẫn chất hydroxyauron
Tác giả	Võ Hoàng Minh
Người hướng dẫn	TS. Võ Thị Cẩm Vân
Trường học	Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Dược Sĩ Đại Học
Thể loại	Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	5,19 MB