KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC KHẢO SÁT SỰ GẮN KẾT CỦA CÁC FLAVONOID TIỀM NĂNG VỚI ENZYM LIPASE TỤY BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẮT HUỲNH QUANG
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
− Các flavonoid có tiềm năng gắn kết tốt với enzym lipase tụy (Hình 2.13)
− Khả năng gắn kết in vitro của các flavonoid trên với enzym lipase tụy
3–(3,4–Dimethoxyphenyl)–1–(4–(4– fluorobenzyloxy)phenyl)prop–2–en–1–on
3–(3–Hydroxyphenyl)–1–(10H– phenothiazin–2–yl)prop–2–en–1–on
Hình 2.11 Đối tượng nghiên cứu.
Nguyên vật liệu − Trang thiết bị
2.2.1.1 Các phần mềm được sử dụng trong quá trình gắn kết phân tử
Bảng 2.3 Các phần mềm sử dụng để gắn kết phân tử
STT Phần mềm Mục đích
1 Chemdraw Professional 18.1 Chuẩn bị cấu trúc 2D của các phối tử
2 Discovery Studio Visualizer Phân tích tương tác và trình bày cấu trúc
3 Sybyl–X 2.0 Tối thiểu hóa năng lượng cho các phối tử
4 AutoDock Tools–1.5.6rc1 Chuẩn bị protein và phối tử cho quá trình docking
5 AutoDock Vina version 1.1.2 Thực hiện gắn kết phân tử
2.2.1.2 Hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình tổng hợp
Bảng 2.4 Hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình tổng hợp
STT Hóa chất và dung môi Xuất xứ Tiêu chuẩn
5 4–(Dimethylamino)benzaldehyd Acros Tổng hợp
9 Đồng (II) bromid Sigma aldrich Tổng hợp
10 Natri acetat Trung Quốc Tổng hợp
11 Acid p–toluensulfonic Merck Tổng hợp
12 Natri hydroxyd Trung Quốc Tổng hợp
13 Kali carbonat Trung Quốc Tổng hợp
14 Kali iodid Trung Quốc Tổng hợp
15 Cloroform Việt Nam Phân tích
16 Ethanol Trung Quốc Phân tích
17 Aceton Trung Quốc Phân tích
18 Hexan Trung Quốc Phân tích
19 Ethyl acetat Trung Quốc Phân tích
20 Methanol Trung Quốc Phân tích
2.2.1.3 Hóa chất, dung môi sử dụng trong phương pháp tắt quang
Bảng 2.5 Hóa chất và dung môi sử dụng trong thử nghiệm tắt quang
STT Hóa chất Xuất xứ
1 Porcin pancreatic lipase, type II (L–3126) Sigma–Aldrich (Mỹ)
4 Na2HPO4.12H2O Kanto (Nhật Bản)
6 Nước cất 2 lần Bộ môn Hóa Lý – Khoa dược, đại học Y Dược TPHCM
7 Dimethyl sulfoxid Xilong (Trung Quốc)
Bảng 2.6 Trang thiết bị được sử dụng
STT Trang thiết bị Xuất xứ
1 Cân phân tích Sartorius (Đức)
4 Máy ly tâm Hitachi – CT15RE Hitachi (Nhật Bản)
5 Máy quang phổ Hitachi Hightech F7000 Hitachi (Nhật Bản)
6 Máy đo điểm chảy Stuart SMP10 Stuart (Anh)
7 Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FTIR 8201 PC
8 Máy đo phổ khối (MS)
9 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Bruker 400 MHz, 500 MHz Bruker (Đức)
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Gắn kết phân tử (Docking) với các flavonoid tiềm năng đã được sàng lọc
Cấu trúc tinh thể của lipase tụy người được tải từ ngân hàng protein Protein Data Bank với mã ID: 1PLB dưới định dạng *.pdb Sau đó, protein này trải qua các bước xử lý cần thiết.
− Sử dụng phần mềm Discovery Studio 2021 Client loại bỏ nước, các dung môi khác, các phối tử không nằm trong khoang gắn kết khỏi protein
− Tách riêng chuỗi acid amin chứa khoang gắn kết (chuỗi B)
Sử dụng phần mềm AutoDock Tools 1.5.6rc1 để thêm các liên kết hydro phân cực, proton hóa và tích điện cho acid amin trong protein, sau đó lưu tệp dưới định dạng *.pdbqt.
Quá trình chuẩn bị protein lipase tụy lợn tương tự như protein lipase tụy người với một số đặc điểm sau:
− Chuỗi acid amin chứa khoang gắn kết là chuỗi A
Cấu trúc 2D của các phối tử được tạo ra bằng ChemDraw Professional 18.1 và được lưu dưới dạng *.sdf Sử dụng phần mềm Discovery Studio 2021 Client chuyển file
Sau đó các cấu trúc của phối tử được tối thiểu hóa năng lượng bằng bằng công cụ Minimize bằng phần mềm Sybyl qua các bước:
− Bước 1: Tối thiểu hóa năng lượng lần 1: chọn Compute → Minimize → Molecule với các thông số:
➢ Phương pháp (Method): Conj Grad
➢ Ngưng khi RMS đạt giá trị này (Termination → Energy Change): 0,0001 kcal/mol
➢ Số bước lặp lại (Max Iterations): 10 000
➢ Trường lực (Modify → Charge): Gasteiger Huckel
− Bước 2: Chạy động lực học phân tử: chọn Compute → Dynamics → Setup Simulated Annealing với thông số Run bằng 5 và thông số khác giữ nguyên mặc định
Mục đích : chọn ra cấu dạng có năng lượng thấp nhất trong tất cả cấu dạng có thể tạo ra
Bước 3: Tối thiểu hóa năng lượng lần 2 là quá trình thực hiện tương tự như lần 1, nhằm xác định trạng thái năng lượng tối thiểu toàn phần từ trạng thái năng lượng tối thiểu cục bộ của phân tử.
Tất cả các phân tử sau khi tối thiểu hóa năng lượng được lưu dưới dạng *.pdb và chuyển đổi sang định dạng *.pdbqt bằng phần mềm AutoDock Tools 1.5.6rc1 để phục vụ cho mô hình docking.
2.3.1.3 Gắn kết phân tử (Docking)
Thông số hộp docking được thu thập từ các nghiên cứu trước đây và lưu vào tệp config.txt:
Tiến hành docking các phối tử đã chuẩn bị với protein đích theo thông số trong tệp config.txt Kết quả thu được sau quá trình docking cho thấy 9 cấu dạng khác nhau, phản ánh 9 cách tương tác độc đáo của protein trong khoang gắn kết.
2.3.1.4 Đánh giá kết quả docking
Lựa chọn cấu dạng tối ưu theo 2 tiêu chí:
−Tương tác của phối tử với các acid amin quan trọng: Ser152, His263, Asp176, Phe77 thông qua các liên kết hydro, liên kết kỵ nước…
Điểm số docking (Docking score) được thể hiện qua năng lượng gắn kết (kcal·mol⁻¹) Năng lượng gắn kết âm cho thấy phối tử có khả năng gắn kết tốt và bền vững vào khoang gắn kết của protein.
2.3.2 Tổng hợp các flavonoid tiềm năng
Hình 2.12 Quy trình tổng hợp C82
− 1,36 g (10 mmol) 4–hydroxyacetophenon được cho vào bình cầu, sau đó thêm 30 mL ethanol và đặt lên bếp khuấy cho tan
− Hòa tan 1,60 g (40 mmol) NaOH trong becher với lượng nước tối thiểu, sau đó cho vào bình phản ứng
− 1,99 g (12 mmol) 3,4–dimethoxybenzaldehyd được cho vào bình cầu, dung dịch chuyển sang màu vàng, sau đó thêm 10 mL ethanol
− Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi hexan:methanol tỉ lệ 9:1 (thể tích/thể tích)
Dừng phản ứng khi không còn vết nguyên liệu trên sắc ký lớp mỏng Tiến hành lọc hỗn hợp phản ứng và trung hòa dịch lọc đến pH = 5–6 Sau đó, pha loãng dịch lọc bằng nước cất đã acid hóa để tạo ra tủa.
− Lọc và rửa tủa bằng nước cất Kết tinh lại trong ethanol thu chalcon trung gian
− 0,57 g (2 mmol)chalcon 1 được cho vào bình cầu, sau đó thêm khoảng 10 mL aceton và khuấy trên bếp từ cho tan
− Thêm 0,83 g (6 mmol) K2CO3 vào bình, sau đó thêm vào 0,30 g (2,1 mmol) 4–florobenzylchlorid và 0,10 g (1 mmol) KI
Theo dõi phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi cyclohexan:aceton với tỉ lệ 5:2 Khi không còn thấy vết chalcon 1 xuất hiện trên sắc ký lớp mỏng, tiến trình phản ứng được dừng lại.
− Lọc lấy dịch và để qua đêm trong tủ lạnh Sau đó lọc lấy tủa thô, rửa tủa bằng hỗn hợp cồn:nước tỉ lệ 1:1
− Tủa thô được tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong ethanol
Hình 2.13 Quy trình tổng hợp C142
− 0,96 g 2–acetylphenothiazin và 0,49 g 3−hydroxybenzaldehyd được hòa tan trong bình cầu với lượng tối thiểu DMSO
− Thêm từng giọt NaOH 1 M cho đến khi dung dịch chuyển sang màu đỏ đen Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ thường trong khoảng 3 giờ
− Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi hexan:ethyl acetat tỉ lệ 3:1
Sau khi phản ứng, hỗn hợp được làm lạnh và acid hóa bằng acid acetic đậm đặc đến pH 4–5, dẫn đến sự hình thành tủa thô Tủa thô sau đó được lọc và rửa nhiều lần với nước, cuối cùng được sấy ở nhiệt độ 40 ºC.
− Tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi hexan:ethyl acetat tỉ lệ 2:1
Tổng hợp 2–bromo–2’–hydroacetophenon (chất 2)
− 2,0 g (14,7 mmol) 2’–hydroxyacetophenon và 6,6 g (29,5 mmol) đồng (II) bromid được phân tán trong 40 mL hỗn hợp dung môi ethyl acetat:cloroform tỉ lệ 1:1
Phản ứng được tiến hành trong 24 giờ ở nhiệt độ 80 °C với phương pháp đun hồi lưu Sau khi hoàn tất, hỗn hợp phản ứng được lọc để thu lấy dịch, sau đó dịch lọc được lắc phân bố với dung dịch dinatri ethylen diamin tetraacetat 5%.
(2 lần 10 mL) và natri thiosulfat 10% (2 lần 10 mL)
− Dịch chiết được cô quay dưới áp suất giảm thu tủa thô
− Tủa thô được kết tinh lại ở nhiệt độ lạnh với hỗn hợp dung môi hexan:ethanol tỉ lệ 4:1
− 0,6 g (7,32 mmol) natri acetat được phân tán vào 10 mL ethanol trong bình phản ứng và đun ở 60 o C Hòa tan 1,25 g (5,81 mmol) 2’–bromo–2–hydroxyacetophenon vào 5 mL ethanol
− Nhỏ từ từ từng giọt dung dịch vừa pha vào bình phản ứng trong 30 phút Tiếp tục đun hỗn hợp phản ứng trong 1 giờ
− Ngừng phản ứng bằng cách thêm 40 mL nước cất vào bình phản ứng, sau đó làm lạnh Lọc tủa và sấy khô tủa thu được tủa thô
− Tủa thô được kết tinh lại trong hỗn hợp ethanol:hexan tỉ lệ 3:1
− Benzaldehyd (0,22 g (1,1 mmol) 5–Bromosalicylaldehyd hoặc 0,16 g (1,1 mmol) 4–(dimethylamino) benzaldehyd) được hòa tan trong 3 mL ethanol 50% và 2 mL dung dịch acid p–toluensulfonic 40% ở 50 o C
− Thêm 0,13 g (1 mmol) 3–coumaranon vào hỗn hợp phản ứng và phản ứng trong 6 giờ
Hình 2.14 Quy trình tổng hợp các auron A1 và A83.
− Sau phản ứng, làm lạnh hỗn hợp phản ứng, lọc tủa và sấy khô thu tủa thô
− Tủa thô được kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi cloroform:hexan tỉ lệ 2:1
Các chất được tổng hợp xong sẽ được xác định cấu trúc thông qua các phương pháp:
− Sắc ký lớp mỏng (TLC)
− 1 H–NMR: mẫu được gửi đến viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam
− MS: mẫu được gửi đến đại học Khoa Học Tự Nhiên
2.3.3 Phương pháp tắt huỳnh quang lipase
2.3.3.1 Chuẩn bị dung dịch phối tử và dung dịch enzym
Dung dịch đệm phosphat 0,1 M pH 7,4, NaCl 0,1 M
Pha 13,5029 g Na2HPO4.12H2O và 1,9186 g NaH2PO4.2H2O trong 400 mL nước cất 2 lần, sau đó đo pH và điều chỉnh đến pH 7,4 bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO4 Cân 2,9220 g NaCl và cho vào bình định mức 500 mL Chuyển toàn bộ dung dịch trong becher vào bình định mức 500 mL, thêm nước cất 2 lần đến vạch, và lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Dung dịch enzym lipase tụy lợn 1,1 àM trong đệm phosphat
Cân 0,0106 g enzym lipase tụy lợn vào ống eppendorf, sau đó thêm 1 mL dung dịch đệm phosphat 0,1 M pH 7,4 và NaCl 0,1 M, lắc đều để phân tán Tiếp theo, ly tâm lạnh enzym ở tốc độ 14000 rpm trong 5 phút tại nhiệt độ 4°C Cuối cùng, thu lớp dịch ở phía trên và pha loãng 20 lần để đạt nồng độ 1,1 àM.
Dung dịch chất thử ở nồng độ 2,5 mM
Cân và pha các chất thử trong dimethyl sulfoxid để đạt nồng độ 0,25 M Sau đó pha loãng 100 lần để thu được nồng độ 2,5 mM
Quy trình thử nghiệm khả năng gắn kết của flavonoid với enzym lipase tụy được thực hiện theo nghiên cứu của Nuzio Cardullo và cộng sự Để đo mẫu huỳnh quang chứa enzym, thêm từ từ 2 µL chất thử vào 2 mL dung dịch enzym đã chuẩn bị, đạt nồng độ từ 5 – 30 µM, ủ mẫu trong 1 phút và đo ở 25 ºC với bước sóng kích thích 285 nm, ghi nhận phổ phát xạ từ 310 nm đến 450 nm Đối với mẫu huỳnh quang không chứa enzym, quy trình tương tự được thực hiện nhưng dung dịch enzym được thay bằng đệm phosphat pH 7,4 0,1 M và NaCl 0,1 M Cuối cùng, để hiệu chỉnh kết quả và hạn chế hiệu ứng lọc nội tại, quét phổ UV bằng máy quang phổ huỳnh quang được thực hiện.
− Chuẩn bị mẫu và tiến hành: tương tự như mẫu huỳnh quang không chứa enzym Mỗi mẫu đo được thực hiện lặp lại 3 lần
Tiến hành tương tự trên mẫu quercetin–chất được đánh giá có khả năng gắn kết tốt với enzym lipase tụy 29,42
Hiệu chỉnh cường độ huỳnh quang thu được để hạn chế hiệu ứng lọc nội tại bằng công thức:
F hiệu chỉnh = (F đo − F trắng )10 A 1 +A 2 2 Trong đó: Fhiệu chỉnh: cường độ huỳnh quang đã hiệu chỉnh
Fđo: cường độ huỳnh quang đo được của mẫu có enzym
Ftrắng: cường độ huỳnh quang của mẫu không chứa enzym
A1: độ hấp thu UV đo được ở bước sóng kích thích
A2: độ hấp thu UV đo được ở bước sóng phát xạ
Xây dựng phổ phát xạ của enzym lipase tụy cho thấy sự thay đổi khi nồng độ chất khảo sát tăng dần Đường hồi quy tuyến tính được sử dụng để thể hiện mối tương quan giữa tỉ lệ F0 và nồng độ enzym, giúp xác định mối liên hệ giữa các yếu tố này trong quá trình nghiên cứu.
F và nồng độ chất khảo sát dựa trên phương trình Stern-Volmer và đường hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa log F 0 −F
F và log nồng độ chất khảo sát
Tính toán các thông số quan trọng trong quá trình gắn kết là cần thiết, trong đó Ksv và Kq được xác định thông qua phương trình Stern–Volmer Các giá trị này được ghi nhận tại bước sóng phát xạ mà cường độ huỳnh quang, sau khi hiệu chỉnh enzym, đạt mức cao nhất.
K q =K sv τ 0 Trong đó: F: cường độ huỳnh quang của enzym khi có chất thử
F0: cường độ huỳnh quang của enzym khi không có chất thử [Q]: nồng độ của chất thử (molL –1 )
Ksv: hệ số tắt quang (Lmol –1 )
Kq: hệ số tốc độ tắt quang (Lmol –1 s –1 ) τ0: vòng đời của lipase ở trạng thái kích thích: 1,59 ns
Thông số Kgắn kết và n được tính toán từ phương trình sau: logF 0 − F
Trong đó: Kgắn kết: hệ số gắn kết (Lmol –1 ) n: số vị trí gắn kết = số phân tử nhỏ gắn kết với enzym.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả gắn kết phân tử
3.1.1 Kết quả gắn kết phân tử với enzym lipase tụy người
Các flavonoid tiềm năng đã được docking thành công vào khoang gắn kết của enzym lipase tụy người Tất cả các flavonoid khảo sát đều tạo ra tương tác kỵ nước và liên kết hydro với các acid amin quan trọng như Ser152, His263 và Phe77, ảnh hưởng đến hoạt tính của lipase tụy Điểm số gắn kết của các flavonoid với enzym lipase tụy người dao động từ −10,3 kcal/mol.
Cấu trúc C142 thể hiện khả năng gắn kết tốt nhất với điểm số docking thấp nhất, trong khi A83 có điểm số docking cao nhất, với giá trị năng lượng từ -1 đến -9,2 kcal·mol –1 (Bảng 3.7).
Bảng 3.7 Điểm số docking của các flavonoid với enzym lipase tụy người
STT Chất Điểm số docking Điểm số docking thu được từ nghiên cứu trước đây
Kết quả docking cho thấy sự tương đồng với nghiên cứu trước của nhóm Võ Thị Cẩm Vân, với điểm số docking thấp hơn −9,0 kcalmol –1, chứng tỏ khả năng gắn kết tốt của các flavonoid với enzym lipase tụy người Thứ tự điểm số docking giữa hai nghiên cứu cũng cho thấy sự phù hợp rõ rệt.
Vị trí và cấu trúc của các chất trong khoang gắn kết của enzym lipase tụy người được thể hiện rõ qua các tương tác trong hình 3.15 Các flavonoid tương tác với khoang xúc tác nhờ các liên kết hydro giữa oxy của nhóm ceton và hydroxy của Ser152 Bên cạnh đó, khung auron và chalcon, với cấu trúc đa vòng thơm, có khả năng tạo ra các tương tác kỵ nước với các acid amin vòng như Phe77, Phe215, Tyr114 và His263 trong khoang xúc tác.
Hình 3.15 Kết quả docking với lipase tụy người (PDB: 1LPB) của C82, C142, A1,
3.1.2 Kết quả gắn kết phân tử với enzym lipase tụy lợn
Các flavonoid đã được docking thành công vào khoang gắn kết của enzym lipase tụy lợn, với điểm số docking thấp hơn −9,0 kcalmol –1, dao động từ –11,0 kcalmol –1 đến –9,7 kcalmol –1 (Bảng 3.8).
Bảng 3.8 Điểm số docking của các flavonoid với enzym lipase tụy lợn
STT Chất Điểm số docking
Hình 3.18 mô tả vị trí của các chất trong khoang gắn kết của enzym lipase tụy lợn, đồng thời chỉ ra các tương tác giữa các chất này và các acid amin quan trọng.
Hình 3.16 Kết quả docking với lipase tụy lợn (PDB: 1ETH) của C82, C142, A1,
Acid amin đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành liên kết hydro, đặc biệt với Ser153 Ngoài ra, các acid amin như Phe78, Tyr115 và Leu264 tạo ra các tương tác kỵ nước với các chất Tương tự như quá trình docking ở enzym lipase tụy người, nhóm ceton trên cấu trúc các chất là yếu tố chính hình thành liên kết hydro với các acid amin Trong khi đó, các vòng thơm đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra tương tác kỵ nước với các acid amin thiết yếu.
Tổng hợp các flavonoid có tiềm năng
Tính chất vật lý: Chất rắn, màu vàng mảnh, tinh thể dài 3–4 mm, có ánh kim Tan tốt trong ethanol, methanol, aceton, diclorometan, cloroform
Sắc ký lớp mỏng: cyclohexan:aceton tỉ lệ 5:2, Rf = 0,55
MS (ESI) m/z: C24H21FO4 [M–H] + dự kiến 393,1502 m/z, thực tế đo 393,1510 m/z
1H–NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm) 8,02 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H2’, H6’), 7,74 (d, J 15.5 Hz, 1H, Hβ), 7,44–7,35 ( m, 3H, Hα, H2’’ và H6’’), 7,20 (dd, J = 8,3 và 2,0 Hz, 1H, H6), 7,14 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H2), 7,06 (td, J = 8,7 Hz, 3H, H3’’và H5’’), 7,01
(d, J = 8,9 Hz, 2H, H3’ và H5’), 6,87 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H5), 5,06 (s, 2H, CH2), 3,93 (s, 3H, H7), 3,9 (s, 3H, H8) (phù hợp với nghiên cứu đã được công bố trước đây) 54
Tính chất vật lý: Bột màu đỏ đen, không tan trong nước, n–hexan, tan ít trong ethanol, tan nhiều trong ethyl acetat, aceton, dimethyl sulfoxid
Sắc ký lớp mỏng: hexan:aceton tỉ lệ 3:1, Rf = 0,48
MS (ESI) m/z: C21H15NO2S [M–H] − dự kiến 344,42 m/z, thực tế đo 344,10 m/z
1H NMR (600 MHz, DMSO–d6) δ (ppm): 8,76 (1H, s, OH), 7,66 (1H, d, J = 15,6 Hz, Hα), 7,60 (1H, d, J = 15,6 Hz, Hβ), 7,57 (1H, dd, J = 8,0, 1,8 Hz, H7), 7,30 (1H, d, J
= 1,8 Hz, H5), 7,28 – 7,22 (2H, m, H5’, H4’), 7,18 (1H, t, J = 1,9 Hz, H2’), 7,07 (1H, d, J = 8,0 Hz, H8), 7,00 (1H, td, J = 7,6, 1,5 Hz, H3), 6,92 (1H, dd, J = 7,7, 1,4 Hz, H1), 6,87 (1H, dt, J = 7,0, 2,2 Hz, H6’), 6,76 (1H, td, J = 7,5, 1,3 Hz, H2), 6,66 (1H, dd, J = 8,0, 1,3 Hz, H4)
Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu vàng, tan nhiều trong chloroform, ethyl acetat, tan ít trong ethanol và không tan trong nước
Sắc ký lớp mỏng: hexan:ethyl acetat tỉ lệ 2:1, Rf = 0,50
MS (ESI) m/z: C15H8BrO3 [M–H] − dự kiến 314,97 và 316,96 m/z, thực tế đo 314,94 và 317,01 m/z
1H–NMR (400 MHz, DMSO–d6): 10,8 (s, 1H, -OH), 8,21 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H6’),
7,81 (m, 2H, H4 và H6), 7,63 (dd, J = 8,4 và 0,8 Hz, 1H, H7), 7,45 (dd, J = 8,76 và 2,56 Hz, 1H, H4’), 7,34 (td, J = 7,54 và 0,81 Hz, 1H, H5), 7,12 (s, 1H, =CH-), 6,94 (d, J = 8,76, 1H, H3’) (phù hợp với nghiên cứu đã được công bố trước đây) 55
Tính chất vật lý: Bột tinh thể màu đỏ đậm, tan nhiều trong chloroform, ethyl acetat, tan một phần trong ethanol và ít tan trong nước.
Sắc ký lớp mỏng: hexan:ethyl acetat tỉ lệ
MS (ESI) m/z: C17H15NO2 [M+H] + dự kiến 266,12 m/z, thực tế đo 266,37 m/z
1H–NMR (400 MHz, DMSO–d6): 10,8 (s, 1H, -OH), 8,21 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H6’),
7,81 (m, 2H, H4 và H6), 7,63 (dd, J = 8,4 và 0,8 Hz, 1H, H7), 7,45 (dd, J = 8,76 và 2,56 Hz, 1H, H4’), 7,34 (td, J = 7,54 và 0,81 Hz, 1H, H5), 7,12 (s, 1H, =CH-), 6,94 (d, J = 8,76, 1H, H3’) (phù hợp với nghiên cứu đã được công bố trước đó) 55
Kết quả thử nghiệm tắt quang lipase xác định khả năng gắn kết của các chất
3.3.1 Phổ phát xạ huỳnh quang
Cường độ huỳnh quang của enzym lipase giảm khi thêm flavonoid vào dung dịch, với quercetin là một trong bốn flavonoid được khảo sát Sự giảm cường độ này tỷ lệ thuận với nồng độ của các flavonoid, cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của chúng đến hoạt động của enzym lipase.
Hình 3.17 Phổ phát xạ huỳnh quang của enzym lipase tụy lợn khi thêm chất ức chế
3.3.2 Biểu đồ Stern–Volmer và thông số của quá trình tắt huỳnh quang
Giá trị Kq và Ksv được xác định thông qua phương trình Stern-Volmer, phản ánh mối quan hệ giữa tỷ lệ F0/F và nồng độ của các chất khảo sát Đường hồi quy tuyến tính cho thấy hệ số tương quan lớn hơn 0,90, chứng tỏ sự tương quan chặt chẽ giữa các yếu tố này.
Hình 3.18 Đường hồi quy tuyến tính giữa F0/F và nồng độ các chất khảo sát Đường hồi quy tuyến tính thể hiện sự tương quan giữa log F 0 −F
Nồng độ các flavonoid tiềm năng được sử dụng để tính toán các thông số quan trọng như Kgắn kết và n, với các đường hồi quy có hệ số tương quan tuyến tính lớn hơn 0,90 (Hình 3.19).
Hình 3.19 Đường hồi quy tuyến tính giữa log F 0 −F
F và log nồng độ các flavonoid khảo sát
Dựa trên các đường hồi quy tuyến tính đã xây dựng, bảng 3.9 trình bày các giá trị cơ bản của quá trình gắn kết giữa các chất và enzym lipase tụy lợn.
Bảng 3.9 Các thông số quan trọng của quá trình tắt quang lipase tụy lợn
Bàn luận
3.4.1 Kết quả gắn kết in silico các flavonoid tiềm năng vào enzym tụy lợn và enzym tụy người
Các chất khảo sát đều có điểm số docking thấp hơn –9,0 kcalmol –1, trong đó C142 nổi bật với điểm số –10,3 kcalmol –1 đối với enzym lipase tụy người và –11,0 kcalmol –1 với enzym lipase tụy lợn Điều này cho thấy khả năng gắn kết tốt của các chất và quercetin với cả hai enzym Thứ tự điểm số docking của các chất tương đồng giữa enzym lipase tụy lợn và lipase tụy người, giảm dần theo thứ tự C142, A1, quercetin, C82 và A83 Đặc biệt, C82 có cấu dạng trải dài trong khoang gắn kết, với nhóm ceton trên nhánh 3 carbon tạo liên kết hydro với Ser152 và His263.
Hai acid amin quan trọng trong bộ ba xúc tác của enzym bao gồm các vòng thơm, đóng vai trò tạo tương tác kị nước với các acid amin Cụ thể, vòng thơm có hai nhóm methoxy tương tác với Trp252, trong khi vòng thơm chứa nguyên tử Flo tương tác với Tyr114 và Phe215 Trong khoang gắn kết của enzym lipase tụy lợn, liên kết hydro được hình thành giữa nguyên tử oxy trong nhóm ceton và Ser152 Các acid amin quan trọng trong việc tạo tương tác kị nước còn có His264, Phe216 và Tyr115.
Lipase tụy người Lipase tụy lợn
Hình 3.20 Tương tác của C82 với các acid amin trong khoang gắn kết của lipase tụy người và lợn
Cấu trúc của C142 tương tự như C82, với nhóm ceton đóng vai trò quan trọng trong việc tạo liên kết hydro với enzym lipase tụy người Nguyên tử oxy trong nhóm ceton tương tác với nhóm amin của serin 152 trong bộ ba xúc tác của enzym, trong khi oxy của Phe77 giúp tăng cường sự tương tác của C142 với enzym này Hệ thống vòng phenothiazin tạo ra tương tác kị nước với His263 và Phe215, trong khi nhánh phenyl tương tác kị nước với Tyr114 Sự gắn kết của C142 với enzym lipase tụy lợn cũng cho thấy nhiều điểm tương đồng với enzym lipase tụy người, với liên kết hydro hình thành từ nhóm ceton và acid amin Ser152.
−OH với His152 và Asp80 (Hình 3.21)
Lipase tụy người Lipase tụy lợn
Hình 3.21 Tương tác của C142 với các acid amin trong khoang gắn kết của lipase tụy người và lợn
A83 gắn kết với enzym lipase tụy lợn và lipase tụy người tương đối giống nhau Trong khoang gắn kết của lipase tụy người, A83 hình thành liên kết hydro với Ser152 thông qua nhóm ceton trên dị vòng benzofuranon, đồng thời tạo tương tác kị nước với Tyr114, Phe215 và His263 Các tương tác này cũng xuất hiện với các acid amin tương tự trong enzym lipase tụy lợn.
Lipase tụy người Lipase tụy lợn
Hình 3.22 Tương tác của A83 với các acid amin trong khoang gắn kết của lipase tụy người và lợn
A1 tạo liên kết hydro với các enzym thông qua nhóm ceton trong cấu trúc của nó Hệ thống dị vòng benzofuranon trong A1 tương tác kị nước với các amino acid như His263, Gly76 và Phe77 trong enzym lipase tụy người, cũng như Phe216, Phe78 và His264 trong enzym lipase tụy lợn.
Lipase tụy người Lipase tụy lợn
Hình 3.23 Tương tác của A1 với các acid amin trong khoang gắn kết của lipase tụy người và lợn
Nhóm ceton trong cấu trúc các chất có vai trò quan trọng trong việc hình thành liên kết hydro với Ser152 (enzym tụy người) hoặc Ser153 (enzym tụy lợn) Đồng thời, các vòng thơm hoặc dị vòng cũng tạo ra các tương tác kỵ nước với các acid amin trong khoang gắn kết.
Nghiên cứu cho thấy enzym tụy lợn và enzym tụy người có sự tương đồng rõ rệt về khả năng gắn kết, độ mạnh của liên kết, cũng như các acid amin tham gia vào quá trình tương tác Vì vậy, việc lựa chọn enzym tụy lợn để khảo sát gắn kết in vitro sẽ giúp phản ánh chính xác sự gắn kết giữa các phối tử và enzym tụy người.
3.4.2 Kết quả gắn kết in vitro các flavonoid tiềm năng vào enzym tụy lợn
Cường độ phát xạ của enzym lipase giảm khi nồng độ chất khảo sát tăng, cho thấy hiện tượng tắt huỳnh quang Đồng thời, bước sóng phát xạ cực đại (max) của enzym lipase tụy chuyển dịch sang vùng đỏ khi nồng độ chất khảo sát tăng, thể hiện sự gia tăng độ phân cực của vi môi trường xung quanh các gốc tryptophan do sự thay đổi cấu trúc enzym Điều này chỉ ra sự gắn kết giữa enzym và các flavonoid tiềm năng, tương tự như hiện tượng đã được quan sát trong các nghiên cứu trước về tắt quang tryptophan.
Các chất khảo sát đều có hệ số tốc độ tắt quang Kq > 2 x 10^10 L·mol−1·s−1, cho thấy cơ chế tắt quang enzym lipase tụy của chúng là cơ chế tắt quang tĩnh Trong số bốn chất, C82 và A1 nổi bật với khả năng tắt quang tốt.
Ksv lần lượt là 2,3310 4 Lmol −1 và 2,6610 4 Lmol −1 , cao hơn giá trị Ksv của Quercetin
Bảng 3.10 Hệ số tốc độ tắt quang của các chất khảo sát
Khả năng gắn kết của các chất được thể hiện qua giá trị Kgắn kết, trong đó A1 và C142 cho thấy khả năng gắn kết tốt với enzym lipase tụy lợn với giá trị lần lượt là 1138 Lmol –1 và 305 Lmol –1, cao hơn quercetin (256 Lmol –1) Ngược lại, C82 và A83 có ái lực gắn kết thấp hơn, với giá trị Kgắn kết chỉ bằng 1/10 so với quercetin.
3.4.3 Phương pháp tắt quang enzym lipase
Bảng 3.11 Kết quả gắn kết in silico và in vitro của các chất khảo sát
Chất Lipase tụy lợn kcalmol -1 Thứ tự K gắn kết
Kết quả khảo sát khả năng gắn kết của các chất in vitro và in silico cho thấy sự tương đồng rõ rệt (Bảng 3.11) Các nghiên cứu in silico chỉ ra rằng tất cả các chất đều có điểm số docking thấp, cho thấy khả năng gắn kết tốt Tuy nhiên, khảo sát in vitro bằng phương pháp tắt huỳnh quang chỉ phát hiện C142 và A1 gắn kết tốt với enzym lipase tụy lợn, khi so sánh với Quercetin Điều này cho thấy sự khác biệt giữa kết quả khảo sát in silico và in vitro.
Phương pháp tắt huỳnh quang lipase là một kỹ thuật khảo sát in vitro khả năng gắn kết của các chất với enzym lipase tụy, dễ thực hiện với thiết bị đơn giản Đây là thử nghiệm in vitro phù hợp để tiến hành sau khi khảo sát khả năng gắn kết in silico Tuy nhiên, quy mô nghiên cứu chỉ thực hiện trên 4 cấu trúc, do đó không thể đánh giá sự tương quan giữa kết quả in silico và in vitro.