Luận án tiến sĩ Sinh lý học: Nghiên cứu chế tạo màng tim bò vô bào gia cường bằng glutaraldehyde và gắn heparin đạt tiêu chí làm mảnh vá tim mạch

NHUNG KET QUA MỚI CUA LUẬN ÁN: Mang tim bò vô bào gia cường thỏa được phan lớn các tiêu chí của mảnh vá timmạch, nhưng gây đông máu và bám dính tiêu cầu trên bề mặt mang Heparin được cô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIET NAM NATIONAL UNIVERSITY - HO CHI MINH

UNIVERSITY OF SCIENCE

NGUYEN THI NGOC MY

STUDY ON THE FABRICATION OF GLUTARALDEHYDE

CROSSLINKED ACELLULAR BOVINE PERICARDIUM AND

HEPARIN IMMOBILIZATION TO MEET THE CRITERIA FOR

CARDIOVASCULAR PATCH

Doctoral Thesis

_ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM _TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phản biện 1: GS.TS Hoàng Nghia Sơn

Phản biện 2: PGS.TS Lê Quang Trí

Phản biện 3: PGS.TS Huỳnh Đại Phú

Phản biện độc lập 1: miễn

Phản biện độc lập 2: miễn

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Trần Lê Bảo Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Sinh lý học người và động vật, với tên

dé tài “NGHIÊN CUU CHE TAO MÀNG TIM BO VÔ BAO GIA CƯỜNG

BANG GLUTARALDEHYDE VA GAN HEPARIN ĐẠT TIÊU CHÍ LAMMANH VA TIM MACH” là công trình khoa học do Tôi thực hiện dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS Trần Lê Bảo Hà

Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và

không trùng lặp với các công trình đã công bố trong và ngoài nước

Nghiên cứu sinh

(Ký tên, ghi họ tên)

Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

LỜI CẢM ƠN

Luận án tiến sĩ được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y Sinh, Trường DH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn khoa học của

PGS.TS Trần Lê Bảo Hà Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Cô Trần

Lê Bảo Hà người đã tạo điều kiện thuận lợi, định hướng nghiên cứu và hướng dẫn tôi

hoàn thành luận án một cách tốt nhất

Tôi xin cám ơn ĐH Quốc gia Hồ Chí Minh đã tài trợ kinh phí cho các đề tài nghiên

cứu thuộc nội dung của luận án này Tôi xin cám ơn Trường ĐH Khoa học Tự nhiên,

DHQG-HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học, Phòng Khoa học và Công nghệ, Khoa Sinh

học — CNSH, và Bộ môn Sinh lý học & CNSH Động vật đã hỗ trợ tôi trong suốt quá

trình công tác, học tập và nghiên cứu tại Trường.

Tôi xin cắm ơn PTN Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y Sinh đã cho phép và tạo điều kiện

về cơ sở vật chất và thiết bị trong thời gian tôi thực hiện để tài Tôi xin cám ơn TS.BS

Bùi Quốc Thắng — BV Chợ rẫy đã hỗ trợ phẫu thuật cấy ghép mach máu trên thỏ và cácgóp ý về ứng dụng vật liệu trong lĩnh vực tìm mạch

Tôi xin cám ơn Thầy Cô công tác tại Bộ môn Sinh lý học và CNSH Động vật,

cùng tập thé nhóm nghiên cứu Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y Sinh (TEBM) đã trực tiếp hỗ

trợ công việc cũng như chia sẻ những khó khăn, những kỷ niệm buồn vui trong quá trình

thực hiện luận án.

Cuối cùng tôi xin dành sự tri ân chân thành nhất đến ba mẹ và những người thân

yêu trong gia đình của tôi đã luôn là điểm tựa vững chắc, quan tâm, cảm thông và động

viên tôi hoàn thành luận án này.

MỤC LỤC

LOI CAM ON.

MUC LUC dWẬ H iii

TRANG THONG TIN LUẬN ÁN TIENG VIỆT

TRANG THONG TIN LUẬN ÁN TIENG ANH -s<-ccccse+ viii DANH MỤC HÌNH ANH, BIEU DO.

DANH MỤC CAC BANG wessessssssssssccsscssssssssssssccsesssssssssssscesscusssssnssssssesesssesss xiii DANH MUC KY HIEU, CHU VIET TAT

1.2 Câu hỏi nghiên cứu

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

1.4 Nội dung và phạm vi nghiên CỨu - - - - +5 S+Sx*k tk grrưy 5

1.5.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của nghiên cứu ‹ -‹-x-++ 5

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU.

2.1 Khử tế bào mang tim bo

2.2 Gia cường màng ngoài tim bò vô bảo

2.3 Gắn heparin lên màng tim bò vô bào nhằm cải thiện tính tương hợp mau 25

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

3.1 Phương pháp khử tế bào màng tim bò

33

34

3.2 Phương pháp gia cường mang tim bò vô bao.

3.3 Phương pháp lắp ráp từng lớp để gắn heparin lên màng tim bò vô bào gia cường

— À 35

3.4 Phương pháp đánh giá mô hOC ¿+ ¿+ tt *vEEvsteteErrerekstrkrrrrre 35 3.5 Phương pháp tách chiết và định lượng DNA c2¿222+zcccczzeecsrr 36 3.6 Phương pháp đánh giá đặc tinh cơ lý của màng - - 55+ ccsc+xscsrercrx 36 3.7 Chụp kính hiển vi điện tử quét -2¿-2+++222++++2222E++222EE222EExerrrrrkrcree 36 3.8 Phương pháp khảo sát đặc tính phân huỷ sinh học in vitrO -. -: -+ 37

3.9 Phương pháp khảo sát đặc tinh tương hop mau in vitro của màng 37

3.10 Đánh giá độc tinh in vitro của màng tim bò vô bằng gia cường 39

3.11 Phương pháp định lượng heparin bằng thử nghiệm Toluidine Blue O 40

3.12 Đánh giá khả năng thai heparin sau khi cố định . - z2 Al 3.13 Đánh giá độc tinh in vitro của màng tim bò vô bao gia cường có có định heparin đối với tế bào nội mô người .-¿-+2++++222E++++22E+zretrrvrrrrrres 41 3.14 Đánh giá sự bám dính của tế bào nội mô trên màng MDH Al 3.15 Đánh giá sự tăng sinh của tế bào nội mô trên màng MDH - 42

3.16 Phương pháp cây ghép mẫu màng dưới da chuột :¿- 5+: 42 3.17 Phương pháp cây ghép mach máu của màng thử nghiệm trên thỏ 43

3.18 Phương pháp xử lý số liệu và thong kê

CHƯƠNG 4 KET QUA - BAN LUẬN s<©2-s<cccssscreesrrxssrrrsee 46 4.1 Nội dung 1 Nghiên cứu quy trình chế tao màng tim bò vô bào gia cường bằng glutaraldehyde và đánh giá theo tiêu chí mảnh vá tim mạch - + 46

4.2 Nội dung 2 Nghiên cứu phương pháp gắn heparin lên mang tim bò vô bao gia cường nhằm cải thiện đặc tính tương hop máu - -:- ¿222+++22+zz+rzss 63 4.3 Nội dung 3 Khảo sát ảnh hưởng của màng tim bò vô bào có gắn heparin lên sự bám dính và tăng sinh của tế bào nội mô -¿©++z+222++++22E+ztztvzvzerrrrke 78 4.4 Nội dung 4: Đánh giá tương hợp in vivo và khả năng cấy ghép mạch máu trên dOng vat thi mghiGm 0n 86

CHƯƠNG 5 KET LUẬN - KIÊN NGHỊ, - ss<©sseecxseervsee 98

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA NCS

PHỤ LỤC

TRANG THONG TIN LUẬN ÁN TIENG VIỆT

Tên dé tài luận án: Nghiên cứu chế tạo màng tim bò vô bào gia cường bằngglutaraldehyde va gắn heparin đạt tiêu chí làm mảnh vá tim mach

Ngành: Sinh lý học người và động vật

Mã số ngành: 9420104

Họ tên nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

Khóa đào tạo: 2018

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Lê Bảo Hà

Cơ sở đào tạo: Trường Đại hoc Khoa học Tự nhiên, DHQG-HCM

1 TOM TAT NỘI DUNG LUẬN ÁN:

Màng tim bò đã và đang được sử dung trong chế tao các mảnh vá tim mach Màngtim bò được xử lý loại tế bào và khâu mạch bằng glutaraldehyde nhằm hạn chế đáp ứng

miễn dịch, tăng cường độ bền và thời gian tồn tại trong cơ thé Khung nền ngoại bao

(ECM) từ mô mang tim cũng được chứng minh khả năng hỗ trợ quá trình tái tạo và sáp

nhập mô chủ Tuy nhiên, hai van đề tồn đọng của các mảnh vá tim mạch hiện nay là

khoáng hóa liên quan đến glutaraldehyde và bám dính huyết khối do thành phần ECM

cho phép các yếu tố đông máu và protein huyết tương thấm thấu và bám đính Do đó,

lĩnh vực chế tạo mảnh vá tim mạch từ màng tim bò vẫn đang được nghiên cứu Các tácnhân khử tế bào như Sodium dodecyl sulfate (SDS) và gia cường bang glutaraldehyde

cần được khảo sat và tối ưu Đề cải thiện đặc tính tương hợp máu, hướng tiếp cận gắn

heparin được xem là tiềm năng, nhờ vào hoạt tính chống đông máu của heparin Tuy

nhiên, các kết quả hệ thống về hiệu quả gắn heparin lên bề mặt mang tim bò vô bao gia

cường vẫn chưa được công bố Luận án tiến hành nghiên cứu chế tạo màng tim bò vôbào gia cường và gắn heparin nhằm đạt được tiêu chí làm mảnh vá tim mạch

Quy trình khử tế bào và gia cường màng tim bò được nghiên cứu Các đặc tínhcần có ở mảnh vá tim mạch như cơ tính, khả năng tồn tại, an toàn và tương hợp máu

cũng được khảo sát Từ quy trình chế tạo tối ưu, màng tim bò vô bào gia cường đã đạtđược phan lớn các tiêu chí đề ra Đặc tính tương hợp máu kém do khối máu đông và tiểucầu bám dính trên màng Trong giai đoạn tiếp theo, quy trình gan heparin lên màng bằng

phương pháp lắp ráp từng lớp có kết hợp Dihydroxy-iron (viết tắt DHI) được nghiên cứu

Kết quả cho thấy sau bảy chu kỳ lắp ráp, heparin được có định thành công và với hàm lượng cao hơn đáng kể so với phương pháp ủ đơn giản Heparin cũng có thể được thải

ra và duy trì bề mặt kháng đông máu Màng có cố định heparin cũng hạn chế sự bám

dính tiểu cầu và không gây tán huyết, do đó, chứng minh cho đặc tính tương hợp máu

của màng Sau 24 giờ thải heparin, màng thể hiện tính an toàn và hỗ trợ sự bám dính của

tế bào nội mô trên cả hai bề mặt màng So với bề mặt sợi, bề mặt thanh mạc của mang

cho phép duy trì sự tăng trưởng và bám dính của tế bào lên đến bảy ngày đánh giá Các

kết quả in vitro này giúp dự đoán màng tim bò vô bào có có định heparin có khả năng

chống đông máu tại thời điểm cấy ghép, màng có khả năng hỗ trợ nội mô hóa do đó giúp

duy trì đặc tính tương hợp máu của màng sau thời gian thải heparin Ở giai đoạn thử

nghiệm trên động vật, màng được chứng minh về tính tương hợp in vivo khi ghép trênchuột thí nghiệm Về thử nghiệm chức năng, màng được ghép vào động mạch cảnh của

thỏ thí nghiệm Tại thời điểm phẫu thuật cho phép tạo hình thành công, không có hiện tương chảy máu vết khâu và duy trì hoạt động của mạch máu Sau bảy tuần cấy ghép, so

với tình trạng tắc mạch ở nhóm màng thương mại, kết quả ban đầu chỉ ra mảnh ghép

mang tim bò vô bao cố định heparin đã duy trì trạng thái thông mạch, không xuất hiện

đông máu trong lòng mạch Đối với nhóm thí nghiệm này, tuy hiện tượng bao sợi hóa mảnh ghép vẫn diễn ra, mô mạch máu mới được hình thành và thống nhất với mạch máu

chủ, do đó, chỉ ra màng có khả năng được sử dụng làm mảnh vá mạch máu.

2 NHUNG KET QUA MỚI CUA LUẬN ÁN:

Mang tim bò vô bào gia cường thỏa được phan lớn các tiêu chí của mảnh vá timmạch, nhưng gây đông máu và bám dính tiêu cầu trên bề mặt mang

Heparin được cô định thành công lên màng tim bò vô bào gia cường theo nguyên

tắc lắp ráp từng lớp, với hàm lượng cao hơn đáng kể so với phương pháp ủ thông

thường

Mang tim bò vô bao gia cường có cố định heparin thé hiện đặc tính tương hợp

máu tốt, đồng thời cho phép nội mô hóa sau thời gian thải heparinMang tim bò vô bao gia cường có có định heparin thé hiện đặc tính tương hợp

sinh học in vivo

Ở đánh giá chức năng, trường hợp không xuất hiện huyết khối lòng mạch, mô

mạch máu mới hình thành và thống nhất với mô mạch máu chủ được ghi nhận

3 CÁC UNG DUNG/ KHẢ NĂNG UNG DỤNG TRONG THỰC TIEN HAYNHUNG VAN DE CON BO NGO CAN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU

Các cơ chế phân tử trong tương tác giữa màng, heparin và tế bào nội mô cần được nghiên cứu sâu hơn nhằm làm rõ cho tác động hỗ trợ nội mô hóa

Thử nghiệm chức năng của màng cần được thực hiện với số lượng động vật lớn

hon với thời gian dài nhằm khang định hiệu quả cây ghép

Các quy trình nghiên cứu khả năng được áp dụng trong thực tế chế tạo màng ghép

cho lĩnh vực tim mạch nói riêng và cho lĩnh vực y sinh nói chung (như trong nghiên cứu kỹ nghệ mô, làm màng điều trị ngăn trong nha khoa, thâm mỹ)

TẬP THE CAN BỘ HƯỚNG DAN NGHIÊN CỨU SINH

(Ký tên, họ tên) (Ký tên, họ tên)

Trần Lê Bảo Hà Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

XÁC NHAN CUA CƠ SO ĐÀO TAO

HIEU TRUONG

TRANG THONG TIN LUẬN ÁN TIENG ANH

Thesis information

Thesis title: Study on the fabrication of glutaraldehyde crosslinked acellular bovine pericardium and heparin immobilization to meet the criteria for cardiovascular patch Speciality: Human and animal physiology

Code: 9420104

Name of PhD Student: Nguyén Thi Ngoc My

Academic year: 2018

Supervisor: Assoc Prof Tran Lé Bao Ha

At: VNUHCM - University of Science

1 SUMMARY:

Bovine pericardium has been widely used for the fabrication of cardiovascular patches Bovine pericardium is decellularized and crosslinked with glutaraldehyde to minimize the immune response, improve mechanical strength and durability in vivo The extracellular matrix (ECM) from pericardial tissue has also been shown to support host tissue remodeling and integration However, calcification due to glutaraldehyde and thrombosis still remains ECM components of pericardium have also been shown to allow coagulation factors and plasma proteins to adsorption, facilitating thrombus formation on the graft surface Therefore, the field of cardiovascular patch fabricated from bovine pericardium is still being studied Decellularization using Sodium dodecyl sulfate (SDS) and glutaraldehyde crosslinking require detailed investigation and optimization To improve hemocompatibility, heparin immobilization has been considered as a potential approach due to the anticoagulant effect of heparin There is a lack of publications on the heparin immobilization of bovine pericardium after decellularization and glutaraldehyde crosslinking The present PhD thesis focuses on the fabrication of crosslinked acellular bovine pericardium and heparin immobilization to achieve the criteria for cardiovascular patch.

Decellularization and crosslinking of bovine pericardium was studied to acquire the cardiovascular patch criteria From the optimized fabrication process, the crosslinked acellular bovine pericardium (so-called GluABP) has achieved most of the proposed criteria However, the hemocompatibility is poor due to thrombus and platelet adhesion

on the membrane In the next stage, heparin immobilization of GluABP was studied according to the principle of layer-by-layer assembly The results showed that after seven assembly cycles, heparin was successfully immobilized and in significantly higher concentration than in simple incubation Heparin can also be released and maintain an anticoagulant surface during experimental duration The Heparinized GluABP was found to exhibit platelet and thrombus adhesion, thus demonstrating its hemocompatibility properties After 24 h of heparin releasing, heparinized GluABP demonstrated its safety and support endothelial cell adhesion on both sides of membrane surface Compared with the fibrous surface, the serosa surface of heparinized GluABP allowed the cell proliferation and adhesion for up to seven days of evaluation These in

transplantation, after heparin release, support endothelialization and thus maintain hemocompatibility The membrane was shown in vivo biocompatibility when grafted in laboratory mice In functional testing, GluABP was implanted into rabbit carotid artery.

At the time of post-surgery, GIuABP allowed successful reconstruction with no suture bleeding and vascularity maintenance After seven weeks, the preliminary result indicated vascular patency without thrombus in GluABP implantation For this GluABP group, although graft encapsulation still occurred, new vascular tissue was formed and integrated with the host blood vessel, thus indicating the membrane's potential for use as

Heparinized bovine pericardium exhibits good hemocompatibility and allows endothelialization when heparin releasing

Heparinized bovine pericardium exhibits in vivo biocompatibility

In functional assessment, vascular patency with no thrombus formation, new vascular tissue formation and integration with host vascular tissue was noted.

3 APPLICATIONS/ APPLICABILITY/ PERSPECTIVE

The molecular mechanisms in the interaction between membrane, heparin and endothelial cells need to be further studied to elucidate the endothelial supportive effect.

Vascular patch function assessment should be performed in larger numbers of animals in a longer period of time to confirm implantation efficacy.

The established procedures in this thesis can be applied in practice to fabricate graft membranes for the cardiovascular field in particular and for the biomedical field in general (such as in tissue engineering research, as barrier membrane in dentistry surgery, and plastic surgery, etc.)

SUPERVISOR PhD STUDENT

Tran Lé Bao Ha Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

CERTIFICATION UNIVERSITY OF SCIENCE

PRESIDENT

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIÊU ĐÒ

Danh mục hình ảnh

Hình 2.1 Vị trí của màng ngoài tim và cầu tạo của màng ngoài tim

Hình 2.2 Hình thái bề mặt của màng tim bò trước và sau khi khử tế bào

Hình 2.3 Phản ứng gia cường collagen bằng glutaraldehyde

Hình 2.4 Cơ chế tương tác máu với bề mặt vật liệu 26

Hình 4.1 Hình ảnh nhuộm H&E màng tim bò thô - -¿- ¿+ s5 2+ >£vs+£+xzxzesxz 46 Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm H&E các mẫu màng tim sau xử lý bằng các nồng độ SDS l0 1N 48

Hình 4.3 Hình ảnh đại thể các nhóm màng thử nghiệm sau khi được gia cường bằng glutaraldehyde Hình 4.4 Đánh giá khả năng tạo huyết khối và bám dính tiểu cầu

Hình 4.5 Thử nghiệm độc tính tiếp xúc trực tiếp — Hình thái tế bào 24 giờ đặt mẫu và nhuộm Crystal Violet Hình 4.6 Thử nghiệm độc tính gián tiếp qua dịch chiết — Hình thái tế bào sau 24 giờ nuôi cây và sự hình thành tinh thé formazan trong thử nghiệm MTT - 61

Hình 4.7 Đánh giá mô học phản ứng sau 1 tháng ghép mau đưới da chuột 62

Hình 4.8 Sơ đồ mô tả các nhóm nghiệm thức khảo sát quy trình gắn heparin lên mang tim bO VO bao gia CUON 8N ố 63

Hình 4.9 Hình anh đại thé các mẫu màng sau khi gắn heparin - + 64

Hình 4.10 Hình ảnh nhuộm H&E cấu trúc các nhóm mang thử nghiệm 65

Hình 4.11 Đánh giá SEM cấu trúc màng ở các nghiệm thức khảo sát 66

Hình 4.12 Đánh giá định lượng heparin bằng thử nghiệm TBO -.- 68

Hình 4.13 Quan sát đại thé mẫu màng ở thử nghiệm huyết khối -.- 69

Hình 4.14 Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét các mẫu sau khi được ủ với huyết tương giàu tiểu cầu

Hình 4.15 Thử nghiệm tán huUyyỀt - - - - c5 E2 StSvEvEESkEEkrerekekskrkrkrrrrrrkrree 71

Hình 4.16 Thử nghiệm huyết khối sau khi mang được ngâm thai heparin trong 30 ngày

Hình 4.17 Hình thái và tỷ lệ tăng trưởng tương đối của HUVEC trong các dung dịch thử

Hình 4.25 Hình ảnh nhuộm Von Kossa các nhóm màng GluBP, MDH và TM sau 4, 8

và 12 tuần ghép dưới đa chuột -2 ©22+++22E+2+t22EE3+222231112222112221111 212112 221 §9

Hình 4.26 Quan sát đại thé vị trí ghép màng sau phẫu thuật và sau 7 tuần ghép 92Hình 4.27 Quan sát đại thé mặt cắt lòng ống ghép và đánh giá mô học H&E 93

Hình 4.28 Đánh giá mô học nhóm MDH và nhóm RK 94

Danh mục biểu đồ

Biểu đỗ 4.1 Biểu dé thể hiện hàm lượng DNA trong các mẫu màng thí nghiệm 49

Biểu đồ 4.2 Độ dày của mang tim bò vô bào và các nhóm mang thử nghiệm gia cườngbằng glutaraldehyde -2+-©222+22EE++2222211122221112221112221111221111122111121211 E11 51

Biểu dé 4.3 Độ bền kéo của mang tim bò vô bào và các nhóm màng thử nghiệm gia

DU bang glutaraldehyde BS 52Biểu đồ 4.4 Độ biến dạng của màng tim bò vô bào và các nhóm màng thử nghiệm gia

cường bằng glutaraldeliyde - 2s-©22222++22E+22t2222122221111227111122111127711222711 ecrx 53

Biểu dé 4.5 So sánh độ dày và đặc tính cơ học của màng chế tạo với màng thương mại

VaASCUtek Ta 53

Biểu đỗ 4.6 Phân huỷ in vitro của màng tim bò vô bao gia cường -.- 56

Biểu đỗ 4.7 Sự phân hủy sinh học in vitro của các mẫu màng - + 57

Biểu đô 4.8 Biểu đồ hàm lượng heparin sau 30 ngày thử nghiệm thải 73 Biểu đồ 4.9 Biểu đồ thử nghiệm CCK-8 đánh giá tăng sinh HUVEC trên bề mặt sợi và

bề mặt thanh mac của màng MDH ¿+ 6S SvEvEEk+tEEEEEekekekskrkrkrrrerrkrrree 82

DANH MỤC CÁC BANG

Bảng 2.1 Các sản pham mảnh vá thương mại chế tao từ mang tim bò 20

Bảng 2.2 Tiêu chí của màng chế tạo từ màng tim bò làm mảnh vá tim mach

Bảng 2.3 Nghiên cứu về heparin hóa vật liệu sinh học có nguồn gốc từ mô khử tế bào

31

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIET TAT

ABP Màng tim bò vô bào

AT Antithrombin

ATCC American type culture collection

BP Mang tim bo

CCK-8 Bo kit Cell Counting Kit-8

DHI Phân tử dihydroxy-iron

DMSO Hóa chất dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

DNase Deoxyribonuclease

ECM Chất nền (hoặc khung nên) ngoại bào

EDC Hóa chất 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide

FBS Huyết thanh bào thai bò

GAG Glycosaminoglycan

Glu Hóa chat glutaraldehyde

GluBP Mang tim bò gia cường bang glutaraldehyde

H&E Chất nhuộm hematoxylin va eosin

HUVEC Tế bao nội mô tĩnh mạch cuống rén người

LbL Phương pháp lắp ráp từng lớp

M Nhóm thí nghiệm màng tim bò vô bào gia cường

MD Nhóm thí nghiệm màng M chỉ ủ trong dung dịch DHI

MDH Nhóm thí nghiệm màng M và gắn heparin theo phương pháp LbL

MDH-r24 Nhóm thí nghiệm màng MDH sau 24 giờ rửa thải heparin

MH Nhóm thí nghiệm màng M và gắn heparin bằng cách ủ đơn giản

MTNM Môi trường nuôi cấy tế bào nội mô

nBP mảng tim bò thô, chưa xử lý

NHS Hóa chất N-hydroxy succinimide

OD Optical density

PAA Hóa chat peracetic axit

PBS Dung dich muối đệm phosphat

PDADMAC Poly(diallyldimethyl amoni clorua)

RGR Relative growth rate

RK Nhóm thí nghiệm mach máu không được ghép mang

SDS Hóa chất sodium dodecyl sulfate

SEM Kính hiển vi điện tử quét

TAT Phức hợp thrombin và antithrombin III

TM Nhóm thí nghiệm màng thương mại

THUẬT NGỮ ANH - VIỆT

Thuật ngữ Anh Thuật ngữ Việt

American type culture collection ngân hàng chủng chuân Hoa Ky

bovine pericardium mang tim bò

đecellularization quá trình khử tế bào

extracellular matrix chất nền (hoặc khung nên) ngoại bào

fetal bovine serum huyết thanh bào thai bò

human umbilical vein endothelial cells té bào nội mô tĩnh mạch cuông rôn người

immobilize gắn (hoặc cô định)

native pericardium mang tim thé

pseudoaneurysm chứng gia phình mạch

relative growth rate tỷ lệ tăng trưởng tương đối

serous pericardium mang tim thanh mac

CHƯƠNG 1 MỞ DAU

1.1 Mở đầu

Các mảnh vá tim mạch đã được sử dụng phổ biến trong phẫu thuật nhằm hỗ trợ

quá trình sửa chữa và tai cấu trúc tim mạch Việc sử dụng mảnh vá giúp giảm đáng ké

nguy cơ tử vong hậu phẫu (còn 14,6%), tái nghẽn mạch máu (còn 4,8%) và phẫu thuật

lần hai (còn 1,1% sau 30 ngày) so với phẫu thuật mạch máu không sử dụng mảnh vá(tương ứng là 24,1%, 18,6% và 3,1%) Trong phẫu thuật động mạch cảnh, thống kê từ

năm 2003 đến 2014 đã chỉ ra xu hướng tăng sử dụng các mảnh vá trong phẫu thuật(chiếm 91% tổng số ca điều trị) Các loại mảnh vá tim mạch hiện nay bao gồm các vật

liệu polymer tổng hợp, mô tự thân và mô động vật Màng vá tổng hợp được chế tạo chủ

yếu từ Polytetrafluoroethylene và Polyethylene terephthalate, có ưu điểm là dé dang thaotác, tính mềm dẻo và độ bền cao Tuy nhiên, các vật liệu tổng hợp không có khả năng

thống nhất mô và phát triển cùng với mô chủ Các mẫu động mạch và tĩnh mạch tự thân(của chính bệnh nhân) có thể được thu nhận cho cấy ghép, do không vướng phải rào cản

đáp ứng miễn dịch và hiệu quả tái tạo mô tốt, nhưng gặp trở ngại về số lượng hạn chế.Nguồn mô động vật (còn gọi là mô dị loài) được xem là giải pháp phù hợp do tính sẵn

có và khả năng thu nhận được số lượng lớn cho chế tao mảnh vá tim mạch Sau khi loại

bỏ thành phan tế bao di loại, khung nền ngoại bao của mô được lưu giữ lại và có khanăng tham gia vào quá trình lành hóa và thông nhất mô chủ

Màng tim bò thể hiện ưu điểm về độ bền và độ dày phù hợp đề chế tạo thành cácmảnh vá tim mạch Độ bền kéo của màng tim bò có thé đạt 13,86 + 6,65 MPa, trong khi

độ bền kéo của mảng tim của người trưởng thành là 7,62 + 0,96 MPa, và vượt trội hơn

so với mô tự thân như động mạch vú trong (độ bền kéo khoảng 4,3 MPa) và tĩnh mạch

hiển (độ bền kéo khoảng 6,3 MPa) Với lợi thế về nguồn nguyên liệu màng tim bò dồi

dao và sẵn có, hàng loạt sản phẩm mảnh vá có thé được chế tạo nhằm đáp ứng nhu cầucấy ghép ngày càng tăng Trong các quá trình chế tạo ban đầu, glutaraldehyde được dùng

để xử lý màng tim bò nhờ tác động cố định kháng nguyên bề mặt tế bào dị loài.

Glutaraldehyde tạo ra liên kết chéo giữa các sợi collagen (gọi tắt là gia cường) của khung

nên ngoại bào, nên cải thiện đáng kể cơ tính và thời gian tồn tại của mảnh ghép trong cơthể Màng tim bò gia cường bang glutaraldehyde (gọi tắt là GluBP) đã cho thay khả năng

tạo vết chỉ khâu khít nên làm giảm tỷ lệ chảy máu thấp hơn so với mảnh vá tổng hợp.Các sản phẩm màng tim bò gia cường bằng glutaraldehyde điển hình như Peri-Guard,

Vascu-Guard (Baxter International Inc Deerfield, Illinois, Hoa Kỳ) và mảnh vá màng

tim bò (Braile Biomédica, Brazil) đã được sử dụng trong lâm sang.

Hai van đề tồn đọng của các mảnh vá tim mạch hiện nay là khoáng hóa và bám

dính huyết khối Tình trạng khoáng hóa chủ yếu liên quan đến tế bào chết, mảnh vỡ tếbao và thành phan phospholipid màng tế bào trong mô màng tim và lượng thừa

glutaraldehyde gây độc mô Do đó, các nghiên cứu dần tập trung theo hướng khử tế bàokết hợp với giảm nồng độ glutaraldehyde sử dụng Khử tế bào mô màng tim bò giúp loại

bỏ được thành phần phospholipid của màng tế bào và cả nhân tế bào, chỉ giữ lại thànhphần khung nền ngoại bào, cho phép vừa kiểm soát nguy cơ khoáng hóa và đảm bảo đặc

tính tương hợp sinh học của mảnh ghép Việc khử tế bào và gia cường bằng

glutaraldehyde 0,1% đã được chứng minh giúp giảm 89% hàm lượng canxi lắng đọngtrong mẫu so với nhóm màng tim bò gia cường bằng glutaraldehyde 0,5% Mảnh vá

CardioCel (Admedus, Malaga, Western, Uc) là sản phẩm mảnh vá tim mạch thương mại

được chế tạo từ quy trình khử tế bao màng tim bò và gia cường bang glutaraldehyde

Manh vá CardioCel thé hiện đặc tính bền vững và giảm ty lệ khoáng hóa đáng kể so vớinhóm màng vá Peri-Guard và màng tim người gia cường bằng glutaraldehyde 0,6% Tuy

nhiên, trong cấy ghép vào động mạch chủ bung và động mạch phi trên mô hình lợn, các

vùng khoáng hóa vẫn được phát hiện sau một năm theo dõi, chỉ ra vấn đề khoáng hóavẫn chưa được giải quyết triệt đề

Tình trạng huyết khối mảnh ghép là yếu điểm không chỉ của các loại vật liệutổng hợp, mà còn ở các vật liệu có nguồn gốc mô nói chung khi tiếp xúc với dòng máu

Việc gắn heparin được xem là giải pháp hạn chế huyết khối nhờ khả năng chống đông

máu của heparin Cấu trúc phân tử của heparin chứa mật độ cao nhất các nhóm tích điện

âm như carboxyl va sulfonyl, nên cho phép heparin tương tác tĩnh điện với các protein

trong huyết tương Chính nhờ vào lực đầy tĩnh điện giữa các protein huyết tương và

heparin gắn trên bề mặt vật liệu đã ngăn cản sự thấm hút của protein, làm bất hoạt sự

bám dính và hoạt hóa tiểu cầu, giảm thiểu được tình trạng huyết khối trên bề mặt vật

liệu Trong hướng chế tạo mảnh vá tim mạch từ màng tim bò, các nghiên cứu về gắnheparin vào màng tim vô bào chưa nhiều Phương pháp gắn heparin chủ yếu dựa trên

phản ứng gia cường (EDC và glutaraldehyde) được thực hiện với sự có mặt của heparin

để gắn heparin vào các sợi cấu trúc của khung nền ngoại bào (ECM) bằng liên kết cộnghóa trị Trong trường hợp màng tim bò vô bào đã được gia cường, việc tiếp tục sử dụng

EDC hay glutaraldehyde dé gắn heparin được dự đoán về nguy cơ gây độc, giảm tươngtác mô và khoáng hóa mảnh ghép Bên cạnh đó, phương pháp lắp ráp từng lớp (LbL,

Layer-by-Layer) dựa trên tương tác tĩnh điện nhờ sử dụng phân tử mang điện tích dương

có khả năng tương tác với heparin và thành phần ECM, nên cho phép gắn heparin vào

ECM của mẫu thử nghiệm Vì vậy, phương pháp LbL được xem là hướng tiếp cận phù

hop dé gắn heparin vào màng tim tim bò vô bào gia cường

Phân tử ion sắt Dihydroxy-iron (viết tắt DHI) đã được sử dụng vào quy trình gắn

heparin vào tinh mach bò vô bào theo phương pháp LbL Phân tử DHI mang điện tích

dương, trong khi phân tử heparin tích điện âm nhờ chứa mật độ cao các gốc carboxyl và

sulfonyl DHI có thể tạo liên kết tĩnh điện với heparin DHI cũng tạo được liên kết cộnghóa trị phối trí với các nhóm carboxyl, sulfonyl, hydroxyl va amino trên phân tử heparin

Thành phần ECM chứa các sợi collagen và elastin với nhiều nhóm carboxyl, hydroxyl

va amino nên cũng có thé tạo liên kết cộng hóa trị phối trí với phân từ DHI Theo phươngpháp LbL, bằng cách ngâm ủ mẫu ECM lần lượt trong dung dịch DHI và dung dịch

heparin, heparin sẽ được gắn vào ECM nhờ vào liên kết với DHI và tạo thành phức hợpDHL/heparin Trong đó, hàm lượng heparin gắn vào ECM phụ thuộc vào số lượng chu

kỳ LbL Tĩnh mạch bò vô bào sau khi gắn heparin đã hạn chế được sự bám dính tiểu cầu,

ghi nhận được sự bám đính và tăng sinh của tế bào nội mô Nghiên cứu gắn heparin theo

phương pháp LbL có sử dụng chỉ giới hạn trên đối tượng tĩnh mạch bò vô bào, chưa cócông bó cập nhật trên các loại mô khử tế bào khác Đối với màng tim bò vô bào gia

cường, mặc dù bản chất cầu tạo từ thành phần ECM nhưng khi đã trải qua xử lý giacường, tương tác giữa heparin, DHI với ECM mẫu màng có thé thay đổi Vì vậy, phương

pháp LbL có sử dụng DHI cần được làm rõ về tính hiệu quả gắn heparin vào màng tim

bò vô bào gia cường, cũng như khảo sát khả năng cải thiện tính tương hợp máu và các

tác động tế bào và mô nhằm cung cấp cơ sở khoa học trong nghiên cứu chế tạo và hoàn

thiện mảnh vá tim mạch.

1.2 Câu hỏi nghiên cứu

Quy trình khử tế bào, gia cường bằng glutaraldehyde và gắn heparin có phù hợp trongchế tạo mảnh vá tim mạch từ màng tim bò hay không?

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu tong quát

Xây dựng được quy trình chế tạo màng tim bò vô bào gia cường bằng glutaraldehyde và

phương pháp gắn heparin nhằm đạt được đạt tiêu chí làm mảnh vá tìm mạch

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

— Xác lập được quy trình chế tạo màng tim bò vô bao gia cường bang glutaraldehyde

— Xác lập được quy trình lắp ráp từng lớp kết hợp DHI dé gắn heparin lên màng tim bò vô

bao gia cường

— Xác định được ảnh hưởng của màng tim bò vô bào có gắn heparin lên sự bám dính và

tăng sinh của tế bào nội mô

— Đánh giá được khả năng cấy ghép mạch máu của mang màng tim bò vô bào gia cường

bang glutaraldehyde và gắn heparin

1.4 Nội dung và phạm vi nghiên cứu

Luận án bao gồm 4 nội dung nghiên cứu chính:

— Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình chế tạo màng tim bò vô bào gia cường bằng

glutaraldehyde và đánh giá theo tiêu chí mảnh vá tim mạch

— Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp gắn heparin lên màng tim bò vô bào gia cườngnhằm cải thiện đặc tính tương hợp máu

— Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của màng tim bò vô bào có gắn heparin lên sự bámdính và tăng sinh của tế bào nội mô

— Nội dung 4: Đánh giá tương hợp in vivo và khả năng cấy ghép mạch máu trên động

vật thí nghiệm

Luận án được giới hạn trong khuôn khổ nghiên cứu về quy trình khử tế bào có sử dụngSDS, gia cường bang glutaraldehyde và gắn heparin bằng phương pháp lắp ráp từng lớp

Trong đó, các phương pháp đánh giá và thu nhận kết quả thuộc phạm vi tiêu chí của

mảnh vá tim mach mà luận án đề xuất dựa trên các công bố có liên quan

1.5 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới cúa nghiên cứu

Công nghệ vật liệu y sinh được nghiên cứu và phát triển nhằm đáp ứng yêu cầucấy ghép phục hồi chức năng Các mảnh vá tim mạch đã được sử dụng và cho thấy cải

thiện hiệu quả điều trị, đặt ra yêu cầu về nghiên cứu chế tạo đáp ứng nhu cầu sử dụngcác mảnh vá ngày càng tăng Đối tượng màng tim bò thể hiện các ưu thế về độ dày, tính

bên chắc, tương tác mô tốt, và nguồn cung sẵn có với số lượng lớn, nên phù hợp cho chế

tạo mảnh vá tim mach Các phương pháp chế tạo mảnh vá tim mạch từ màng tim bò chủyếu tập trung vào quá trình khử tế bào và gia cường nhằm đạt được các tiêu chí về đặc

tính cơ học và khả năng tổn tai lâu đài sau cấy ghép Đặc tính tương hợp máu của mảnh

vá từ màng tim bò được hình thành nhờ quá trình biến đổi bề mặt, điển hình là gắn

heparin Theo đó, luận án tập trung nghiên cứu phương pháp chế tạo và gắn heparin lênmảng tim bò nhằm đạt được tiêu chí làm mảnh vá tim mạch Các kết quả đạt được cung

cấp cơ sở khoa học về quá trình biến đổi bề mặt màng tim bò nhằm đạt được và duy trì

đặc tính tương hợp máu cần có ở mảnh vá tim mạch Các quy trình nghiên cứu từ luận

án có khả năng được áp dụng trong thực tế chế tạo mảnh ghép cho lĩnh vực tim mạch

nói riêng và lĩnh vực y sinh nói chung (như trong nghiên cứu kỹ nghệ mô, làm màng

điều trị ngăn trong nha khoa, tham mỹ)

Nghiên cứu của luận án đã cung cấp cơ sở thực nghiệm về sự ảnh hưởng của

SDS va glutaraldehyde trong tác động khử tế bào và gia cường màng tim bò Phươngpháp lắp ráp từng lớp kết hợp DHI được chứng minh hiệu quả trong gắn heparin vào

màng tim bò vô bào gia cường và đạt được đặc tính chống đông máu, cung cấp luận cứ

khoa học mới trong hướng nghiên cứu chế tạo mảnh vá tim mạch từ màng tim bò

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Khử tế bào màng tim bò

2.1.1 Giới thiệu chung về màng tìm bò và màng tim bò vô bào

Màng ngoài tim (gọi tắt là màng tim) có dạng túi dai chắc bảo vệ tim, bao phủ

tim và phần gốc của các mạch máu lớn (động mạch chủ, động mạch phổi, tĩnh mạch chủ,

tinh mạch phổi) (Hình 2.1 [78]) Mang tim bao gồm 2 lớp là màng tim sợi và mang tim

thanh mạc [69, 78] Trong đó, màng tim sợi (fibrous pericardium) có bản chat là mô sợi

cấu trúc day đặc, cứng chắc, bao xung quanh tim, gắn với các mach máu lớn, dây chang

trung tâm cơ hoành và xương ức Màng tim thanh mạc (serous pericardium) là lớp bên

trong, được tách thành lá thành (phủ mặt trong của màng tim sợi) va lá tạng (phủ bề mặt

cơ tim) Khoảng không gian giữa lá tạng và lá thành được gọi khoang ngoài tim, chứa

một lượng dịch màng tim có tác dụng bôi trơn 2 bề mặt và đệm cho tim, giúp tim có thé

trượt lên và dé dang co bóp [69, 78].

Màng tim đã được thu nhận từ nhiều loài động vật khác nhau (bò, lợn, kanguru,

ngựa) và được sử dụng trong nghiên cứu chế tạo các bộ phận sinh học thay thế và sửa

chữa các tồn thương [5, 38, 58] Tùy thuộc vao loài thu nhận, độ day của mô màng tim

sẽ có sự khác biệt Màng tim từ bò có độ dày khoảng 390 + 40,6 um, cao hơn so với

màng tim từ lợn (223 + 30,1 um) và từ ngựa (260 pm + 28,4 wm) [55] Về đặc tính cơhọc, độ bền kéo của màng tim bò được xác định khoảng 13,86 + 6,65 MPa [3], hoàn toàn

cạnh tranh được với mô màng tim người (khoảng 7,62 + 0,96 MPa), các mô động mạch

vú trong và tĩnh mạch hiển của người (độ bền kéo khoảng 4,3 - 6,3 MPa) [11], và vượt

trội hơn so với màng tim lợn là 9,4 + 1,7 MPa [3] Do đó, trong lĩnh vực cấy ghép tim

mạch, độ dày và đặc tính cơ học tốt của mảng tim bò đã thu hút sự quan tâm lựa chọnlàm đối tượng nguyên liệu chế tạo Ngoài ra, do bản chất mô động vật nên mang tim bò

được xem là giải pháp phù hợp đề cung cấp số lượng lớn vật liệu cây ghép

Yếu tố rào cản trong việc sử dụng mô động vật nói chung và màng tim bò nói

riêng vào cấy ghép lâm sàng chính là kháng nguyên dị loài, mà chủ yếu từ thành phần tếbào của mô Chính vì vậy, yêu cầu loại sạch thành phần tế bào được đặt ra trong quy

trình xử lý các mô đề chế tạo vật liệu cây ghép Sau quá trình khử tế bào, ECM của mô

được thu nhận, vẫn bảo tồn cấu trúc và các thành phần sinh học như collagen, fibronectin,elastin, GAG, và các nhân tố tăng trưởng So với các vật liệu tổng hợp, vật liệu từ khung

nền ngoại bào có khả năng tham gia vào quá trình tái tạo và thông nhất mô chủ So với

mô màng tim bò thô, màng tim bò được khử tế bào (hay còn gọi là màng tim bò vô bào)

không còn hiện diện các vết nhân tế bào, có thể được đánh giá bằng nhuộm mô học (Hình2.2.A [86]) Trước và sau khi khử tế bào, các mẫu màng được mô tả có cấu trúc có tính

dị hướng ở hai mặt sợi và thanh mạc (Hình 2.2.B [62]) [62, 86] Mặt sợi là mô liên kết

có thành phần ECM cấu trúc bởi collagen loại I sắp xếp lỏng lẻo không có định hướng

và xen lẫn sợi elastin (Hình 2.2.C [86]) Mặt còn lại là mặt thanh mạc có các protein cầu

tạo nên màng đáy như laminin, collagen loại IV va heparan sulfate [86], giúp hỗ trợ và

tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào gốc [43] và tế bào nội mô mạch máu [60, 80]

Như vậy, chính các thành phần của ECM màng tim bò đã có tác động tích cực đến sự tái

khu trú của các tế bào chủ, làm nền tảng cho thống nhất mô (Hình 2.2)

Hình 2.2 Hình thái bề mặt của màng tim bò trước và sau khi khử tế bao

(A) Nhuộm mô học màng tìm trước và sau khi khử tế bào (B) Chup SEM hai bê mặt màng tim.

(C) Nhuộm miễn dịch huỳnh quang nhận diện các protein ECM màng tim bò sau khử tế bào.

2.1.2 Cơ sở khoa học của khử té bào

Quá trình khử tế bào (decellularization) lý tưởng hướng đến loại bỏ hoàn toàn

các thành phan tế bào, đồng thời vẫn giữ lại cdu trúc và thành phan sinh học ban dau,các đặc tính sinh hóa và cơ học của ECM Cho đến nay, chưa có quy trình tiêu chuẩn về

khử tế bào, mà phan lớn các quy trình được xây dựng dựa trên các yếu tố như nguồn gốc

mô, loại mô, hình thái, kích thước và đặc tính cơ lý — hóa — sinh Các phương pháp loại

bỏ tế bào có thé được phân nhóm theo tác nhân sử dụng, bao gồm các phương pháp vật

lý, hóa học, enzym và sự kết hợp của các phương pháp này

2.1.2.1 Phương pháp vật lý

Xử lý vật lý bằng cách thay đồi các tác động về nhiệt độ, lực cơ học và áp suất

để tạo điều kiện phá vỡ màng tế bào, loại bỏ các thành phần bên trong tế bao và cả dungdịch xử lý Trong đó, các chu trình đông lạnh — rã đông, ngâm và khuấy được sử dụng

rộng rãi để khử tế bao của mô Chu kỳ đông lạnh — rã đông có tác động phân hủy màng

tế bào, thúc đây quá trình ly giải tế bào và tách tế bào khỏi mạng lưới ECM bằng cách

hình thành các tỉnh thể đá nội bào Các chu trình đông lạnh — rã đông đã được sử dụngcho cả ECM có nguồn gốc từ mô — cơ quan và ECM có nguồn gốc từ tế bào đo cải thiện

hiệu quả khử tế bào, giảm lượng hóa chất tồn dư và độc tính tế bào cũng như thành phần

sinh hóa được bảo quản tốt, hiệu suất cơ sinh học và cấu trúc mô [16] Hiệu quả khử tếbào chủ yếu được xác định bởi tốc độ làm lạnh — rã đông, nhiệt độ thiết lập, thời gian xử

lý và chu kỳ lặp lại.

Tác động ngâm và khuấy lắc thích hợp hơn đối với các mô — cơ quan có kích

thước nhỏ, mỏng và độ bên cơ tính kém [16] Trong hướng tiếp cận này, mô — cơ quanđược ủ trong dung dịch khử tế bảo và được khuấy động cơ học liên tục, hiệu quả của

chúng phụ thuộc vào các thông số như cường độ khuấy, tác nhân khử phân tử và kích

thước mô Sau khi nhúng các mô vào các tác nhân, sự kích động tạo điều kiện thuận lợicho việc phá vỡ tế bao, tách tế bào khỏi màng đáy và loại bỏ các thành phan tế bào Sử

dụng phương pháp ngâm và khuấy lắc cho phép dung dich tay tế bào tiếp xúc đồng nhấtvới mô hơn so với cách ngâm ủ ở điều kiện tĩnh, và đạt được hiệu quả khử tế bào tốt hơn

với thời gian tiếp xúc được rút ngắn Thứ hai, phương pháp này không ảnh hưởng đáng

kể đến cấu trúc bề mặt ECM, cấu trúc collagen và tính toàn vẹn, độ bền cơ học, và hàm

lượng GAG Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này có thé gây ra nhiều tổn thương hơn

cho bề mặt ngoài của mô do chịu tác động của hóa chất liên tục, trong khi sự khuếch tánhạn chế của các hóa chất theo bề dày của mô có thể không mang lại hiệu quả loại tế bào

tốt

2.1.2.2 Phương pháp hóa học

Phương pháp xử lý hóa học bằng chất tây rửa và tác nhân hóa học dé phá vỡ liên

ết tế bào và loại bỏ các thành phan tế bào Chất tay rửa là tác nhân hóa học điền hìnhđược sử dụng, bao gồm chất tây rửa ion, không ion va zwitterionic, là các chất lưỡng cực

òa tan có thể phá vỡ tương tác ky nước giữa các phân tử Chúng loại bỏ hiệu quả cácthành phần kháng nguyên của tế bào bằng cách hòa tan màng tế bào và phân tách DNA

hỏi protein, nhưng chất tay rửa mạnh có thé có tác động xấu đến ECM do tác động phá

vỡ và biến tính protein Chat tay ion là một phương pháp xử lý hóa học hiệu quả để khử

phân bào, làm hòa tan các màng nhân và tế bào chất bằng cách phá vỡ các tương tác giữa

lipid — lipid, lipid — protein, DNA — protein và protein — protein, dẫn đến loại bỏ cácnhân và các thành phan của tế bào Chất tay rửa ion phổ biến nhất là sodium dodecyl

sulfat (SDS) [16], đã cho thay hiệu quả trong loại bỏ triệt dé các tế bào và cả nhân tếbào Nồng độ SDS cao giúp hạn chế đáng ké hàm lượng DNA tồn dư trong mẫu, nhưng

làm giảm độ bền cơ học của ECM Trong khi nồng độ SDS thấp giúp bảo tồn các proteinECM, cũng như giảm tác dụng gây độc tế bảo, tuy nhiên không cho hiệu quả khử tế bào

mong muốn Tuy nhiên, do làm đứt gãy tương tác protein-protein, chất tây rửa ion có tác

động có hại đến cấu trúc ECM và các thành phan hoạt tính sinh học Đối với mô van timlợn, quy trình sử dụng nồng độ SDS 0,1% có tác dụng khử tế bào và duy trì cấu trúc

khung nên ngoại bào tốt hơn so với quy trình khử tế bào bằng Trypsin hoặc Triton-X100[39] Trong quy trình khử tế bào mang tim lợn, nồng độ SDS 0,1% cũng cho thay hiệu

quả khử tế bào và bảo tồn cấu trúc khung nền ngoại bào, trong khi đó, nồng độ SDS0,3% đã làm biến dạng màng tim [71] Mô sụn xử lý bằng SDS 2% trong 8 giờ đã bị loại

bỏ hoàn toàn thành phần GAG của mô [18]

So với chất tây rửa ion, chất tẩy rửa không ion cung cấp một cách xử lý nhẹnhàng hơn để hòa tan màng tế bào và phân tách DNA khỏi protein bằng cách phá vỡ các

tương tác của lipid — lipid, lipid — protein, DNA — protein, nhưng vẫn giữ nguyên các

tương tác protein-protein Do không có kha năng làm biến tính protein, chat tay rửa

không ion có thé loại bỏ các chất bên trong tế bào mà không làm hỏng cấu trúc và định

hướng của collagen Tuy nhiên, vì chất tây rửa không ion không thê hiện hiệu quả trong

loại bỏ nhân tế bào Do đó, các chất tây rửa này luôn cần sự hỗ trợ của các dung dịchhoặc phương pháp tác động vật lý khác để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn các thành phan tế

bao.

Dung dich ưu trương (hoặc nhược trương), tương ứng dung dich có nồng độ chat

tan cao hơn (hoặc thấp hơn) nồng độ trong tế bào dé loại bỏ các thành phan tế bao rakhỏi tế bào Do tác dụng thâm thấu, các dung dịch này gây ly giải tế bào, làm mất nước

tế bào và chết tế bào Các dung dịch này dễ dàng được loại sạch sau giai đoạn rửa, nên

giảm thiểu khả năng gây độc tế bào Mặc dù các dung dịch ưu trương hay trương lực cóthể hỗ trợ quá trình gây chết hoặc phá vỡ tế bào, nhưng chúng không có tác động loại bỏ

hoàn toàn các thành phần tế bào Do đó, quy trình khử tế bào có dùng dung dịch nhượctrương hoặc ưu trương sẽ kết hợp với các chất tây rửa hoặc enzym

Dung dịch axit và kiềm hoạt động dựa trên tác động thủy phân các thành phần

tế bào chất và axit nucleic [16] Dung dịch axit dùng trong khử tế bào điển hình như

peracetic axit (viết tắt PAA) giúp hoà tan các bào quan trong tế bao chất và phá vỡ các

axit nucleic Tương tự như chất tay rửa, chúng cũng có thé phá vỡ các thành phan và cấutrúc ECM, làm giảm hàm lượng collagen và làm suy yếu độ bền của mô Do đó, các axit

thích hợp và nông độ tối ưu nên được lựa chọn PAA ở nồng độ 0,1% được coi là phươngpháp xử lý hiệu qua cho các mô mỏng, vì nó có tác động tối thiểu đến cầu trúc và thành

phần ECM So với các hợp chất axit, dung dịch kiềm phổ biến như amoni hydroxit,sodium hydroxit và sodium sunfua được áp đụng trong quy trình khử tế bào Các dung

dịch kiềm loại bỏ tế bào bằng cách làm biến tính DNA và gây ra sự ly giải tế bào Đặc

biệt là các dung dịch kiềm có độ pH cao hơn 11 có hiệu quả đáng kể trong hạn chế DNAtồn dư Dung dịch kiềm có thé ảnh hưởng đến cấu trúc ECM, thay đồi các đặc tính cơ

học và độ nhớt, giảm hàm lượng GAG, thậm chí loại bỏ các yếu tố tăng trưởng trong mônếu tiếp xúc trong thời gian dài Bên cạnh đó, các dung dịch kiềm có độ pH 10 - 12 có

thể làm hỏng rất nhiều sợi collagen, fibronectin và GAG, cũng như gây ra các phản ứng

nghiêm trọng đến cơ thể ghép và hình thành các mô xơ

2.1.2.3 Xử lý bằng enzym

Biện pháp khử tế bào bằng các enzym cho phép tác động đặc hiệu cao đề loại bỏ

các thành phần tế bào và các thành phần ECM không mong muốn bằng cách phá vỡ cácliên kết tế bào-tế bào và tế bào-ECM [16]

Nuclease có tác động thủy phân các chuỗi DNA va RNA, và do đó hỗ trợ quá

trình loại bỏ tế bào DNase là một nuclease điển hình, thường được sử dụng đề khử tế

bào, do tính đặc hiệu mạnh để tạo điều kiện loại bỏ hàm lượng DNA trong khi vẫn giữ

lại protein bằng cách phân cắt trình tự axit nucleic DNase thường được sử dụng sau chấttây rửa dé tăng khoảng cách bên trong và độ xốp, làm cho DNase thâm nhập vào mô dễ

dang và nhanh chóng hon DNase có thé loại bỏ các axit nucleic còn sót lại và các mảnhvụn tế bào, cũng như hỗ trợ rửa sạch chất tây rửa DNase với chất tây rửa được chứng

minh là cần thiết để loại bỏ hoàn toàn các thành phan tế bao vì loại bỏ > 95% DNA datđược sau khi xử lý Dnase Tuy nhiên, thời gian xử lý nuclease lâu dài có thé làm thay

đổi câu trúc ECM và giảm độ ổn định cơ học, đồng thời làm mắt các thành phan ECM

như GAG, laminin và collagen IV Hơn nữa, nên thực hiện nhiều bước rửa vì các sảnphẩm enzym còn lại có thể tạo ra phản ứng miễn dịch và cản trở quá trình cấy ghép và

tái lập tế bào sau đó

Trypsin là một loại enzym khác thường được sử dụng cho các quá trình khử tế

bao Cơ chế của nó dựa trên sự phân cắt của các liên kết peptit ở cacbon từ phía cacboxylcủa arginine và lysine, dẫn đến sự phân tách các thành phan tế bào khỏi ECM Tương tự

như DNase, trypsin đã được sử dụng rộng rãi vì nó có thể khử tế bào ECM hiệu quả mà

không gây ra tác dụng độc tế bào [23] Tuy nhiên, trypsin có thể phân cắt các proteintrong ECM, có thé dẫn đến phá hủy ECM được bảo quản và thay đổi độ ổn định cơ học

Vi vậy, nồng độ và thời gian tiếp xúc thích hợp cần được tối ưu Nghiên cứu của Lin vàcộng sự (cs) đã làm việc lựa chọn nông độ trypsin thích hợp (<0,03 — 0,5%) và thời gian

tiếp xúc (<12 giờ) là bat buộc đối với quá trình khử tế bào động mạch vành heo [41].

Nghiên cứu của Ramm đã chứng minh rằng việc điều trị bằng trypsin đối với van tim

nên được khuyến cáo giới hạn dưới 90 phút, điều này cho thấy hiệu quả loại bỏ DNA vàglycan liên kết N, và độ ồn định cơ học tốt [59]

2.1.3 Các phương pháp tiếp cận trong khứ tế bào mang tim bò

Thành phần khung ngoại bào ECM thường được bảo tồn giữa các loài và được

chấp nhận trong cơ thể để ứng dụng làm vật liệu sinh học, tuy nhiên cơ thể lại nhận diện

tế bào đồng loài và dị loài là tác nhân ngoại lai, gây ra hiện tượng viêm và thải loại vật

liệu thông qua hệ thống miễn dịch Vì vậy để sử dụng ECM có nguồn gốc tự nhiên làm

vật liệu cây ghép ví dụ như màng tim bò, quy trình loại bỏ hoàn toàn tế bào mà vẫn đảmbảo tác động tối thiểu đến cấu trúc, đặc tính cơ học, hoạt tính sinh học của ECM là vô

cùng cần thiết [1] Mỗi phương pháp khử đều có ưu nhược điểm riêng; vì thế, hầu hếtquy trình khử tế bào hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp vật lý (đông lạnh, cơ học,

khuấy lắc ), hóa học (đung dịch kiềm và axit, dung dịch ưu trương và nhược trương,chất tây rửa ) và sinh học (enzym) Một quy trình khử tế bào gồm các giai đoạn, bắt

đầu bằng ly giải màng tế bào, tiếp theo là tách thành phân tế bào khỏi ECM, hòa tan nhân

và màng tế bào, cuối cùng là giai đoạn rửa loại bỏ mảnh vỡ tế bào và các hóa chất tồn

dư [25] Sau khi trải qua các bước xử lý, mẫu được xác định đặc tính sạch tế bào (hay

còn gọi là vô bao) theo các tiêu chí tối thiểu [16]: (1) tiêu bản nhuộm Hematoxylin vàEosin (H&E) không có hiện diện vết nhân tế bảo, (2) hàm lượng DNA tồn dư thấp hơn

50 ng/mg mẫu khô, (3) kích thước DNA tồn dư ngắn hơn 200 bp Các phương pháp khử

tế bào mang tim động vật đã phát triển từ những năm 1990 và ngày càng hoàn thiện, cụ

thể như một số phương pháp sau đây:

Courtman và cs (1994) đã đưa ra phương pháp khử tế bào mang tim bò bằng hóachất Triton X-100, kết hợp enzym DNase/RNase Tuy nhiên, việc sử dụng các yếu tố

enzym DNase/RNase có nguy cơ làm tăng tính kháng nguyên của vật liệu do sự tồn dưcủa các enzym này Bên cạnh đó, tổng thời gian xử lý của quy trình là 121 giờ, đây là

khoảng thời gian khá dai nên sẽ ảnh hưởng đến các thành phan hoạt tính sinh học của

khung nền ngoại bao của mang tim [15]

Wei và cs (2005) đã thực hiện loại tế bào màng tim bò, sử dụng quy trình củaCourtman, có kết hợp yếu té axit axetic và collagenase dé điều chỉnh lỗ xốp của vật liệu

[77] Độ bền cơ học của mẫu mang tim vô bào giảm đang ké với mẫu được xử lý vớicollagenase Độ dày của mang tăng đáng kể, từ 0,46 + 0,05 mm lên đến 1,10 + 0,07 mm

khi xử lý màng tim vô bào với axit axetic Ngoài ra, collagenase là loại enzym rat đấttiền nên khả năng ứng dụng quy mô lớn không cao

Goncalves và cs (2005) đã đưa ra phương pháp khử tế bào màng tim bò với 2 tác

nhân chính là dung dịch nhược trương va dung dịch enzym DNAse/RNAse [25] Mang

tim bò đã xử lý theo phương pháp này được xử lý thêm bằng một trong các tác nhân sau:

dung dịch Triton X-100 0,5%, SD 0,5%, SDS 0,1% kết hợp với enzym

alpha-galactosidase với hàm lượng 5 IU/ml hoặc enzym phospholipase hàm lượng 150 IU/ml.

Cuối cùng, mẫu màng được rửa sạch bằng dung dich muối đệm phosphat (PBS —Phosphate buffer saline) trong 96 giờ Bên cạnh đó, chưa kẻ thời gian xử lý, bước rửa

mẫu bằng dung dich PBS của Goncalves khá dai, lên đến 96 giờ, nên tăng sự thất thoát

của các nhân tố sinh học ECM của màng tim bò

Gardin va cs (2015) đã thực hiện khử tế bào màng tim bò với hai phương pháp là

sốc nhược trương bằng dung dịch PBS được pha loãng 10 lần và đông lạnh/giải đông cókết hợp enzym DNase và Rnase [20] Kết quả cho thấy phương pháp sốc nhược trương

hiệu quả hơn trong việc loại bỏ tế bào, có tính tương hợp sinh học cao hơn, duy trì đượccấu trúc ngoại bào tốt hơn và ít phản ứng với cơ thể chủ hơn so với màng được xử lí

bằng phương pháp đông lạnh/giải đông kết hợp với enzym

Li và cs (2018) đã so sánh bảy quy trình khử tế bào mang tim bò, sử dụng tươngứng dung dịch SD 1%, dung dịch SDS 1% kết hợp SD 0,5% (có hoặc không áp dụng

chu kỳ đông lạnh — rã đông), dung dich Triton X-100 1%, dung dich Triton X-100 1%

kết hop SD 0,5% (có hoặc không áp dụng chu kỳ đông lạnh — rã đông) Kết qua cho thay

việc xử lý bằng đông lạnh — rã đông với hỗn hợp dung dich SDS 1% và SD 0,5% hoặc

hỗn hợp Triton X-100 1% và SD 0,5% có hiệu quả loại bỏ nhân tế bào [37]

2.2 Gia cwong mang ngoai tim bd vé bao

2.2.1 Cơ sở khoa học của gia cường mô khử tế bào

Nguồn nguyên liệu mô dị loài dùng trong chế tạo vật liệu cấy ghép nói riêng vàmảnh vá tim mạch nói chung, điển hình là màng ngoài tim bò, mang lợi thế về tính sẵn

có và số lượng cung cấp lớn Tuy nhiên, các mô dị loài cũng thé hiện tính kích thíchmiễn dịch và thải loại nặng nề khi cấy vào cơ thể người Do đó, quá trình khử tế bào

được áp dung trong quy trình tinh chế nhằm loại bỏ yếu tố kháng nguyên chính là các

thành phan tế bao [1, 22, 32, 82] Quá trình khử tế bào một mặt cho phép thu nhận ECM

có tính tương thích sinh học cao, nhưng đồng thời cũng ảnh hưởng đến cấu trúc và đặc

tính cơ lý của ECM Đề tránh những hạn chế này, quá trình gia cường được áp dụng dựatrên nguyên tắc tạo liên kết chéo (crosslink) trong cấu trúc ECM, từ đó tăng cường độ

bền cơ học và giảm sự thoái hóa [14] Trong những năm gan day, đã có nhiều tiến bộ

đáng ké trong việc phát triển các vật liệu y sinh có nguồn gốc từ ECM, các tác nhân xúc

tác tạo liên kết, gọi là chất gia cường, đã được nghiên cứu sử dụng.

Tác nhân gia cường lý tưởng cần thể hiện hiệu quả gia cường cao, thông qua cảithiện đặc tính cơ học và bền bi của vật liệu, hạn chế tác động gây độc tế bào Ngoài ra,

tinh dễ tiếp cận với chi phí kinh tế cũng là một lợi điểm dé xem xét lựa chọn Các tácnhân gia cường đã được áp dụng cho mô khử tế bào có thể được phân loại theo nguồn

gốc tổng hợp hóa học và chiết xuất tự nhiên Chat gia cường hóa học điền hình và được

sử dụng phổ biến trong chế tạo mảnh vá tim mạch thương mại là glutaraldehyde, ngoài

ra còn có 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (viết tắt là EDC), một số

chất khác như hợp chất epoxy, methylene diisocyanate, glycerin va alginate, vẫn dangđược nghiên cứu [17-21] Tác nhân gia cường tự nhiên bao gồm genipin (GP), axit

nordihydroguaiaretic (NDGA), axit tannic và procyanidins (PC).

2.2.2 Gia cường màng tim bò vô bào bằng glutaraldehyde

Glutaraldehyde (gọi tắt là Glu), với nồng độ thông dung từ 0,1 - 2%, đã được sử

dụng rộng rãi làm tác nhân gia cường, khử trùng và bảo quản nhiều sản phẩm thươngmại như van tim sinh học, ống mach máu và mảnh vá tim mạch [47] Dung dịch Glu

chứa hỗn hợp gồm có gốc aldehyde tự do, monomer, các dẫn xuất của nó phản ứng vớicác amin bậc 1 là các amin chuỗi bên của protein, sau đó Glu liên kết các protein này

Glu chứa hai nhóm aldehyde hoạt động nằm hai bên của chuỗi 3-cacbon Khi áp dụng

cho ECM, Glu được xem là một tác nhân gia cường hiệu quả, nhờ vào tác dụng phan

ứng với nhóm e-amino của lysin trong collagen đề tạo thành liên kết chéo giữa các phân

tử collagen, làm cầu nối giữa các monomer hoặc oligomer (Hình 2.3 [65]) Số lượng cácliên kết chéo hình thành phụ thuộc vào số lượng các amin ban đầu, kết hợp với khoảng

COOH COOH

Gia cường ECM bằng

Glutaraldehyde

Hình 2.3 Phản ứng gia cường collagen bằng glutaraldehyde

Gia cường bang Glu cải thiện đáng ké độ bền cơ học và độ bền của vật liệu có

nguồn gốc từ ECM [8, 61, 79], và hạn chế sự thoái hóa ECM trước các hoạt động phân

huỷ của các metalloproteinase và collagenase của môi trường mô Hiệu quả của sự gia

cường phụ thuộc vào nồng độ Glu và thời gian xử lý Không có một công thức chunghay cụ thể nào để áp dụng cho tất cả loại mô, chỉ bằng thực nghiệm mới có thể xác định

được quy trình gia cường phù hợp Glu với các nồng độ và thời gian khác nhau có thể

làm thay đổi độ dày, đặc tính cơ học của vật liệu Cùng với nồng độ và thời gian xử lý

với Glu, kích thước mô hoặc vật liệu sinh học cũng cần phải được xác định nhằm mụcđích khắc phục tình trạng khoáng hóa mảnh ghép Tuy nhiên, độc tính và sự vôi hóa do

dư lượng cao Glu sẽ ảnh hưởng hết chức năng các sản phẩm cấy ghép, do đó các quytrình gia cường có sử dung Glu luôn được nghiên cứu tối ưu theo hướng thay đổi nồng

độ, thời gian xử lý và áp dụng các phương pháp loại bo Glu tự do hay còn gọi là khử độc

[45] Sau khi khử độc, ECM sau gia cường Glu vẫn đảm bao tính tương thích sinh học,

độ bền cơ tính, và cải thiện sự bám dính và tăng sinh của tế bào [45]

2.2.3 Ứng dụng mang tim bò vô bào gia cường bằng glutaraldehyde làm mảnh vá tim

chắc tốt Tuy nhiên, loại vật liệu này gặp nhược điểm về tính linh động kém, do đó, trong

các trường hợp cấy ghép vào cơ tim, màng không thé co bóp đồng thời với mô tim danghoạt động Ngoài ra, khả năng tương thích sinh học của chúng cũng là một nhược điểm,

với nguy cơ gây ra các phản ứng viêm tại chỗ, xơ hóa và vôi hóa, cũng như không hỗ trợ

sự tái tạo mô chủ Về mặt hiệu quả tái tạo lâm sàng, mối quan tâm lớn hơn đã được tập

trung cho các mảnh vá được chế tạo từ các nguyên liệu sinh học, điển hình là màng timvới nguôn gốc tự thân, đồng loài và cả dị loài (chủ yếu từ bò và lợn) Mảnh vá từ mang

tim đã được áp dung để sửa chữa, điều chỉnh và tái tạo các khuyết hồng và tén thương

tim mạch, cụ thể như hỗ trợ nong mạch trong phẫu thuật cắt nội mạc động mạch cảnh,chế tao van tim nhân tạo và mảnh vá mach máu [5] Một số yêu cầu lý tưởng cho mảnh

vá động mạch cảnh là tính ổn định trong thời gian dải, dễ xử lý, vật liệu dễ thu nhận vàsẵn sàng dé sử dụng, có khả năng chống đông máu và chống nhiễm trùng [6] Trong chế

tạo mảnh vá tim mạch, màng tim bò thể hiện các đặc điểm thuận lợi về độ bền cơ tính,

có độ dày khá đồng nhất và tính sẵn có về số lượng lớn Mảnh vá từ màng tim bò giảm

chảy máu đường khâu, trong một thử nghiệm đối chứng ngẫu nhiên đánh giá chảy máu

đường khâu, Marien va cs đã chứng minh sử dụng mảnh vá từ màng tim bò giúp giảm

lượng máu chảy đường khâu (là 14%) so với mảnh vá tổng hợp (là 55%) [68] Đặc tínhthao tac và tạo hình dé dang hon so với mảnh vá tổng hợp dựa trên kết quả khảo sát trên

95 ca phẫu thuật động mạch cảnh Mang tim bò gia cường bang Glu, làm tăng độ bền và

sự ồn định của vật liệu trong khi đồng thời làm giảm tinh kháng nguyên và nhiễm trùng

tiềm ẩn [7] Tuy nhiên, bản chất cấu tạo từ collagen nên tạo điều kiện hình thành huyết

khối trên bề mặt màng, ảnh hưởng đến khả năng tương hợp máu của vật liệu

Ứng dụng đầu tiên của mang tim bò được gia cường bang Glu là chế tạo van tim

sinh học Ionescu-Shiley từ năm 1971 và đã được cấy vào vị trí động mạch chủ Nhữngkết quả thành công ban đầu đã nhanh chóng đưa loại vật liệu này vào các cay ghép tim

mạch khác, như phẫu thuật mạch máu, điều trị tim bam sinh hoặc mắc phải và vá màngngoài tim sau khi giải phẫu lồng ngực Các màng tim động vật được xử lý với Glu thé

hiện tính kháng nguyên thấp, có độ bền chắc và tính linh động cao; màng cũng cho tỷ lệ

nhiễm trùng thấp, xử lý dé dàng và hạn chế chảy máu vết khâu Các tai liệu ban đầu vềcác biến đổi hóa học và tác động sinh học của màng tim xử ly Glu in vitro khá khiêm

tốn Nguyên nhân chủ yếu từ mối quan tâm của các bác sĩ phẫu thuật tim đến tính khảthi và chức năng của cấy ghép của màng hơn là về tác dụng sinh học thực tế của chúng

Gan đây, độc tính tế bào của mảnh vá từ mang tim bò gia cường bằng Glu đã được chứngminh bằng các thử nghiệm in vitro tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp qua dịch chiết trên

nguyên bào sợi từ chó Hơn nữa, sự hoạt hóa của các đại thực bào ở người liên quan đến

việc giải phóng các cytokine gây viêm đã được công bó

Ngày nay, ngành công nghiệp vật liệu y sinh đã cung cấp một loạt các sản phẩm

thương mại từ màng tim của một số loài và được áp dụng các phương pháp biến đổi hóahọc khác nhau (Bảng 2.1) Đặc điểm chung của các sản phẩm này là đa phần chúng được

hau mạch với Glu dé làm giảm đáp ứng miễn dịch, tăng cường độ bền và độ ổn định

Vascular, Canada bằng Glu

của chúng.

Bảng 2.1 Các sản phẩm mảnh vá thương mại chế tạo từ màng tim bò

Tên sản Nhà sản xuất Quá trình xử lý Thông số

phẩm

CardioCel Admedus, Khử tế bào, khâu mạch Day: 328 «um + 50,3

Malaga, Western, | Glu, công nghệ kháng pum [55]

Uc khoáng hóa độc quyền Đô bền kéo: 8.31 +

(ADAPT®) 3,36 MPa [49]

Edwards Edwards Khau mach Glu, công 0,5 mm + 0,25 mm

Bovine Lifesciences, nghé khang khoang hoa [97]

Pericardial | Irvine, California, | độc quyền (XenoLogiX®)

Patches Hoa Kỳ

Peri-Guard | Baxter Khâu mach Glu 0,6% [49] | Độ bên kéo: 16,44+

International Inc 9,69 MPa, [49]

Deerfield,

Illinois, Hoa Kỳ

PhotoFix® | CryoLife Khử tế bào và quang oxi | Độ bền kéo: 7,10 +

Kennesaw, hóa 6,11 MPa [49]

Georgia, Hoa kỳ

Xeno Sure | LeMaitre Khử tế bào và gia cường _ | Độ day: 0,45 + 0,1

mm [21]

2.2.4 Tiêu chí của mảnh vá tim mạch

Một số tiêu chuẩn đã được lưu hành trong đánh giá vật tư — trang thiết bị y tếdùng trong tim mạch như tiêu chuẩn ISO 5840 (áp dụng cho van tim) với các nội dung

liên quan đến các hướng dẫn thử nghiệm tương hợp máu và khả năng tổn tại in vitro và

in vivo, tiêu chuẩn OPC (Objective Performance Criteria) về đánh giá sau ghép Tuy

nhiên, việc đánh giá toàn diện các sản phẩm có nguồn gốc mô được xem là van đề phức

tạp và chưa có tiêu chuẩn cụ thể Xét về đặc tính sinh học của các sản phẩm có nguồngốc mô, khó khăn đầu tiên nằm ở khả năng đảm bảo tính ồn định của quy trình chế tạo

Các kỹ thuật khử trùng, đóng gói và lưu trữ các sản phẩm sinh học này đòi hỏi sự nghiêmngặt và đặc thù cho từng chủng đối tượng sản phâm mô, do đó hạn chế khả năng đạt

được toàn bộ các tiêu chí đánh giá cũng như ứng dụng rộng rãi trong lâm sàng, do đó,

càng hạn chế sự chấp thuận theo quy định và việc sử dụng rộng rãi trên lâm sàng Mặt

khác, trong cây ghép in vivo nói chung và cấy ghép tim mạch nói riêng, các đặc tính của

sản phẩm mô có thé biến đổi bởi các tương tác với mô chủ Những kết quả biến đổi đốivới sản phẩm mô có thé không giống nhau ở tat cả các đối tượng được cấy ghép, và có

thể xảy ra khác nhau ở động vật được sử dụng trong thử nghiệm in vivo tiền lâm sàng.Cùng với nhiều phương pháp và kỹ thuật được sử dụng dé sản xuất, làm cho việc đánh

giá sản phẩm mô trở nên khó khăn, đặc biệt trong bối cảnh hiện nay chưa có tiêu chuẩnđặc thù và cụ thé đối với các sản phẩm mô