Nghiên cứu Ảnh hưởng của trường xung sóng siêu Âm trong lên men nấm thượng hoàng (phellinus linteus)

Nghiên cứu Ảnh hưởng của trường xung sóng siêu Âm trong lên men nấm thượng hoàng (phellinus linteus) Nghiên cứu Ảnh hưởng của trường xung sóng siêu Âm trong lên men nấm thượng hoàng (phellinus linteus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Thân Thảo Nguyên

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TRƯỜNG XUNG SÓNG SIÊU ÂM

TRONG LÊN MEN NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phellinus linteus)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Thân Thảo Nguyên

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TRƯỜNG XUNG SÓNG SIÊU ÂM

TRONG LÊN MEN NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phellinus linteus)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Nguyễn Đức Tiến

2 PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội – Năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi; các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình của tác giả nào khác

Hà Nội, ngày 17 tháng 03 năm 2023

Học viên

Thân Thảo Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Tiến, Phó viện

trưởng Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS TS Bùi Thị

Việt Hà, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình

hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn

thành luận văn này, đã luôn truyền cảm hứng, định hướng và tạo động lực giúp tôi

phát triển và hoàn thiện bản thân tốt hơn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh

học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã truyền đạt cho tôi những kiến

thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn tới các cán bộ trong Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm nông nghiệp

- Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã động viên tôi trong quá

trình học tập và thực hiện đề tài này

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè – những người luôn

bên cạnh truyền động lực, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Mặc dù có rất nhiều cố gắng nhưng do thời gian và trình độ còn hạn chế nên

luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót Rất mong có sự đóng góp, chỉ bảo

thêm từ các thầy cô để tôi có thể hoàn thành tốt hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 03 năm 2023

Thân Thảo Nguyên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Nấm thượng hoàng 5

1.1.1 Vị trí nấm thượng hoàng trong phân loại nấm học 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm thượng hoàng 6

1.1.3 Phân bố 7

1.1.4 Thành phần hóa học của nấm thượng hoàng 8

1.1.5 Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của nấm thượng hoàng 10

1.1.6 Hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng 12

1.2 Công nghệ nuôi cấy chìm 14

1.2.1 Khái niệm 14

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy chìm 16

1.3 Ứng dụng siêu âm trong công nghệ nuôi cấy vi sinh vật 17

1.3.1 Định nghĩa sóng siêu âm 17

1.3.2 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm 17

1.3.3 Phân loại sóng âm 19

1.3.4 Ứng dụng của sóng siêu âm tần số thấp trong công nghệ lên men 20

1.4 Tình hình nghiên cứu 23

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 23

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Môi trường 28

2.1.3 Hóa chất 29

2.1.4 Thiết bị 29

2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31

2.2.1 Ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 33

2.2.2 Ảnh hưởng thời gian siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 33

2.2.3 Ảnh hưởng của thời điểm siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 33

2.2.4 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất bổ sung đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 34

2.2.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất bổ sung vào môi trường đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 34

2.2.6 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 34

2.2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 35

2.3 Phương pháp phân tích và đo đạc 35

2.3.1 Xác định sinh khối sợi nấm 35

2.3.2 Xác định hàm lượng polysaccharide nội bào 35

2.3.3 Xác định hàm lượng polysaccharide ngoại bào 36

2.3.4 Xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối và

khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 38

3.2 Ảnh hưởng thời gian siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 39

3.3 Ảnh hưởng thời điểm siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 40

3.4 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất bổ sung đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 42

3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất bổ sung đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 43

3.6 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 44

3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 45

3.8 So sánh sinh khối và hàm lượng polysaccharide của nấm P linteus T16 lên men bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm với phương pháp lên men không sử dụng sóng siêu âm 46

3.9 Đề xuất quy trình lên men nấm thượng hoàng có hỗ trợ sóng siêu âm 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quả thể nấm thượng hoàng 7

Hình 1.2 Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí trong siêu âm 19

Hình 2.1 Hệ thống lên men với hỗ trợ trường xung sóng siêu âm tần số 20kHz dung tích 80L/mẻ 30

Hình 2.2 Hệ thống nuôi cấy chìm sục khí 31

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí tác động siêu âm 32

Hình 2.4 Sơ đồ phương pháp bố trí thí nghiệm 32

Hình 2.5 Sơ đồ phương pháp phân tích các chỉ tiêu đánh giá 36

Hình 3.1 Sinh khối nấm P linteus T16 lên men 47

Hình 3.2 Sinh khối nấm P linteus T16 lên men có hỗ trợ sóng siêu âm 48

Hình 3.3 Quy trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ trường xung sóng siêu âm 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm thượng hoàng 8Bảng 1.2 Thành phần và hàm lượng acid amin trong quả thể nấm thượng hoàng 9Bảng 1.3 Thành phần khoáng và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng 10Bảng 1.4 Hợp chất thứ cấp và hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng 11Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men lỏng 28Bảng 3.1 Ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm trong quá trình lên men đến sinh

khối và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 38

Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối

và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 39

Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời điểm siêu âm trong quá trình lên men đến sinh khối

và khả năng sinh tổng hợp polysaccharide của nấm P linteus T16 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất bổ sung đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 42 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất bổ sung đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 43

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình lên men

nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm 44 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có

hỗ trợ sóng siêu âm 45

Bảng 3.8 So sánh sinh khối và hàm lượng polysaccharide của nấm P linteus

T16 được lên men bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm với phương pháp lên men không sử dụng sóng siêu âm 46

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

IC50 Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nấm thượng hoàng có tên khoa học là Phellinus linteus, đây là một loại nấm

dược liệu quý trong tự nhiên đã được người Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị, tăng cường khả năng của hệ thống miễn dịch, giúp giảm lượng cholesterol và đường trong máu Trong nấm Thượng hoàng có chứa nhiều thành phần hóa học như acid amin, vitamin, khoáng, carbonhydrat và một số hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide, protein-polysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane và polychlorinat [40] Nấm thượng hoàng cũng hiệu quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và tiểu đường, giảm căng thẳng, đặc biệt là khả năng chống khối u, ung thư vượt trội so với các giống nấm dược liệu khác [58, 78] Việc khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học, các thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng bằng các công nghệ chế biến hiện đại, tạo

ra được các sản phẩm giàu hoạt chất để ứng dụng sản xuất các loại thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ, nâng cao sức khỏe là hướng đi đúng và cần thiết

Nấm thượng hoàng là nấm đa niên nên thời gian nuôi trồng kéo dài, giá thành cao

do đó khả năng đáp ứng nhu cầu tiêu dùng còn bị hạn chế; thường phải nhập khẩu ở các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc với giá cao cũng như khó có thể kiểm soát được chất lượng Vì vậy, cần có các nghiên cứu cơ sở để nuôi trồng loài nấm này trên giá thể nhân tạo, nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của hệ sợi và xác định thời gian thu hoạch Những nghiên cứu này là rất cần thiết, có ý nghĩa không chỉ về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn trong nghiên cứu cơ sở nuôi trồng nấm thượng hoàng ở Việt Nam Để giải quyết vấn đề này, phương pháp nhân sinh khối hệ sợi nấm trong các hệ thống nuôi cấy chìm được xem là giải pháp trong việc rút ngắn thời gian nuôi, thu sinh khối sợi nấm và dịch chiết có hàm lượng hoạt chất sinh học cao

Trong những năm gần đây, sóng siêu âm có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chế biến nông sản thực phẩm, kỹ thuật lên men, kỹ thuật y tế và kỹ thuật hóa học do các ưu điểm như thân thiện với môi trường, chi phí năng lượng thấp, không cần phụ gia ngoại sinh và dễ vận hành Sóng siêu âm tần số thấp chủ yếu được sử dụng để chiết xuất và phân tách, tăng tốc phản ứng hóa học, hỗ trợ lên men vi sinh, thúc đẩy sự phát triển của các tế bào vi sinh vật và nâng cao chất lượng trong ngành công nghiệp thực phẩm Tác động của sóng siêu âm có thể tạo ra hiệu ứng xâm thực,

cơ học, nhiệt học làm thay đổi tính thấm của màng tế bào và tăng tốc độ phát triển của tế bào; thay đổi cấu trúc phân tử và tăng cường tốc độ các quá trình phản ứng; kích hoạt hệ thống dẫn truyền tín hiệu nội bào và thay đổi quá trình tổng hợp các chất chuyển hóa trong cơ thể sinh vật Gần đây, một số nghiên cứu đã chỉ ra sóng siêu âm

là yếu tố đáng chú ý để xem xét sự ảnh hưởng của chúng đến sự lên men tổng hợp sợi nấm và các hoạt chất sinh học của một số nấm dược liệu [67, 75]

Xuất phát từ thực tế nghiên cứu và sự cấp thiết trên, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của trường xung sóng siêu âm trong lên men nấm thượng hoàng

(Phellinus linteus)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đề xuất được quy trình lên men nấm thượng hoàng (P linteus) với hỗ trợ

trường xung sóng siêu âm giúp tăng năng suất tổng hợp sinh khối và sinh tổng hợp polysaccharide

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của trường xung sóng siêu âm đến khả

năng sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide của nấm thượng hoàng

Nội dung 2: Ảnh hưởng một số điều kiện (cơ chất bổ sung, nhiệt độ, pH, …)

đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide của nấm thượng hoàng trong quá trình lên men có hỗ trợ trường xung sóng siêu âm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Tác động sóng siêu âm trong quá trình lên men chìm sục khí nấm thượng hoàng

để tăng sinh khối và sinh tổng hợp polysaccharide nội bào và ngoại bào

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

- Bước đầu đưa ra quy trình lên men nấm thượng hoàng có hỗ trợ sóng siêu âm

và hướng ứng dụng chế thực phẩm từ nấm thượng hoàng cho thấy tiềm năng ứng dụng

- Việc nghiên cứu thành công sẽ giúp nâng cao hiệu quả ứng sản xuất hoạt chất

và sinh khối tối ưu từ nấm thượng hoàng Góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm thượng hoàng

6 Tính mới của luận văn

- Xác định được ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng tăng sinh khối và sinh tổng hợp polysaccharide của nấm thượng hoàng

- Kết quả luận văn là công trình ở Việt Nam đầu tiên nghiên cứu ảnh hưởng của

trường xung sóng siêu âm trong lên men nấm thượng hoàng (P linteus T16) bằng

phương pháp lên men chìm sục khí, từ việc xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu

có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20kHz là ở cường độ 10 W/L trong 180 giây ở thời

điểm 120 giờ sau nuôi cấy Cho thấy năng suất sinh khối nấm P linteus T16, hàm

lượng polysaccharide nội bào và ngoại bào lần lượt tăng ương ứng 1,94; 2,26 và 1,85 lần so với đối chứng Cho thấy năng lượng sóng siêu âm có đem lại hiệu quả về năng suất và rút ngắn thời gian trong nuôi cấy thu sinh khối và hoạt chất sinh học của nấm

P linteus T16 Xác định một số điều kiện môi trường ảnh hưởng một đến quá trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm là: Dịch chiết bột ngô với tỉ lệ

10% được chọn là cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch thể nấm P linteus

T16 có hỗ trợ sóng siêu âm; pH 5,5, nhiệt độ 28°C được chọn là điều kiện tối ưu cho

nuôi cấy P linteus T16 trong môi trường dịch thể có hỗ trợ sóng siêu âm Bước đầu đưa ra quy trình lên men nấm P linteus T16 có hỗ trợ sóng siêu âm

7 Bố cục luận văn

Luận văn gồm 62 trang (không kể phụ lục), 13 bảng, 10 hình và 81 tài liệu tham khảo, được trình bày 3 chương trong 7 phần lớn: Mở đầu (4 trang); Tổng quan (23 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (10 trang); Kết quả và thảo luận (13 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Tài liệu tham khảo (10 trang); Phụ lục (1

trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm thượng hoàng

Chi Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

châu Mỹ, châu Phi và Đông Á (đặc biệt là Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc), ở Việt Nam có khoảng 26 loài Chúng được sử dụng để phòng và chữa rối loạn chức năng tiêu hóa, tiêu chảy, xuất huyết, dị ứng, bệnh tiểu đường và ung thư

[78] Trong các nghiên cứu nhằm sử dụng nấm Phellinus vào phương pháp điều trị

trong Tây y, nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của các dịch chiết

từ quả thể (hoặc sợi nấm) của nấm thượng hoàng in vitro và in vivo [78]

Nhiều báo cáo khoa học đã tập trung vào hoạt tính sinh học của các loài nấm này [58, 69] trong khi các hợp chất có hoạt tính sinh học, chức năng chống ung thư,

và các cơ chế dược lý của P linteus đã được báo cáo tổng kết năm 2008 [78] Đây là

tổng quan đầy đủ về tinh chế các sản phẩm tự nhiên và khả năng ứng dụng chữa bệnh

của loài P linteus, đặc biệt là hợp chất có phân tử lượng nhỏ có hoạt tính sinh học,

cũng như các tác dụng dược lý chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, chống oxy hóa, kháng viêm, chống tiểu đường và hoạt tính kháng khuẩn

Chi Phellinus có một số loài (P linteus, P ribis, P igniarius) đã được dùng

trong việc chữa bệnh ung thư, tiểu đường, nhiễm trùng do vi khuẩn và virus, và viêm

loét [39, 40] P linteus được sử dụng như một thành phần bổ sung vào các loại thực

phẩm ở khu vực Đông Á [78] Trong vài thập kỷ qua, một số lượng lớn các hợp chất

hóa học đã được phân lập từ nấm Phellinus [39, 40, 78] Thành phần chính của chúng

là các polysaccharide - thành phần chính tạo ra hoạt động chống ung thư của nấm thượng hoàng Ngoài ra còn có các thành phần khác như proteinpolysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane và polychlorinat, ergosterols, acid agaricic, acid béo, acid aromatic,…[57]

1.1.1 Vị trí nấm thượng hoàng trong phân loại nấm học

Theo tác giả Trịnh Tam Kiệt (2011) [6], nấm thượng hoàng thuộc:

1.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm thượng hoàng

Nấm thượng hoàng có màu vàng, đường kính 6-12 cm, dày khoảng 2-10 cm, hình bán nguyệt, dạng nhẵn, tròn và hình dạng rất đa dạng Bề mặt có màu sậm, lông ngắn và dần mất đi khi trưởng thành, khi đó nấm ngả sang màu đen hoặc vàng sậm,

bề ngang và bề dọc khác biệt hẳn Mặt chính giữa thường có màu vàng sáng, mặt dưới màu sẫm Đây là loài nấm hóa gỗ, thường mọc ở những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh nên tuổi nấm có khi lên tới hàng chục năm.Loài nấm này thường phát triển trên thân hoặc gốc cây dâu tằm Phương pháp nhân giống truyền thống là cấy giống nấm vào gỗ khúc (phổ biến ở Hàn Quốc); sau khi hệ sợi nấm lan đầy, các khúc gỗ sẽ được treo, hoặc đặt trên mặt đất để nấm mọc ra và thời gian này kéo dài khoảng 2-3 năm [8] Ưu điểm của phương pháp này là môi trường nuôi trồng khá tự nhiên, gần với môi trường phát triển của nấm ngoài tự nhiên Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là thời gian thu hoạch được nấm khá dài, tốn diện tích nuôi trồng Bên cạnh đó việc đặt khúc gỗ dưới đất dễ bị mối mọt, côn trùng, nấm bệnh xâm nhập phá hủy Nếu đặt lên cao thì gỗ dễ bị mất nước, vì vậy cần phải chú

ý cung cấp nước thường xuyên [2]

Hình 1.1 Quả thể nấm thượng hoàng [80]

1.1.3 Phân bố

Hiện nay, tổng sản lượng của các loài nấm Phellinus trên thế giới chỉ khoảng

30 tấn/năm, chủ yếu từ thu hái hoang dại Trên thế giới cũng chỉ có 4 nước trồng phổ biến loài nấm này là Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Việt Nam là nước

có khá nhiều loài nấm Phellinus, tuy nhiên cũng bị khai thác cạn kiệt, tận thu và khó

gặp nếu không đi sâu vào các vùng rừng nguyên sinh Hiện tại, nấm thượng hoàng được bán tại Việt Nam chủ yếu là dưới dạng quả thể và nhập khẩu từ Hàn Quốc Như tại Hàn Quốc, đất nước đi đầu về công nghệ trồng nấm thượng hoàng phải mất từ 2 đến 3 năm trồng trên giá thể là các khúc gỗ để thu hoạch được quả thể nấm có giá trị thương phẩm khi đưa ra thị trường Giá của nấm thượng hoàng đắt gấp 3 đến 4 lần so với nấm linh chi được trồng và thu hoạch theo cùng một thời gian

Việc nghiên cứu để trồng nấm thượng hoàng tại Việt Nam đã bắt đầu từ những năm 2010, với nghiên cứu của một nhóm cán bộ tại Trung tâm nghiên cứu linh chi

và nấm dược liệu, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nhóm đã bước đầu

nghiên cứu và nuôi trồng thành công loài nấm thượng hoàng P linteus trong bịch mạt

cưa gỗ cao su, năng suất khoảng 140 kg/năm, sản phẩm nấm sau khi thu hoạch được bảo quản bằng cách sấy khô để đưa bán ra thị trường trong nước và xuất khẩu thô ra nước ngoài [8] Thời gian cho thu hoạch quả thể là 9 tháng, rút ngắn hơn nhiều so với thời gian trồng nấm trên khúc gỗ là 2 đến 3 năm Như vậy việc nuôi trồng nấm trên giá thể sẽ kéo dài hơn rất nhiều so với khi nuôi chúng trong môi trường lỏng Ngoài

ra, nấm thượng hoàng thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ thấp, ở vùng rừng núi cao,

do đó khí hậu nóng vào mùa hè của Việt Nam sẽ làm cho nấm mọc chậm

1.1.4 Thành phần hóa học của nấm thượng hoàng

1.1.4.1 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm thượng hoàng

Các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng của nấm thượng hoàng cho thấy đây

là một loại nấm có giá trị dinh dưỡng và có nhiều hợp chất có chứa hoạt tính sinh học Tuy nhiên, phụ thuộc vào vị trí địa lý, tuổi đời của nấm nên hàm lượng của các thành phần này có sự khác nhau Các nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm thượng hoàng thì tương đối nhiều nhưng nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng thì còn ít Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của một

số loại nấm thượng hoàng ở Hàn Quốc được thể hiện qua bảng dưới đây [73]:

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm thượng hoàng

Thành phần, hàm lượng acid amin và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng của nhóm nghiên cứu Lee và cộng sự được thể hiện ở bảng 1.2 và 1.3 sau đây [41, 42]:

Bảng 1.2 Thành phần và hàm lượng acid amin trong quả thể nấm thượng hoàng

Acid amin Dịch chiết ethanol

(mg/100g nấm khô)

Dịch chiết nước (mg/100g nấm khô)

Bảng 1.3 Thành phần khoáng và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng

Thành phần/chỉ tiêu Dịch chiết ethanol Dịch chiết nước

Kim loại (mg/100g nấm khô)

1.1.5 Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của nấm thượng hoàng

Trong nhiều thập kỷ qua, một số lượng lớn các thành phần hợp chất chuyển hóa

thứ cấp đã được phân lập từ P linteus Trong đó polysaccharide là thành phầm chính

và cũng là thành phần mang hoạt tính sinh học chính trong việc phòng chống ung thư

của nấm thượng hoàng Ngoài ra còn có một số nhóm chất khác bao gồm flavone, ergosterol, triterpenoid, hispidin Danh sách các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có trong nấm thượng hoàng và hoạt tính sinh học của chúng được trình bày trong Bảng 1.4 [8]:

Bảng 1.4 Hợp chất thứ cấp và hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng

chống ung thư và chống oxy hóa β-glucan Chống ung thư, tăng miễn dịch Steroid Episterol Ức chế tổng hợp cholesterol

Flavone,

pyranone và furan

Phellinusfuran A Terpenoid Sesquiterpenoid Kháng khuẩn, chống viêm, chống

oxy hóa, ức chế khối u Diterpenoid Kích thích tổng hợp yếu tố tăng

trưởng thần kinh, hạ đường huyết Triterpenoid Chống ung thư, di căn, chống lão

hóa, hỗ trợ tim mạch Styrylpyrone Hispidin Chống oxy hóa, gây độc tế bào,

kháng viêm, kháng virut, chống giảm trí nhớ

3,14′-Bihispidinyl Chống oxy hóa Hypholomine B Chống oxy hóa, chống tiểu đường,

kháng viêm Fasciculin A Chống oxy hóa Fasciculin B Chống oxy hóa Phelligridin C Gây độc tế bào Phelligridin D Gây độc tế bào Phellinin A1 Chống oxy hóa

1.1.6 Hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng

Theo y học phương Đông, nấm thượng hoàng có khả năng điều hòa miễn dịch mạnh và tăng chức năng miễn dịch Nấm cũng hiệu quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và tiểu đường, giảm căng thẳng Đặc biệt, nấm thượng hoàng có công dụng chống ung thư mạnh và ngăn ngừa sự phát triển của khối

u [78] Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh được rằng nấm thượng hoàng đóng

vai trò quan trọng trong việc cải thiện và nâng cao sức khỏe con người P linteus

thực hiện vai trò này là nhờ các thành phần mang hoạt tính sinh học bao gồm: polysaccharide, triterpenoid, polyphenol và pyrans Trong số đó polysaccharide và β-glucan được coi là một trong những chất quan trọng nhất và là một đối tượng tiềm năng để phát triển các loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên

1.1.6.1 Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính sinh học quan trọng nhất của Phellinus là chống ung thư được xác

minh từ nhiều nghiên cứu thực nghiệm về dược lý Năm 1968, Ikekaw và cộng sự

[29] lần đầu tiên phát hiện ra rằng chất chiết xuất từ quả thể của nấm P linteus có thể

ức chế tế bào sarcoma chuột (S180) với tỷ lệ 96,7% Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng polysaccharide là thành phần chính gây ra tác dụng chống ung thư [62] Những chiết xuất từ nấm thượng hoàng đã được sử dụng nhiều ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc trong nhiều thế kỷ để ngăn ngừa các bệnh đa dạng như rối loạn chức năng, xuất huyết, tiêu chảy và ung thư, đặc biệt có tác dụng mạnh gây ức chế kìm hãm sự phát khối u Dịch chiết nước nóng của 27 loài nấm thì nấm thượng hoàng cho tỉ lệ ức chế các khối u là cao nhất 96,7% so với nấm mèo là 42,6%, nấm vân chi là 77,5%, nấm linh chi là 64,9% [17]

Polysaccharide từ P linteus có thể làm ức chế tế bào ung thư tế bào gan hepG2

người Kết quả cho thấy các polysaccharide có nồng độ 0-1,0 mg/mL đã làm giảm đáng kể sự gia tăng tế bào HepG2 50% [70] Xue và cộng sự [71] phân lập một

polysaccharide hòa tan trong nước từ nấm P linteus có hoạt tính miễn dịch và chống

ung thư in vitro Hispolon của từ P linteus cũng có hiệu ứng chống lan truyền trên tế bào ung thư gan của người Hep3B [24] Protein polysaccharide từ P linteus với nồng

độ 125-500 mg/mL ức chế sự phát triển và hình thành khuẩn lạc của SW480 các tế

bào ung thư ruột kết của người [45] Polysaccharide chiết xuất từ P linteus

(125-1000 μg/mL) cũng có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và giảm biểu hiện β-catenin trong

tế bào SW480 [64] Jeon và cộng sự [31] phân lập một hợp chất chống ung thư

atractylenolid I từ chiết xuất etyl axetat của P linteus nuôi cấy trên gạo nâu và

atractylenolide I sau đó được sử dụng để đánh giá tác động ức chế trên các tế bào

HT-29

1.1.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa

Một số lượng lớn các nghiên cứu cho thấy trong nấm Phellinus có tính sinh học

khác nhau bao gồm chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, tác dụng hạ đường huyết, chống viêm, chống co giật… Rất nhiều các thành phần hóa học có hoạt tính chống

oxy hoá đã thu được từ Phellinus Hispidin được phân lập từ dịch nuôi cấy nấm của

P linteus được chứng minh là bảo vệ chống lại stress hydrogen peroxide gây ra oxy

hóa trong MIN6N β tế bào tuyến tụy Các kết quả chỉ ra rằng 1.0mM hispidin có tác dụng chống oxy hoá đối với gốc tự do, gốc hydroxyl và gốc tự do DPPH với tỷ lệ

56,8%, 95,3% và 85,5% [34] Dịch chiết 70% ethanol của quả thể nấm P linteus được

nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá, thu được kết quả đáng chú ý là ổn định gốc tự

do DPPH với IC50 là 22,07 μg/mL và ức chế sự peroxid hóa lipid với IC50 là 48,45 μg/mL [44]

1.1.6.3 Hoạt tính điều hòa miễn dịch

P linteus đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu cho một chất điều hòa miễn

dịch mạnh Năm 1996, Kim và cộng sự tinh sạch một polysaccharide từ môi trường

bào tử của P linteus và quan sát hiệu quả điều chỉnh miễn dịch của nó trong môi trường in vitro (100 mg/kg) và in vivo (0,01 đến 0,1 mg/mL) [36] Các polysaccharide phân lập từ P linteus cho thấy khả năng điều hòa hệ miễn dịch rất cao và khả năng

hỗ trợ điều trị cao [65]

1.1.6.4 Tác dụng hạ đường huyết

Theo một số nghiên cứu, các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên có hiệu quả chống tiểu đường rất tốt Nấm dược liệu chính là đối tượng được hướng đến với ưu điểm là rất giàu các hoạt chất có lợi Các nghiên cứu khoa học đã tập trung vào

Ganoderma lucidum, Inonotus obliquus, và P linteus, có hoạt chất được chứng minh

là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa béo phì do chế độ ăn uống giàu chất béo ở các loài gặm nhấm và đã giảm hiện tượng tăng đường huyết trong máu Các nhà khoa học

đã chứng minh được rằng hợp chất exopolysaccharide chiết xuất từ nấm thượng hoàng được nuôi trồng bằng phương pháp lên men trong môi trường lỏng có tác dụng

hạ đường huyết, cải thiện các tổn thương gan Mặt khác, các polysaccharide của nấm thượng hoàng ức chế biểu hiện của các cytokine viêm [65] Dịch chiết nước nóng của quả thể nấm thượng hoàng rất hữu ích trong việc điều trị bệnh tiểu đường bằng cách giảm tổn thương do sự oxy hóa của các tế bào đảo tụy, thúc đẩy bài tiết insulin [2, 28]

1.2 Công nghệ nuôi cấy chìm

1.2.1 Khái niệm

Nuôi cấy chìm (hay còn gọi là nuôi cấy dịch thể) là phương pháp được phổ biến rộng nhất trong quy trình lên men công nghiệp, vì có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trình một cách dễ dàng Hơn nữa, nó cần một bình lên men vô trùng quy mô lớn có thể cung cấp một môi trường được kiểm soát bao gồm nhiệt độ tối ưu, pH, mức độ khuấy trộn, nồng độ oxy, cho các vi sinh vật đang phát triển Quan trọng nhất, các chất dinh dưỡng có sẵn trong toàn bộ môi trường cho các vi sinh vật trong quá trình lên men ngập nước Kích thích tạo điều kiện cho sự phân phối

đồng đều các chất dinh dưỡng và các tế bào vi sinh vật So với phương pháp lên men

bề mặt, thì lên men chìm có nhiều ưu điểm đó là: ít choán bề mặt (không mất nhiều diện tích), dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi

Giống nấm dịch thể là giống được nuôi dưỡng trong môi trường dạng lỏng, có chế độ thông khí, khuấy, hoặc lắc liên tục, khiến sợi nấm sinh trưởng mạnh trong môi

trường dịch thể tầng sâu Phương pháp nhân giống nấm dạng dịch thể có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn như: chu kỳ sản xuất giống ngắn, tuổi giống đồng nhất, quả thể nấm đồng đều, dễ dàng điều khiển quá trình nhân giống, giá thành sản xuất giống thấp, quá trình cấy giống nhanh chóng giảm thiểu tỷ lệ nhiễm bệnh, tăng năng suất nấm thương phẩm Ngoài ra, phương pháp nhân giống nấm dạng dịch thể còn dễ dàng chuyển đổi quy mô sản xuất do có khả năng cơ giới hóa, công nghiệp hóa các giai đoạn trong quy trình nhân giống, nuôi trồng

Kỹ thuật nhân giống dạng dịch thể đã được quan tâm nghiên cứu từ rất lâu và

đã thành công với hơn 50 giống nấm khác nhau trong đó nhiều nhất là các loại nấm: nấm mỡ, nấm mộc nhĩ, nấm sò, nấm hương, kim châm, nấm sò đùi gà, linh chi, nấm trân châu, nhộng trùng thảo… Kết quả thử nghiệm cho thấy, hầu hết các hệ sợi nấm đều phát triển tốt trong điều kiện môi trường cơ chất dịch thể, cho giống nấm đạt chất lượng tiêu chuẩn [10]

Hiện nay, một số nước có công nghệ nuôi trồng nấm phát triển trên thế giới như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc đã sử dụng phương pháp lên men dịch thể để sản xuất nấm chủ yếu các loại nấm như kim châm, đùi gà, ngọc châm Tuy nhiên, việc sản xuất giống nấm dạng dịch thể đòi hỏi các điều kiện kiểm soát chặt chẽ về nguồn dinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ thoáng khí, pH, thời gian lên men Quá trình lên men cần được kiểm soát bằng các trang thiết bị hiện đại, đồng bộ và tổ chức thực hiện một cách khoa học Do đó, cho đến nay ở Việt Nam kỹ thuật này vẫn chưa được áp dụng rộng rãi [10]

Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nấm thượng hoàng nuôi theo mô hình lên men thu sinh khối đạt chất lượng tốt và cho các hoạt chất tương tự như với nấm nuôi trồng thông thường trên giá thể thân gỗ mục [4] Hơn thế nữa, các hoạt chất sinh học thu được từ nấm thượng hoàng có sự cải thiện về hàm lượng và độ tinh khiết qua quá trình lên men lỏng [79] Ngoài ra, ưu điểm của phương pháp nhân nuôi sinh

khối là quá trình nuôi trồng có thời gian ngắn hơn rất nhiều so với trồng nấm trên thân gỗ (thường là 2-4 năm)

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy chìm

1.2.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất

Cacbon đóng vai trò quan trọng với tế bào, tham gia vào các hợp chất cấu trúc

và dự trữ trong tế bào như monosaccharide, disacharide và polysacharide Nguồn dinh dưỡng cacbon thích hợp sẽ kích thích hệ sợi nấm sinh trưởng nhanh, tạo sinh khối lớn [1, 23]

Nitơ là nguyên tố thiết yếu cần thiết cho tất cả các loại nấm để tổng hợp các hợp chất quan trọng như purin, pyrimidine, protein và N-acetylglucosamine, thành phần tham gia cấu tạo nên chitin, hợp chất của thành tế bào [52]

1.2.2.2 Ảnh hưởng của pH

Mỗi loài nấm đều sinh trưởng, phát triển thuận lợi ở giá trị pH nhất định pH có ảnh hưởng đến sự tiết các enzym ngoại bào trong chất nền Các enzym ngoại bào thường thể hiện hoạt động trong một phạm vi pH hẹp và có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình chuyển hóa chất dinh dưỡng của nấm [52] Zagrean và cs (2016) [74] cho

rằng, tốc độ phát triển của hệ sợi nấm P eryngii phụ thuộc vào bản chất môi trường

và pH của nó Ngoài ảnh hưởng của pH đối với hoạt động của enzyme, sự phân ly của các phân tử thành các ion, cũng như tính thấm của màng đều bị ảnh hưởng bởi

pH

1.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng nhất đối với sự phát triển của sợi nấm [23] Mỗi chủng nấm sẽ phát triển và biểu hiện các đặc điểm sinh học tốt nhất tại ngưỡng nhiệt độ thích hợp, vì tại ngưỡng nhiệt độ này các phản ứng trao đổi chất, hoạt động của enzyme diễn ra mạnh Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzyme của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế

các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

1.2.2.4 Ảnh hưởng của sục khí

Lượng oxy hòa tan nhất định trong dịch lỏng nuôi giống nấm là điều kiện không thể thiếu trong quá trình nuôi giống Trong quá trình lên men, nấm lớn không ngừng tiêu thụ oxy và dinh dưỡng, khiến nồng độ oxy hòa tan luôn có xu hướng giảm xuống, chế độ sục khí phù hợp có thể thúc đẩy hòa tan oxy, nâng cao mức độ tiếp xúc với oxy, dinh dưỡng của sợi nấm Mỗi loại nấm có tốc độ sinh trưởng khác nhau dẫn đến khả năng tiêu thụ oxy và dinh dưỡng khác nhau Tuy nhiên nếu chế độ sục khí quá lớn sẽ gây tác động cơ học lớn từ môi trường vào hệ sợi nấm gây bất lợi cho sự sinh trưởng của hệ sợi

Theo nghiên cứu của một số các tác giả, sự thay đổi về tốc độ sục khí sẽ dẫn tới

sự thay đổi hình thái hệ sợi từ dạng hệ sợi nấm (filamentous) sang các khuẩn lạc cầu (pellets) và ngược lại; trong đó khuẩn lạc được đặc trưng bởi hệ sợi nấm phát triển mạnh, phân nhánh, đan xen bện chặt vào với nhau [7] Mức độ cấp khí ảnh hưởng nhiều đến sự sinh trưởng của sợi nấm, thông thường thì trong giới hạn cho phép, chế

độ cấp khí càng cao thì mật độ khuẩn lạc cầu càng nhiều, sinh khối sợi càng tăng Tuy nhiên nếu chế độ khí quá mạnh thì sinh khối sợi lại giảm, do tốc độ cao tạo ra lực cắt lớn làm giảm sự tăng trưởng của sợi nấm

1.3 Ứng dụng siêu âm trong công nghệ nuôi cấy vi sinh vật

1.3.1 Định nghĩa sóng siêu âm

Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phân tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người tức là trên 16 kHz [22] Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất sóng dọc hay sóng nén, nghĩa

là trong trường siêu âm các phân tử dao động theo phương cùng với phương truyền sóng

1.3.2 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm

1.3.2.1 Hiện tượng xâm thực khí

Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân

tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa Áp lực âm trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ Bọt khí trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí tạm thời Bọt khí ổn định là nguồn gốc của những bong bóng khí nhỏ, kích thước của chúng dao động nhẹ trong các chu trình kéo và nén Sau hàng ngàn chu trình, chúng tăng thêm về kích thước [38]

Trong suốt quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể chuyển thành bọt khí tạm thời Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng “sốc sóng”

và hình thành dòng nhiệt bên trong chất lỏng Bọt khí ổn định có thể lôi kéo những bọt khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt nhỏ Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh chóng, chỉ qua vài chu trình chúng

bị vỡ ra Trong suốt chu trình kéo/nén, bọt khí kéo giãn và kết hợp lại cho đến khi đạt được cân bằng hơi nước ở bên trong và bên ngoài bọt khí Diện tích bề mặt bọt khí trong chu trình kéo lớn hơn trong chu trình nén, vì vậy sự khuyếch tán khí trong chu trình kéo lớn hơn và kích cỡ bọt khí cũng tăng lên trong mỗi chu trình Các bọt khí lớn dần đến một kích cỡ nhất định mà tại đó năng lượng của sóng siêu âm không đủ

để duy trì pha khí khiến các bọt khí nổ tung dữ dội Khi đó các phân tử va chạm với nhau mãnh liệt tạo nên hiện tượng “sốc sóng” trong lòng chất lỏng, kết quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao (5000oC và 5x104kPa) với vận tốc rất nhanh 106oC/s [38]

Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứng do có sự hình thành các ion tự do trong dung dịch; thúc đẩy các phản ứng hóa học nhờ có sự trộn lẫn các chất phản ứng với nhau; tăng cường phản ứng polymer hoá và depolymer hóa bằng cách phân tán tạm thời các phần tử hay bẻ gãy hoàn toàn các liên kết hóa học trong

chuỗi polymer; tăng hiệu suất đồng hoá; hỗ trợ trích ly các chất tan như enzyme từ tế bào động vật, thực vật, nấm men hay vi khuẩn; tách virus ra khỏi tế bào bị nhiễm; loại bỏ các phần tử nhạy cảm bao gồm cả vi sinh vật [38]

Hình 1.2 Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí trong siêu âm [81]

1.3.2.2 Hiện tượng vi xoáy

Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sự kích thích mãnh liệt Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy Hiện tượng này làm giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở một vài trường hợp mà khuấy trộn thông thường không đạt được [38]

1.3.2.3 Quá trình sủi bong bóng

Sủi bọt khí ổn định là sự sủi bọt khí từ sóng siêu âm có mức năng lượng thấp tạo ra những bọt khí có kích thước nhỏ và ít thay đổi trong suốt các chu trình nén và giãn nở Kết quả là kích thước của bọt khí tăng lên sau mỗi chu trình, sau nhiều chu trình nén và giãn nỡ, bọt khí sẽ đạt kích thước giới hạn mà năng lượng âm không còn khả năng giữ pha hơi ở bên trong Đến chu trình nén tiếp theo, hơi bất chợt ngưng tụ

và những bọt khí sẽ vỡ Trong suốt quá trình siêu âm, sự sủi bọt khí ổn định có thể trở thành sự sủi bọt khí nhất thời hay có thể đồng thời xảy ra [68]

1.3.3 Phân loại sóng âm

Dựa vào tần số, sóng siêu âm được chia làm 3 loại [30]:

- Siêu âm tần số thấp (siêu âm năng lượng cao) (20 – 100 kHz): Khi đó có sự hình thành và vỡ ra của các bong bóng khí có kích thước lớn sẽ làm cho nhiệt độ và

áp suất tăng cao Do đó có khả năng làm thay đổi tính chất hóa lý của nguyên liệu Ngày nay siêu âm tần số thấp được ứng dụng để chiết xuất và phân tách, tăng tốc phản ứng hóa học, lên men vi sinh phụ trợ và nâng cao chất lượng trong ngành công nghiệp thực phẩm [50, 59, 76]

- Siêu âm tần số cao (siêu âm năng lượng thấp, siêu âm không phá hủy) 2MHz): Khi tần số cao, kích thước các bong bóng khí khá nhỏ nên quá trình sủi bọt diễn ra nhẹ nhàng, không làm thay đổi tính chất hóa lý của nguyên liệu nên thường dùng trong phân tích, xác định tính chất hóa lý, thành phần cấu trúc và trạng thái vật lý của thực phẩm [37]

(100kHz Siêu âm chẩn đoán (5-10MHz): Không có hiện tượng sủi bong bóng và là dòng

âm thanh để đo hệ số tốc độ và hấp thụ của sóng trong môi trường, dùng trong y học, phân tích hóa học

1.3.4 Ứng dụng của sóng siêu âm tần số thấp trong công nghệ lên men

Siêu âm tần số thấp (cường độ cao) như một kỹ thuật xử lý vật lý không nhiệt,

có mức tiêu thụ năng lượng thấp và giảm thời gian xử lý cũng như hiệu ứng nhiệt Do

đó, sóng siêu âm tần số thấp có thể cải thiện tính thấm của màng tế bào, tăng cường chuyển giao phối tử và sửa đổi cấu trúc phân tử Do đó, sóng siêu âm tần số thấp chủ yếu được sử dụng để chiết và tách, tăng tốc các phản ứng hóa học, đông lạnh, rã đông, làm khô, khử bọt và khử khí, đồng nhất hóa, nhũ tương hóa, thụ động hóa hoạt động của enzyme và bất hoạt của vi sinh vật Trong ngành công nghiệp thực phẩm, sóng siêu âm tần số thấp được sử dụng hiệu quả cho quá trình già hóa và trưởng thành, rửa giải dư lượng thuốc trừ sâu, làm sạch và khử trùng thực phẩm, khử nước thẩm thấu, xúc tác enzyme phụ, hỗ trợ lên men vi sinh [46, 49, 54, 61]

Siêu âm có tác dụng tạo hiệu ứng xâm thực khí, cơ học và nhiệt học Các hiệu ứng sinh học tích cực do siêu âm tần số thấp gây ra bao gồm (1) thay đổi tính thấm

của màng tế bào và tăng tốc độ phát triển của tế bào; (2) thay đổi cấu trúc phân tử và tăng cường các quá trình phản ứng; và (3) kích hoạt hệ thống dẫn truyền tín hiệu nội bào và thay đổi quá trình tổng hợp các chất chuyển hóa trong cơ thể sinh vật [46]

 Hiệu ứng xâm thực khí như đã nêu trên là sự hình thành các bong bóng nhỏ trong chất lỏng dưới tác động của sóng siêu âm và một loạt các quá trình động học như dao động hạt nhân bong bóng, tăng trưởng, co lại và xẹp xuống Sự xâm thực thoáng qua tạo ra nhiệt độ cao và áp suất cao trong tế bào, đồng thời tạo ra điện thế

và thế oxy hóa khử mạnh, có thể phá hủy cấu trúc tế bào hoặc phá vỡ tế bào, dẫn đến tổn thương đại phân tử hoặc chết tế bào [66] Sự tương tác giữa bong bóng và màng

tế bào (hiệu ứng kéo - đẩy) có thể làm tăng tính thấm của màng tế bào [53]; hiệu ứng điện tạo ra bởi sự xâm thực có thể làm thay đổi điện thế bề mặt của màng tế bào, và lực thẩm thấu làm tăng tính thấm của màng tế bào Trong khi đó, điện thế còn làm tăng tốc độ hoạt hóa các kênh canxi, làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào và rút ngắn chu

kỳ sinh trưởng của tế bào [13]

 Hiệu ứng cơ học siêu âm đề cập đến cách truyền sóng siêu âm trong môi trường làm cho khối lượng trung bình dao động, thúc đẩy quá trình chuyển khối sinh học Lực cơ học này có thể thúc đẩy cơ chất đi vào vị trí hoạt động của chất xúc tác vi sinh vật, tăng cường ái lực giữa cơ chất và enzyme, đồng thời cải thiện tốc độ của các phản ứng sinh học Một lực cắt vi tia được tạo ra bởi hiệu ứng cơ học, lực này tác động lên

tế bào, tạo thành khoang trên bề mặt màng tế bào, làm tăng tính thấm của màng tế bào [46]

 Hiệu ứng nhiệt học siêu âm đề cập đến cách năng lượng dao động của sóng siêu âm được môi trường truyền liên tục hấp thụ và chuyển đổi thành năng lượng nhiệt, làm tăng nhiệt độ của môi chất Hiệu ứng nhiệt có thể cung cấp một môi trường phản ứng lý tưởng cho các phản ứng cơ chất - enzyme [48] Thông qua hiệu ứng nhiệt, tế bào hấp thụ năng lượng siêu âm và nhiệt độ của các mô sinh học tăng lên; điều này dẫn đến tăng tính lưu động và tính thấm của màng tế bào chất Sự hình thành các khoang màng tế bào và sự gia tăng tính lưu động đẩy nhanh quá trình vận chuyển

và trao đổi các trạng thái phụ bên trong và bên ngoài tế bào, thúc đẩy sự phát triển và tái tạo tế bào, đồng thời tăng sản xuất chất chuyển hóa

Khi được sử dụng trong chế biến thực phẩm, tác động cơ học và tạo bọt sóng siêu âm ảnh hưởng đến chất nền nuôi cấy lên men, chất nền enzyme, chất xúc tác sinh học và cấu trúc phân tử chất chuyển hóa Những hiệu ứng siêu âm này cũng cải thiện môi trường hệ thống phản ứng, nâng cao hiệu suất phản ứng và tăng cường quá trình phản ứng [32]

 Thứ nhất, đối với tác động của sóng siêu âm trên chất nền, sóng siêu âm có thể thúc đẩy việc giải phóng các vị trí hoạt động của chất nền lớn trong quá trình lên men hoặc chất nền enzyme Điều này đạt được thông qua biến tính vật lý nhẹ, chẳng hạn như phá vỡ protein và nhắm mục tiêu đoạn peptide, và tăng cường sử dụng chất dinh dưỡng chiến lược phụ và làm giàu chất chuyển hóa [32]

 Thứ hai, đối với tác động của sóng siêu âm lên chất xúc tác sinh học, sóng siêu

âm có thể điều chỉnh trung tâm hoạt động của enzyme, cải thiện sự phân bố của các nhóm và lực giữa các phân tử của chất xúc tác sinh học, giảm số lượng các cuộn xoắn không đều trong cấu trúc phân tử, thúc đẩy sự hình thành của trạng thái chuyển tiếp

có hoạt tính cao của các enzyme, và cải thiện ái lực giữa cơ chất và enzyme [12]

 Thứ ba, đối với tác động của sóng siêu âm lên sản phẩm và quá trình phản ứng, hiệu ứng chuyển khối cơ học thúc đẩy quá trình khuếch tán sản phẩm và chuyển sản phẩm ra ngoài tế bào [77]

 Hiệu ứng siêu âm cũng thúc đẩy sự hình thành các nhóm chức năng và cấu trúc phân tử cụ thể trong sản phẩm và ảnh hưởng đến tính chất và hoạt động của sản phẩm [51, 60] Hơn nữa, siêu âm có thể cải thiện môi trường hệ thống phản ứng, siêu

âm tạo bọt làm tăng số lượng bong bóng trong môi trường, làm tăng không gian trao đổi khí và chất lỏng và tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường [55] Đồng thời, sự

vỡ nhanh chóng của bong bóng tạo ra một môi trường được đặc trưng bởi quá trình oxy hóa gốc tự do, nhiệt độ và áp suất cao và các phản ứng hóa học được tăng tốc [11]

Các hiệu ứng xâm thực, cơ học và nhiệt học của siêu âm ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tổng hợp trao đổi chất của sinh vật, chủ yếu trong phản ứng phòng vệ trước môi trường căng thẳng Siêu âm kích hoạt các phân tử tín hiệu trong cơ thể, khi liên kết với các thụ thể nội bào, trở thành các chất kích thích phiên mã hoạt động theo các trình tự điều hòa cụ thể để bắt đầu phiên mã

và biểu hiện gen, đồng thời tổng hợp các chất chuyển hóa [25]

Khi siêu âm tác động lên một sinh vật, nhiều hiệu ứng sinh lý được tạo ra có thể dẫn đến việc tăng cường các quá trình sinh học thông qua các cơ chế khác nhau Điều kiện sóng siêu âm thích hợp có thể thúc đẩy sự phát triển của các tế bào vi sinh vật và sự tổng hợp các chất chuyển hóa có lợi như mô tả ở trên Tuy nhiên, khi siêu

âm đạt đến một ngưỡng nhất định, các hiệu ứng xâm thực, cơ học và nhiệt học sẽ tạo

ra nhiệt độ cao, áp suất cao và các gốc tự do Những chất này có thể gây ra sự phá hủy cấu trúc tế bào và cắt đứt các đại phân tử sinh học hoặc những thay đổi về hình thái gây ra những tổn thương không thể đảo ngược, do đó ức chế các quá trình sinh học Do đó, những liều siêu âm cao này chủ yếu được sử dụng cho các quá trình như khử trùng phụ trợ và làm giảm hoạt động của enzyme

1.4 Tình hình nghiên cứu

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có một vài nghiên cứu về điều kiện lên men chìm sục khí nấm thượng hoàng, tuy nhiên số lượng không nhiều, đều là các nghiên cứu đã lâu và cũng chưa có các sản phẩm ứng dụng Cụ thể như sau:

Choi và cộng sự (2000) đã nuôi cấy sợi nấm P linteus bằng cách sử dụng máy

lên men thùng có khuấy và máy lên men không khí và so sánh hiệu suất của hai máy lên men Ảnh hưởng của tốc độ sục khí và tốc độ khuấy đối với việc nuôi cấy sợi nấm

P linteus cũng được nghiên cứu trong khoảng 1-4L/phút, 200-300 vòng/phút Khối

lượng khô cuối cùng lớn nhất của sợi nấm thu được khi tốc độ khuấy là 300 vòng/phút Nồng độ oxy hòa tan được tăng lên với tốc độ khuấy Trọng lượng khô của sợi nấm

và nồng độ oxy hòa tan trong thiết bị lên men thùng khuấy liên tục lớn hơn so với trọng lượng trong thiết bị lên men không khí [18]

Kim và cộng sự (2001) đã có bước đầu nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sinh khối polysaccharide trong nấm thượng hoàng được nuôi cấy chìm Kết quả cho thấy sự phát triển của sợi nấm và sản xuất polysaccharide ngoại bào của

P linteus là tối ưu ở pH 5 và 25oC Sản lượng sinh khối tối đa (14,2 g/L sau 15 ngày nuôi trồng, trong khi đó, polysaccharide ngoại bào là tối đa (3,5 g/L sau 21 ngày) [35]

Lee và cộng sự (2008) đã nghiên cứu tối ưu các thành phần môi trường nuôi cấy chìm sục khí nấm thượng hoàng để sản xuất lượng lớn polysaccharide [43]

Thành phần môi trường tối ưu để sản xuất P linteus được xác định như sau: fructose

40 g/L; chiết xuất nấm men 20g/L; K2HPO4 0,46 g/L; KH2PO4 1,00 g/L; MgSO4.7H2O 0,50 g/L; FeCl2.6H2O, 0,01 g/L; MnCl2.4H2O 0,036 g/L; ZnCl2 0,03 g/L; CuSO4.7H2O 0,005 g/L Các điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định như sau: nhiệt độ 28℃; pH ban đầu 5,5; sục khí 0,6 vvm và khuấy 100 vòng/ phút Trong điều kiện và thành phần tối ưu, sinh khối sợi nấm tối đa đạt được trong bình lên men 5L là 29,9 g/L

Shu và cộng sự (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung natri clorua (NaCl) đối với việc sản xuất và chất lượng của exopolysaccharide từ nấm dược liệu

P linteus Việc bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy chìm P linteus ảnh hưởng

đáng kể đến hình thái, sản xuất exopolysaccharide (PLPS), trọng lượng phân tử trung

bình và hoạt tính sinh học của nó P linteus phát triển ở dạng sợi trong môi trường

không có NaCl, nhưng dạng cục trở nên chiếm ưu thế khi lượng bổ sung NaCl tăng lên Tốc độ tăng trưởng cụ thể giảm từ 0,18 xuống 0,01/ngày khi nồng độ NaCl tăng

từ 0,0 lên 2,0 g dm−3; tuy nhiên, năng suất sản phẩm cụ thể tăng từ 3,9 lên 98,4 mg/g (tăng 25,2 lần) Hàm lượng PLPS tăng 14,3 lần (từ 23 đến 329 mg dm-3) khi nồng độ NaCl tăng từ 0,0 lên 1,0 g dm−3 Kết luận rằng cả số lượng và hoạt tính sinh học của

PLPS có thể được tăng cường đáng kể bằng cách bổ sung NaCl thích hợp vào môi trường nuôi cấy chìm của nấm dược liệu [63]

Năm 2018, Cui và công sự nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát

triển của sợi nấm P linteus và sản xuất exopolysaccharide trong đó bằng cách nuôi

cấy chìm trong bể lên men 7L Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của sợi nấm ở giai đoạn lên men sớm và sản xuất exopolysaccharide ở giai đoạn lên men muộn lần lượt

là 26°C và 23°C Nhiệt độ lên men trong 0-60 giờ được kiểm soát ở 26°C và quá trình lên men trong 60-120 giờ được kiểm soát ở 23°C Sử dụng chiến lược kiểm soát nhiệt

độ hai giai đoạn, sinh khối sợi nấm tối đa là 8,92 ± 0,90 g/L và năng suất

exopolysaccharide tối đa là 95,25 ± 4,91 mg/L, tăng lần lượt là 58,8% và 12,7% so với được nuôi cấy dưới nhiệt độ ổn định 23°C Theo mức tiêu thụ đường khử trong quá trình lên men, môi trường lên men được điều chỉnh là (g/L): 27,5 glucose, 10 bột ngô, 5,0 cám, 2,5 bột bánh đậu tương, 0,15 MgSO4.7H2O, 3 KH2PO4 Sử dụng môi trường lên men đã điều chỉnh và nhiệt độ hai giai đoạn, sinh khối sợi tối đa thu được

là (9,97 ± 0,71) g/L và sản lượng polysaccharide ngoại bào là (94,03 ± 5,33) mg/L

[15]

Trên thế giới đã có những nghiên cứu ban đầu về ảnh hưởng của sóng siêu âm lên sinh tổng hợp sợi nấm và các hoạt chất sinh học của nấm dược liệu

Phellinus igniarius, một loại nấm thuốc quý hiếm thuộc họ

Hymenochaetaceae, rất giàu polysaccharide, axit amin, flavonoid, triterpene và phenolic Zhang và cộng sự (2014) nhận thấyhàm lượng polysaccharide nội bào của

sợi nấm P igniarius cũng được tăng lên đáng kể trong nghiên cứu về quá trình lên

men chất lỏng có hỗ trợ của sóng siêu âm Trong nghiên cứu này, siêu âm được áp dụng 3,8 ngày sau khi bắt đầu lên men, với thời gian tác động siêu âm là 65 phút

Sinh khối polysaccharide nội bào của sợi nấm P igniarius được xử lý bằng siêu âm

là 1.8002 g/L, cao hơn khoảng 22,64% so với đối chứng Hơn nữa, các polysaccharide

được phát hiện có khả năng chống oxy hóa in vitro mạnh Những thay đổi về hình

thái tế bào được quan sát bằng kính hiển vi đồng tiêu quét laze chỉ ra rằng siêu âm có

thể thay đổi hình thái và cấu trúc của sợi nấm P igniarius, đồng thời đẩy nhanh quá

trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa [75]

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) đã được sử dụng rộng rãi như một loại

thuốc truyền thống của Trung Quốc trong hàng nghìn năm Quá trình lên men lỏng

của G lucidum như một phương pháp để sản xuất hiệu quả triterpene đã nhận được

sự quan tâm rộng rãi của các nhà nghiên cứu trên toàn cầu.Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng siêu âm làm tăng đáng kể hàm lượng polysaccharide nội bào và ngoại bào (lần lượt là 18,48% và 35,90%) và flavonoid (tương ứng là 30,27% và 2,00%) đối với nhóm đối chứng [67] Xử lý siêu âm thúc đẩy tăng trưởng và tăng cường trao đổi chất

của G lucidum Quét hình ảnh kính hiển vi điện tử cho thấy xử lý siêu âm gây ra các

vết nứt vừa phải trong sợi nấm, sau thời gian phục hồi kéo dài trong 3 giờ, sợi nấm

đã được phục hồi với các nhánh tăng lên từ các điểm đứt gãy và cuộn chặt hơn Những phát hiện của chất chỉ thị Fluo-4/AM cho thấy rằng nồng độ ion canxi nội bào của sợi nấm được cải thiện sau khi điều trị bằng siêu âm, chứng tỏ ảnh hưởng thay đổi của sóng siêu âm đối với tính thấm của màng tế bào của sợi nấm Những kết quả này cho thấy siêu âm là một phương pháp hiệu quả để tạo ra nhiều sinh khối và các chất chuyển hóa của nấm linh chi trong quá trình lên men lỏng

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong nước đã bước đầu có sự quan tâm đến nuôi cấy, chiết xuất hoạt chất sinh học và các sản phẩm ứng dụng của nấm thượng hoàng

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2020)

đã có nghiên cứu phương pháp nhân sinh khối nấm thượng hoàng trong môi trường lỏng, nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới sự phát triển nhằm tạo năng suất cao nhất của sinh khối nấm Môi trường lỏng phù hợp cho chủng nấm phát triển tốt nhất đã được nhóm nghiên cứu tối ưu thành phần (cho 1 lít môi trường) gồm có: glucose 30g, cao nấm men 15g, K2HPO4 0,46g, KH2PO4 1g, MgSO4.7H2O 0,5g, MnCl2 0,0036g, ZnCl2 0,03g, FeCl2 0,01g, CuSO4.7H2O 0,005g Môi trường