Đặc Điểm một số thành phần cytokine và yếu tố tăng trưởng tế bào trong dịch não tuỷ của bệnh nhân rối loạn cơ tròn, viêm tuỷ cắt ngang và liệt

Đặc Điểm một số thành phần cytokine và yếu tố tăng trưởng tế bào trong dịch não tuỷ của bệnh nhân rối loạn cơ tròn, viêm tuỷ cắt ngang và liệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LIỆT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội- năm 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học tại Đại học của mình,

em vô cùng biết ơn tập thể các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọi điền kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Thân Thị Trang Uyên – Chuyên viên viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec và đồng hướng dẫn

TS Đặng Văn Đức – Giảng viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Tế bào

đã tạo điều kiện và giới thiệu em đến với viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec để thực tập và triển khai đề tài nghiên cứu Và đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ lãnh đạo viện Nghiên cứu Tế bào gốc

và Công nghệ gen Vinmec và Trung tâm Ứng dụng Y học tái tạo và Công nghệ cao Vinmec cùng các đồng nghiệp, anh/chị, bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và

hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu để em hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khuyến khích em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2022

Trịnh Phương Đông

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

APRIL Phối tử gây tăng sinh

AQP4 Kháng thể kháng Aquaporin 4

BAFF Yếu tố kích hoạt tế bào B

BMMNC Tế bào gốc đơn nhân từ tủy xương

BMP-9 Protein di truyền hình thái xương 9

DRG Hạch rễ lưng

EGF Yếu tố tăng trưởng biểu bì

EMG Xét nghiệm ghi điện cơ

FGF-2 Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 2

GBS Hội chứng Guillain-Barre

G-CSF Yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt

GDF-15 Yếu tố tăng trưởng/biệt hóa 15

GM-CSF Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt-đại thực bào

GO Phương pháp Gene Ontology

IFN- Interferon gamma

IL-1 Interleukin 1 beta

IL-10 Interleukin 10

IL-12p70 Interleukin 12p70

IL-17A Interleukin 17A

JAK Protein Janus Kinase

KEGG Bộ cơ sở dữ liệu Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes M-CSF Yếu tố kích thích quần thể đại thực bào

MHC Phức hợp kháng nguyên phù hợp tổ chức

NFκB Yếu tố trong nhân tăng cường chuỗi nhẹ kappa của các

tế bào B đã hoạt hóa NGF- Yếu tố tăng trưởng thần kinh beta

PEA Phương pháp Pathway enrichment Analysis

PDGF-BB Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu

RLCT Rối loạn cơ tròn (Spida Bifina)

RLCT1 Rối loạn cơ tròn trước khi ghép BMMNC

RLCT2 Rối loạn cơ tròn sau khi ghép BMMNC

STAT Yếu tố truyền tín hiệu và chất hoạt hóa của phiên mã

TB Trung bình

TGF- Transforming growth factor-beta

Th Tế bào T trợ giúp

TNF- Yếu tố hoại tử u alpha

Tyk Protein tyrosine kinase

VTCN Viêm tủy cắt ngang (Transverse Myelitis)

hai trường hợp bệnh nhân RLCT trước và sau ghép tế bào đơn nhân tuỷ xương 38

Hình 6 Mạng lưới tương tác của 15 yếu có mức độ biểu hiện thay đổi tương đồng ở hai

trường hợp bệnh nhân RLCT trước và sau ghép tế bào đơn nhân tuỷ xương với các yếu tố khác 39

Hình 7 Phân tích GO term nhóm 15 yếu tố có mức độ biểu hiện thay đổi tương đồng ở

hai trường hợp bệnh nhân RLCT trước và sau ghép tế bào đơn nhân tuỷ xương (cut off độ tin cậy > 0,4) 40

Hình 8 Phân tích 66 yếu tố tương tác với nhau trích xuất từ danh sách (2) (cut off độ tin

cậy 0,7) cho thấy có 18 GO term được phát hiện 41

Hình 9 Hình ảnh phân tích GO term của hai nhóm yếu tố cho thấy chúng có chung ba

GO term đều liên quan đến cytokine 42

Hình 10 KEGG mô tả sự tham gia của các yếu tố có mức độ biểu hiện thay đổi tương

đồng ở hai trường hợp bệnh nhân ở bệnh nhân RLCT trước và sau ghép BMMNC và các yếu tố tương tác với chúng 44

Hình 11 Sơ đồ KEGG mô tả sự tham gia của của yếu tố có mức độ biểu hiện thay đổi

tương đồng ở hai trường hợp bệnh nhân RLCT trước và sau ghép BMMNC và các yếu tố tương tác với chúng vào TNF signalling pathway 45

Hình 12 Sơ đồ KEGG mô tả sự tham gia của của yếu tố có mức độ biểu hiện thay đổi

tương đồng ở hai trường hợp bệnh nhân RLCT trước và sau ghép BMMNC và các yếu tố tương tác với chúng 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Số lượng mẫu CSF thu thập từ các bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN 23 Bảng 2 Đặc điểm của mẫu CSF thu được từ ba nhóm bệnh RLCT, liệt và VTCN 23 Bảng 3 Hàm lượng cytokine gây viêm trong CSF của bệnh nhân RLCT, VTCN và liệt

Bảng 6 Hàm lượng cytokine và yếu tố tăng trưởng trong RLCT của bệnh nhân RLCT số

1 trước và sau khi ghép BMMNC (pg/ml) 32

Bảng 7 Hàm lượng cytokine và yếu tố tăng trưởng trong RLCT của bệnh nhân RLCT số

2 trước và sau khi ghép BMMNC (pg/ml) 34

Bảng 8 Danh sách các yếu tố phân tích Danh sách 1 gồm 15 yếu tố có mức độ biểu hiện

thay đổi tương đồng trong dịch não tuỷ ở hai bệnh nhân RLCT trước và sau ghép tế bào đơn nhân tuỷ xương và Danh sách 2 gồm 66 yếu tố tương tác với nhau trích xuất từ bộ cơ

sở dữ liệu StringDB 36

1.1.3 Viêm tủy cắt ngang (Transverse Myelitis) 8

1.2 Các cytokine và yếu tố tăng trưởng tham gia điều hòa miễn dịch 9

1.2.1 Cytokine gây viêm 9

1.2.2 Cytokine kháng viêm 11

1.2.3 Các yếu tố tăng trưởng tế bào 12

1.3 Biện pháp điều trị bệnh tổn thương thần kinh 13

1.4 Tình hình nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu 16

1.4.1 Tình hình nghiên cứu 16

1.4.2 Mục tiêu nghiên cứu 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 19

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu dịch não tuỷ 19

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 20

2.2.3 Định lượng cytokine và yếu tố sinh trưởng trong CSF 20

2.2.4 Phân tích kết quả định lượng các cytokine và yếu tố sinh trưởng 21

2.2.5 Phân tích mạng lưới tương tác giữa các protein bằng String DB 21

2.2.6 Phân tích “Pathway enrichment” 21

2.2.7 Phân tích thống kê 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 22

3.1 Thu thập mẫu 22

3.2 Đặc điểm dịch não tủy 23

3.3 Kết quả định lượng các cytokine và yếu tố sinh trưởng 24

3.3.1 Kết quả định lượng các cytokine và yếu tố tăng trưởng của nhóm bệnh tổn thương thần kinh RLCT, liệt và VTCN 25

3.3.1.1 Sự biểu hiện của các cytokine gây viêm trong dịch não tủy của bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN 25

3.3.1.2 Sự biểu hiện cytokine kháng viêm ở trong dịch não tủy của bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN 28

3.3.1.3 Sự biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng trong dịch não tủy của bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN 29

3.4 Nghiên cứu một số trường hợp bệnh nhân RLCT trước và sau khi sau khi điều trị bằng ghép tế bào gốc đơn nhân tủy xương (BMMNC) 31

3.4.1 Bệnh nhân số 1 31

3.4.2 Bệnh nhân số 2 33

3.5 Sự tương tác của các protein và sự tham gia vào các quá trình sinh học của nhóm yếu tố thay đổi mức độ biểu hiện ở bệnh nhân RCLT trước khi ghép và sau khi ghép BMMNC 35

3.5.1 Phân tích sự tương tác giữa các cytokine 35

3.5.2 Sự tham gia của cytokine với các quá trình sinh học 40

3.5.3 Sự tham gia của các cytokine vào KEGG 42

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN 47 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53

MỞ ĐẦU

Tổn thương thần kinh (Nerve pain and nerve damage) là dạng bệnh lý xuất hiện khi hệ thống thần kinh bị tổn thương, có thể gây ảnh hưởng đến các bộ phận khác nhau của cơ thể (bệnh thần kinh ngoại biên, dây thần kinh trụ hoặc bệnh thần kinh hướng tâm) hoặc ảnh hưởng toàn thân Tùy vào vị trí tổn thương mà bệnh nhân sẽ xuất hiện các triệu chứng khác nhau Chẳng hạn như nếu dây thần kinh tự chủ có vấn đề thì có thể gây mất khả năng kiểm soát các hoạt động tự chủ hoặc một phần các hoạt động tự

ý của cơ thể, bệnh nhân sẽ có các triệu chứng như đau thắt ngực, tiết ra quá nhiều hoặc quá ít mồ hôi, có cảm giác lâng lâng, khô miệng, táo bón, rối loạn chức năng tình dục

và rối loạn cơ tròn Hoặc nếu dây thần kinh vận động có vấn đề sẽ gây mất khả năng kiểm soát cử động, người bệnh có thể gặp các triệu chứng bao gồm yếu cơ, teo cơ, co giật và tê liệt [37] Theo thông tin từ trang web tin tức liên quan đến sức khoẻ và hạnh phúc của con người (https://www.webmd.com/), có tới hơn 100 loại tổn thương hệ thần kinh khác nhau với các triệu chứng khác nhau và có những yêu cầu về điều trị khác nhau Có những nguyên nhân có thể dẫn đến đau dây thần kinh và tổn thương hệ thần kinh như rối loạn chuyển hóa (ví dụ như bệnh thần kinh do tiểu đường ngoại biên (Peripheral diabetic neuropathy - PDN), nhiễm vi rút (ví dụ như đau dây thần kinh sau herpetic, HIV, bệnh phong), rối loạn tự miễn (ví dụ như đa xơ cứng và hội chứng Guillain – Barre) [81], hóa trị do bệnh thần kinh ngoại biên, chấn thương (ví dụ như chấn thương tủy sống (SCI) và cắt cụt chi), rối loạn viêm, do yếu tố di truyền [14] và ung thư [4] Do vậy, các bệnh lý thần kinh là rất đa dạng và phức tạp có liên quan đến nhiều yếu tố khác nhau

Trong ba thập kỷ vừa qua, các bệnh thần kinh như rối loạn cơ tròn, liệt và viêm tủy cắt ngang gia tăng cấp tiến đã gây ra những thách thức đối với xã hội và gia đình của trẻ em mắc phải bệnh Hiện tại chưa có phương pháp chữa trị hiệu quả cho một số bệnh thần kinh như tự kỷ, bại não, rối loạn cơ tròn (RLCT), liệt và viêm tủy cắt ngang (VTCN) ….; và việc điều trị chủ yếu tập trung vào điều trị triệu chứng bệnh và đào tạo

kỹ năng xã hội Ngoài ra, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về nguyên nhân và cách điều trị các bệnh rối loạn cơ tròn, liệt và viêm tủy cắt ngang Đã

có bằng chứng chứng minh giả thiết về tình trạng viêm do rối loạn miễn dịch có vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn thương thần kinh [88] Các phân tử tín hiệu của hệ

thống miễn dịch là cytokine, gồm có cytokine viêm và cytokine chống viêm, thay đổi

ở những người mắc bệnh lý thần kinh Các cytokine viêm tăng cao có liên quan đến sự hiện diện của cơn đau sau tổn thương dây thần kinh, trong khi các cytokine chống viêm có liên quan đến việc điều hòa hệ thống miễn dịch và giảm đau thần kinh [2, 88] Một số nghiên cứu với cytokine huyết thanh ở đối tượng bệnh nhân mắc viêm tủy cắt ngang cho thấy IL-6 có thể đóng vai trò quan trọng trong bệnh lý viêm tủy cắt ngang

do nó có liên quan đến sự tồn tại của các tế bào tạo ra kháng thể chống AQP4 trong tuần hoàn ngoại vi và tăng cường phản ứng viêm ở hệ thần kinh trung ương [90] Bên cạnh đó, IL-6 tăng cao hơn trong dịch não tủy của bệnh nhân viêm tủy cắt ngang so với dịch não tuỷ của các bệnh lý thần kinh có nguyên nhân không phải viêm thần kinh [43, 95]

Những gánh nặng về kinh tế, điều trị đang gây áp lực không hề nhỏ lên các gia đình người bệnh mắc RLCT, liệt và VTCN Các hướng điều trị hiện tại chủ yếu nhằm giảm triệu chứng bệnh, không điều trị dứt điểm được hoặc chưa hiểu rõ được nguyên nhân của bệnh để điều trị nguyên nhân gốc của bệnh Ngoài ra, việc thu thập mẫu tại Việt Nam cũng là thử thách đối với chúng tôi, mẫu dịch não tủy chỉ được thu thập đối với các bệnh nhân tham gia vào điều trị BMMNC tại Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen và được sự cho phép từ phía gia đình bệnh nhân Dựa vào tính cấp thiết của nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu dịch não tủy của các bệnh nhân

rối loạn cơ tròn, liệt và viêm tủy cắt ngang để thực hiện đề tài “Đặc điểm một số

thành phần cytokine và yếu tố tăng trưởng tế bào trong dịch não tuỷ của bệnh

nhân rối loạn cơ tròn, viêm tuỷ cắt ngang và liệt”

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Luminex để tìm hiểu mức độ biểu hiện của cytokine và yếu tố tăng trưởng trong dịch não tuỷ của bệnh nhân RLCT, liệt và VTCN để tìm hiểu sự khác biệt về mức độ biểu hiện của các protein này giữa ba nhóm bệnh lý liên quan đến tổn thương thần kinh Chúng tôi cũng

so sánh mức độ biểu hiện của các cytokine và yếu tố tăng trưởng trong dịch não tuỷ của một số trường hợp bệnh nhân RLCT trước khi sử dụng liệu pháp ghép tế bào gốc đơn nhân có nguồn gốc tuỷ xương (BMMNC) để tìm hiểu sự liên quan của việc dung liệu pháp ghép tế bào gốc này với sự thay đổi mức độ biểu hiện của các protein Bên

cạnh đó, sử dụng các phương pháp phân tích tin sinh để tìm hiểu sự tham gia của các yếu tố quan trọng có liên qua đến việc ghép tế bào gốc với các quá trình sinh học

Kết quả nghiên cứu cho thấy, chúng tôi đã phát hiện được mức độ biểu hiện khác nhau của 22 cytokine và yếu tố tăng trưởng trong dịch não tuỷ của bệnh nhân RLCT trước và sau ghép BMMNC, liệt và VTCN Kết quả thu được chỉ 7 yếu tố trong tổng số 22 yếu tố biểu hiện khác nhau ở ba loại bệnh lý thần kinh (RLCT, liệt và VTCN), đó là: IL-17A, IL-6, TNF-α, GDF-15, APRIL, IL-6 và IL-21 Đối với việc ghép BMMNC, sử dụng liệu pháp ghép BMMNC này đã làm thay đổi mức độ biểu hiện của các yếu tố cytokine và yếu tố tăng trưởng trong CSF của hai trường hợp bệnh nhân RLCT Trong đó có 15 yếu tố thay đổi tương đồng (cùng tăng hoặc cùng giảm) ở

cả hai trường hợp bệnh nhân RLCT được báo cáo bao gồm: BAFF, IL-33R, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, TNF-α, EGF, NGF-β, IL-10, IL-4, IL-6, IL-31, G-CSF và GDF-

15 Trong số 15 yếu tố này, có 9 yếu tố đều giảm sau ghép ở cả hai trường hợp bệnh nhân RLCT được báo cáo là: BAFF, IL-33R, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, TNF-α, EGF và NGF-β và 6 yếu tố là tăng biểu hiện sau ghép BMMNC ở cả hai trường hợp bệnh nhân RLCT trên là: IL-10, IL-4, IL-6, IL-31, G-CSF và GDF-15

Các yếu tố có mức độ biểu hiện thay đổi tương đồng ở cả hai trường hợp bệnh nhân RLCT có liên quan đến ghép BMMNC này được cho là manh mối ban đầu quan trọng trong việc chứng minh tế bào gốc tác động đến điều hoà miễn dịch như thế nào

Do đó, chúng tôi phân tích tin sinh sự tương tác giữa chúng và các quá trình sinh học

mà chúng tham gia Phép phân tích mạng lưới tương tác cho thấy các protein phân tích trong đề tài này tương tác với nhau và với các protein khác mà không được phân tích trong nghiên cứu này Các yếu tố này tham gia vào nhiều GO terms liên quan đến điều

hoà (“Cytokine-mediated signalling pathway”, “Cellular response to cytokine stimulus” và “Response to cytokine”) và KEGG pathway là các quá trình truyền tín

hiệu liên quan đến trạng thái viêm (IL-17 signaling pathway, TNF signalling pathway

và NF-KAPPA B singaling pathway)

Kết quả của đề tài nghiên cứu này có giá trị quan trọng để bổ sung vào kiến thức khoa học còn thiếu sót về mức độ biểu hiện của các cytokine gây viêm, chống viêm và yếu tố tăng trưởng trong dịch não tuỷ của bệnh nhân mắc bệnh có liên quan đến rối loạn hệ thần kinh, cụ thể là RLCT, liệt và VTCN Đồng thời, kết quả thăm dò ban đầu cũng chỉ ra sự liên quan của việc ghép BMMNC với sự thay đổi mức độ biểu

hiện của cytokine và yếu tố tăng trưởng trong một số trường hợp bệnh nhân tham gia ghép tế bào gốc Đây là tiền đề quan trọng cho việc triển khai các nghiên cứu tiếp theo

về cơ chế sinh học phân tử của bệnh sinh của RLCT, liệt và VTCN và cơ chế tác động của BMMNC để điều trị bệnh RLCT

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Một số bệnh tổn thương thần kinh

1.1.1 Rối loạn cơ tròn (Spinal Bifina)

Rối loạn cơ tròn (RLCT - Spinal Bifina) là một dạng khuyết tật của ống thần kinh (neural tube defect) Thuật ngữ này mô tả gai xương bị hở hay cột sống bị nứt tạo

kẽ hở Hậu quả nghiêm trọng nhất của RLCT do nứt đốt sống có thể bao gồm cơ suy yếu hoặc liệt ở phần do cột sống điều khiển bị nứt, và có thể dẫn đến mất khả năng kiểm soát bàng quang và đại tràng Thoát vị màng não tuỷ là phần màng cứng bao bọc bảo vệ xung quanh tủy sống bị phình ra ngoài thông qua vết nứt trên đốt sống tạo thành túi thoát vị Trong các trường hợp thoát vị màng não tủy chưa dẫn tới ảnh hưởng tuỷ sống nên bệnh có thể điều trị mà không có ảnh hưởng hoặc ít ảnh hưởng tới đường thần kinh Thoát vị màng não tủy có thể dẫn đến các triệu chứng đi kèm là rối loạn các

cơ tròn; cụ thể, một số nghiên cứu cho thấy 42,2 – 71,2% các bệnh nhân mắc thoát vị màng não tủy sẽ dẫn đến rối loạn chức năng ruột (đại tiện, tiểu tiện không tự chủ hoặc táo bón) [2, 72] Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng sống của người bệnh, gây cho họ cảm giác xấu hổ, trầm cảm và tự cách ly bản thân với xã hội

Rối loạn cơ tròn (RLCT) có nhiều dạng khác nhau tùy thuộc vào nguyên nhân

cơ bản và các triệu chứng Các triệu chứng đa dạng bao gồm bàng quang hoạt động quá mức, tiểu gấp, tần suất, tiểu không tự chủ hoặc khó đi tiểu Theo tác giả Dorsher

và cộng sự, các dạng RLCT do ảnh hưởng thần kinh thường gặp bao gồm tiểu không

tự chủ, bàng quang co cứng, bàng quang giãn và hỗn hợp nhiều triệu chứng [21] Những bệnh nhân tiểu không tự chủ do mất kiểm soát bàng quang có nguyên nhân là

từ những tổn thương trên tủy sống và não bộ (hệ thần kinh thực vật) gây ra những kích thích đi tiểu không mong muốn [21] Bàng quang co cứng thường do tổn thương và

dò tủy sống ở đốt sống thứ 10 dẫn đến cơ tròn bàng quang và cơ niệu đạo không hoạt động cùng lúc và thường co thắt chặt ở cùng một thời điểm khiến bệnh nhân không đi tiểu được và có thể gây hại cho thận [1, 21] Bàng quang giãn hay bàng quang giảm lực trương thường do tổn thương thần kinh ngoại vi đi từ tủy sống khiến bệnh nhân mất cảm giác áp lực bàng quang khi bàng quang đầy nước tiểu, và đôi khi bệnh nhân

sẽ xảy ra tình trạng tiểu són do cơ tròn hoạt động không bình thường [21] Cuối cùng

là tình trạng xảy ra do sự kết hợp các dạng đã nêu trên [21]

Những nghiên cứu trên thế giới hiện nay xoay quanh nguyên nhân và các liệu pháp điều trị RLCT Tỷ lệ hiện mắc RLCT ở Hoa Kỳ và nhiều nước châu Âu được ước tính là 0,5 - 0,8 trường hợp trên 1.000 ca sinh [11], trong khi tỷ lệ hiện mắc ở một

số vùng của Trung Quốc đã được báo cáo cao hơn 10 lần so với tỉ lệ trên (lên tới ~6 trường hợp trên 1000 ca sinh) [49] Nguyên nhân của bệnh xuất phát từ nhiều nguồn khác nhau, từ cả hai yếu tố di truyền, yếu tố miễn dịch và môi trường đều góp phần vào gây ra RLCT Ước tính nguy cơ của yếu tố di truyền gây bệnh là khoảng 60 - 70% tính trên cơ sở tỷ lệ tương đối của các anh chị em bị ảnh hưởng khi được phân tích trong các cuộc khảo sát về tỷ lệ hiện mắc vào những năm 1960 ở South Wales, Glasgow và London, Vương quốc Anh [10] Các yếu tố môi trường có liên quan đến gây bệnh RLCT bao gồm tiếp xúc với chất ô nhiễm như ô nhiễm không khí [68], các hợp chất liên quan đến nitrat [8], thuốc trừ sâu [7] … và và chất độc hại cá nhân như rượu và thuốc lá [30] Ngoài ra, yếu tố dinh dưỡng trong quá trình mang thai của các

bà mẹ cũng ảnh hưởng đến nguy cơ mắc SB Theo nghiên cứu Kirke và cộng sự năm

1993, tình trạng giảm folate trong quá trình mang thai là yếu tố ảnh hưởng đến việc tăng nguy cơ mắc RLCT [45] Tuy nhiên, hầu hết các yếu tố này không được quan sát một cách nhất quán, xuất hiện không thường xuyên hoặc không cho thấy mức độ rủi ro cao

1.1.2 Liệt (Paralysis)

Liệt là tình trạng mất khả năng kiểm soát một cơ hoặc một nhóm cơ trong một

bộ phận của cơ thể Theo thông tin từ trang https://www.webmd.com/, liệt cục bộ thường ảnh hưởng đến các vùng như mặt, bàn tay, bàn chân hoặc dây thanh âm Liệt toàn thân được chia nhỏ dựa trên mức độ cơ thể bị liệt: liệt một bên chỉ ảnh hưởng đến một chi, chẳng hạn như một tay hoặc một chân; liệt nửa người ảnh hưởng đến một bên của cơ thể, chẳng hạn như chân và cánh tay của cùng một bên cơ thể Chứng liệt nửa người ảnh hưởng đến cùng một khu vực ở cả hai bên của cơ thể, chẳng hạn như cả hai cánh tay hoặc cả hai bên mặt Bệnh liệt nửa người có thể ảnh hưởng đến phần thân dưới (bao gồm cả 2 chân) hoặc phân thân trên Chứng liệt tứ chi ảnh hưởng đến cả hai cánh tay và cả hai chân và đôi khi toàn bộ khu vực từ cổ trở xuống Chức năng của tim, phổi và các cơ quan khác cũng có thể bị ảnh hưởng

Nguyên nhân của liệt có thể do bất kỳ phần nào của hệ thống chuyển tiếp tín hiệu thần kinh hoặc bộ phận xử lý thông tin tín hiệu thần kinh (chẳng hạn như não, tủy sống, dây thần kinh hoặc điểm nối giữa dây thần kinh và cơ) bị hư hỏng, các tín hiệu

di chuyển sẽ không đến được các cơ và dẫn đến tê liệt Một trong số các nguyên nhân của liệt là do tổn thương dây thần kinh điều khiển hoạt động, do đó có thể làm tê liệt các cơ mà dây thần kinh bị tổn thương phụ trách Một người có thể bị liệt bẩm sinh do

dị tật bẩm sinh như tật nứt đốt sống, xảy ra khi não, tủy sống và/hoặc lớp bao bọc bảo

vệ họ không hình thành đúng cách Trong hầu hết các trường hợp, mọi người bị tê liệt

do tai nạn hoặc tình trạng bệnh lý ảnh hưởng đến cách hoạt động của cơ và dây thần kinh Một nghiên cứu tiến hành khảo sát dân số Bại liệt do Quỹ Christopher và Dana Reeve tài trợ và Trung tâm Phát triển và Người khuyết tật của Đại học New Mexico triển khai cho thấy có gần 1/50 người Mỹ đang sống chung với một dạng liệt – tương đương với khoảng sáu triệu người trên tổng dân số [20]

Trạng thái liệt cấp tính có thể bắt nguồn từ các hội chứng tổn thương thần kinh,

ví dụ như hội chứng Guillain-Barre (GBS) do những tổn thương ở các dây thần kinh gây ra trực tiếp bởi virus hoặc gián tiếp thông qua sự đáp ứng miễn dịch quá mức với các kháng nguyên virus [27], hoặc hội chứng liệt Trung Quốc (Chinese paralytic syndrome) gặp ở 88 bệnh nhân/90 bệnh nhân có biểu hiện liệt cấp tính tại phía bắc Trung Quốc; đây là một hội chứng có biểu hiện lâm sàng giống với GBS nhưng lại có sinh bệnh lý không giống với các bệnh nhân GBS [56]

Hệ thần kinh bị tổn thương có thể chia thành hai loại là chấn thương não bộ và chấn thương tủy sống, cả hai loại đều có thể dẫn đến liệt cấp tính hoặc liệt mãn tính Với các bệnh chấn thương tủy sống, các bệnh thường gặp dẫn đến liệt như bệnh đa xơ cứng xảy ra do viêm tự miễn ở giai đoạn sớm của tuổi trưởng thành, dẫn đến cơ thể tự tấn công các thành phần của bao myelin, làm các sợi myelin bị tách ra thành từng mảng dẫn đến hiệu quả dẫn truyền xung thần kinh kém và dẫn đến liệt [83]; hay bệnh viêm tủy cắt ngang gây ra viêm một hoặc nhiều đoạn của tủy sống (thường xảy ra sau khi bị nhiễm trùng) dẫn đến các biểu hiện lâm sàng như liệt mềm (Flaccid Paralysis)

và mất khả năng vận động [92] Với các bệnh tổn thương não, Liệt thường là triệu chứng lâm sàng của đột quỵ do sự gián đoạn trong quá trình cung cấp máu cho não (vỡ hoặc rò rỉ hoặc tắc mạch máu não bởi các cục máu đông hay vật thể lạ) hay chấn thương sọ não do va đập mạnh hay các khối u đè lên, xâm lấn mô não bên cạnh Ngoài

ra, liệt cũng là biểu hiện lâm sàng sớm của trẻ mắc bệnh bại não do tổn thương não trong thời kỳ mang thai [57]

1.1.3 Viêm tủy cắt ngang (Transverse Myelitis)

Viêm tủy cắt ngang là tình trạng viêm cả hai bên của một đoạn tủy sống Rối loạn thần kinh này thường làm hỏng lớp vật liệu cách điện bao bọc các sợi tế bào thần kinh (myelin) Viêm tủy cắt ngang làm gián đoạn các thông điệp mà các dây thần kinh tủy sống gửi đi khắp cơ thể Điều này có thể gây đau, yếu cơ, tê liệt, các vấn đề về cảm giác hoặc rối loạn chức năng bàng quang và ruột Các dấu hiệu đặc trưng của hội chứng là mức độ cảm giác tăng hoặc giảm dần gây ra bởi sự gián đoạn trong cơ chế thần kinh tại các điểm của tủy sống

Hội chứng viêm tủy cắt ngang có thể phát sinh từ nhiều nguồn khác nhau Theo nguồn thống kê từ trường Đại học Y John Hopskin (www.hopkinsmedicine.org), có khoảng 60% các trường hợp mắc viêm tủy cắt ngang vẫn chưa rõ nguyên nhân, 40% còn lại liên quan đến các rối loạn tự miễn như đa xơ cứng, viêm thần kinh tủy, lupus ban đỏ hệ thống, hội chứng Sjogren, bệnh Sarcoidosis và các bệnh khác Một trong số các nguyên nhân thường gặp là hiện tượng hệ thống miễn dịch biểu hiện quá mức sau khi nhiễm trùng hoặc tiêm chủng Kết quả của sự nhiễm trùng trực tiếp khiến hệ thống miễn dịch đáp ứng miễn dịch nhưng sự biểu hiện quá mức không thể kiểm soát dẫn đến hệ thống miễn dịch sẽ chống lại hệ thống thần kinh của cơ thể bào gồm chống lại các sợi thần kinh thông qua khử myelin (bệnh đa xơ cứng, viêm dây thần kinh thị giác ) hoặc tấn công tủy sống gây tổn thương tủy (bệnh viêm tủy cắt ngang, bệnh Devic

…) [40, 44] Tại Anh, các ước tính về tỷ lệ mắc hàng năm của bệnh viêm tuỷ cắt ngang tự phát hoặc sau lây nhiễm viêm tủy dao động từ 1,3 đến 8 trường hợp/1 triệu dân [22] Mặc dù rối loạn có thể phát triển ở mọi lứa tuổi, nhưng tỷ lệ mắc bệnh đạt ngưỡng cao nhất ở hai mức tuổi là ở tuổi 10 đến 19 và ở tuổi 30 đến 39 [5] Không có

mô hình rõ ràng trong số các trường hợp viêm tủy cắt ngang liên quan đến giới tính, phân bố địa lý hoặc yếu tố gia đình

Dấu hiệu bệnh lý của viêm tủy cắt ngang là sự xâm nhập của tập hợp các tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân vào các đoạn của tủy sống với các mức độ khử myelin khác nhau, chiếm không gian quanh mạch, cũng như ảnh hưởng đến hoạt động của các

tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh đệm hình [44] Ở những trường hợp bệnh

nghiêm trọng, có thể quan sát thấy các tổn thương viêm dây thần kinh thực vật chứa các lắng đọng của globulin miễn dịch và bổ thể xung quanh các mạch máu nhỏ và hoại

tử Nhiều bằng chứng quan sát từ các trường hợp nhiễm trùng toàn thân hoặc miễn dịch học gây ra viêm tủy cắt ngang cho thấy rằng các phân tử bắt chước (molecular mimicry) và sự phát triển của các tự kháng thể có thể đóng vai trò trong cơ chế bệnh sinh bệnh [44, 93] Bệnh nhân bị viêm tủy cắt ngang liên quan đến đa xơ cứng có thể phục hồi một phần đáng kể hoặc thậm chí hoàn toàn, nhưng bệnh nhân bị viêm tủy cắt ngang hoặc viêm thần kinh tủy liên quan đến các bệnh khác thường để lại những di

chứng đáng kể do sự tổn thương thần kinh không thể hồi phục Vì vậy việc phát hiện

sớm và can thiệp sớm giảm thiểu những di chứng do bệnh gây ra

1.2 Các cytokine và yếu tố tăng trưởng tham gia điều hòa miễn dịch

1.2.1 Cytokine gây viêm

Cytokine gây viêm hoặc cytokine tiền viêm là một loại phân tử tín hiệu được

tiết ra từ các tế bào miễn dịch như tế bào T trợ giúp (Th), đại thực bào và một số loại tế bào khác thúc đẩy quá trình viêm [99] Một số cytokine gây viêm đặc trưng như interleukin-1 (IL-1), IL-2 và IL-6, yếu tố hoại tử khối u alpha (tumor necrosis factor alpha – TNF-), interferon gamma (IFN-γ) và yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt

- đại thực bào (Granulocyte-macrophage colony stimulating factor - GM-CSF) … [74] Chúng đóng vai trò quan trọng làm trung gian cho phản ứng miễn dịch bẩm sinh

và chủ yếu được sản xuất và tham gia vào quá trình điều chỉnh các phản ứng viêm Cytokine có thể được sản xuất từ mô thần kinh ngoại vi trong quá trình sinh lý và bệnh

lý bởi các đại thực bào cư ngụ tại vị trí mô và các đại thực bào đã được hoạt hóa, tế bào mast, tế bào nội mô và tế bào Schwann

Các cytokine gây viêm có vai trò khởi đầu phản ứng viêm và điều chỉnh khả năng bảo vệ của vật chủ chống lại các tác nhân gây bệnh và do đó làm trung gian cho phản ứng miễn dịch bẩm sinh Ví dụ, yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-) được sản xuất bởi các đại thực bào hoạt hóa đáp ứng với vi khuẩn, gián tiếp lôi kéo bạch cầu trung tính và đại thực bào đến các vị trí bị nhiễm trùng bằng cách kích thích các tế bào nội mô để sản xuất các phân tử kết dính và sản xuất các chemokin, là các cytokine hóa hướng động bạch cầu [70] Hay interferon gamma (IFN-γ) là một cytokine quan trọng được sản xuất chủ yếu bởi các tế bào Th1 và từ tế bào giết tự nhiên (Natural Killer), Tc

(T cytotoxic cells) có nhiều chức năng trong cả hai hệ thống miễn dịch tự nhiên và thu được trong khả năng miễn dịch bẩm sinh và thích nghi chống lại virus, một số bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và động vật nguyên sinh [76] Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt - đại thực bào (GM-CSF) kích thích tế bào gốc sản xuất bạch cầu hạt (bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa kiềm và bạch cầu ưa acid) và bạch cầu đơn nhân; bạch cầu đơn nhân thoát ra khỏi vòng tuần hoàn và di chuyển vào mô, sau đó chúng trưởng thành thành đại thực bào và tế bào đuôi gai [73] GM-CSF cũng có một số ảnh hưởng đến các tế bào trưởng thành của hệ thống miễn dịch [24] Bên cạnh đó, phân tử IL-1 là chất trung gian quan trọng của phản ứng viêm và tham gia vào nhiều hoạt động khác nhau của tế bào, bao gồm tăng sinh, biệt hóa và apoptosis của tế bào [79] Trong khi đó, IL-6 được các đại thực bào tiết ra để đáp ứng với các phân tử vi sinh vật

cụ thể, được gọi là các mẫu phân tử liên kết với mầm bệnh (Pathogen associated molecular patterns) IL-6 chịu trách nhiệm kích thích tổng hợp protein giai đoạn cấp tính, sản xuất bạch cầu trung tính trong tủy xương và hỗ trợ sự phát triển của tế bào B

và đối kháng với tế bào T điều hòa [46]

Do có hoạt động tiền viêm, các cytokine tiền viêm có xu hướng làm cho bản thân bệnh hoặc các triệu chứng liên quan đến bệnh nặng hơn bằng cách gây sốt, viêm, phá hủy mô và thậm chí trong một số trường hợp có thể gây sốc và tử vong [19] Quá nhiều lượng cytokine tiền viêm đã được chứng minh là có thể gây ra các tác dụng bất lợi [74] Các cytokine gây viêm như TNF-, IL-6 và IL-1 có thể vượt qua hàng rào máu não và thúc đẩy hành vi sốt nhẹ hay bệnh tật vùng dưới đồi [16] Điều đó cho thấy cytokine và các yếu tố gây viêm có liên quan đến sinh lý bệnh rối loạn thần kinh Trong bệnh tổn thương thần kinh, các đại thực bào và tế bào Schwann tập trung xung quanh vị trí bị thương của dây thần kinh và tiết ra các cytokine và các yếu tố tăng trưởng cụ thể cần thiết để tái tạo thần kinh Tuy nhiên với những bệnh lý nặng dẫn đến kích ứng viêm cục bộ của hạch rễ lưng (DRG) không chỉ làm tăng các cytokine tiền viêm (như IL-1β, IL-6, IL-18, …) mà còn làm giảm các cytokine chống viêm (như IL-

5, IL-10, …) [96] Đối với bệnh nhân thoát vị, cytokine cũng có thể được tổng hợp và giải phóng từ bên trong tủy sống [18], DRG soma [75], hoặc vùng da bị viêm [33] Hơn nữa, các cytokine có thể được vận chuyển ngược dòng từ ngoại vi, thông qua các

cơ chế trục hoặc không trục, đến DRG và sừng lưng, nơi chúng có thể ảnh hưởng sâu

sắc đến hoạt động của tế bào thần kinh [67] và do đó góp phần vào căn nguyên của các bệnh lý và các trạng thái đau khác nhau

1.2.2 Cytokine kháng viêm

Các cytokine kháng viêm là các phân tử điều hòa miễn dịch kiểm soát đáp ứng cytokine tiền viêm Chức năng chính của các cytokine kháng viêm là điều hòa miễn dịch, chúng hoạt động phối hợp với các chất ức chế cytokine cụ thể và thụ thể hòa tan cytokine để điều chỉnh phản ứng miễn dịch của con người Vai trò sinh lý của chúng trong bệnh lý viêm và trong các trạng thái viêm toàn thân ngày càng được công nhận [66] Nếu nồng độ cytokine kháng viêm thấp sẽ dẫn đến tình trạng viêm quá mức, trong khi nếu nồng độ cytokine kháng viêm quá cao sẽ phá vỡ cơ chế chống xâm nhiễm của cơ thể trước vi sinh vật gây bệnh Các cytokine kháng viêm chính bao gồm IL-4, IL-5, IL-10 và IL-33 Các cytokine kháng viêm khác nhau sẽ có nguồn gốc và có vai trò cũng như tham gia các quá trình khác nhau, cụ thể như sau:

IL-4 (được sản xuất chủ yếu bởi tế bào mast, tế bào Th2, bạch cầu ưa acid và ưa bazơ) có nhiều vai trò sinh học, bao gồm kích thích tăng sinh tế bào B, tế bào T hoạt hóa, và biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma [23] IL-4 gây ra sự biệt hóa của tế bào

Th trẻ (tế bào Th 0) thành tế bào Th 2 Sau khi được kích hoạt bởi IL-4, tế bào Th 2 sau

đó tiết ra IL-4 bổ sung trong một vòng điều hòa ngược dương tính IL- 4 tham gia điều chỉnh chính trong miễn dịch thể dịch và đáp ứng, nó làm cho lớp tế bào B chuyển sang IgE và điều hòa sản xuất MHC lớp II [91] IL-4 làm giảm sản xuất tế bào Th1, đại thực bào, IFN-γ và IL-12 ở tế bào đuôi gai

IL-5 là một interleukin được sản xuất bởi tế bào Th2 và tế bào mast Thông qua liên kết với thụ thể IL-5 kích thích tăng trưởng tế bào B và tăng tiết globulin miễn dịch

- chủ yếu là IgA [86] Nó cũng là chất trung gian chính trong việc kích hoạt bạch cầu

ưa acid

IL-10 còn được gọi là yếu tố ức chế tổng hợp cytokine ở người (cytokine synthesis inhibitory factor) và là một cytokine chống viêm Tín hiệu IL-10 thông qua phức hợp thụ quan bao gồm hai protein thụ thể IL-10 thụ quan 1 và IL-10 thụ quan 2 [60] Do đó, thụ thể chức năng bao gồm bốn phân tử thụ thể IL-10 Liên kết IL-10 gây

ra tín hiệu STAT3 dẫn đến kích hoạt các Janus tyrosin kinase (JAK1 và Tyk2) Việc kích hoạt các protein JAK1 và Tyk2 khiến phosphoryl hóa các thụ thể IL-10R1 và IL-

10R2 tương ứng ở phần hướng ra ngoài tế bào chất của thụ thể [60] IL-10 là một cytokine có nhiều tác dụng trong điều hòa miễn dịch và viêm Nó điều chỉnh sự biểu hiện của các cytokine Th1, kháng nguyên MHC lớp II và các phân tử đồng kích thích trên đại thực bào Nó cũng giúp tăng cường sự tồn tại, tăng sinh và sản xuất kháng thể của tế bào B [47] IL-10 có thể chặn hoạt động của NF-κB và tham gia vào việc điều chỉnh lộ trình báo hiệu JAK-STAT [9]

IL-33 là một thành viên của họ IL-1 thúc đẩy mạnh mẽ việc sản xuất các cytokine liên kết với Th2 (ví dụ, IL-4) IL-33 là phối tử cho ST2 (IL1RL1), một thụ thể

họ IL-1 được biểu hiện nhiều trên tế bào Th2, tế bào mast và tế bào lympho bẩm sinh nhóm 2 [97] IL-33 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào, bao gồm nguyên bào sợi, tế bào mast, tế bào đuôi gai, đại thực bào, nguyên bào xương, tế bào nội mô và tế bào biểu mô [58] IL-33 cảm ứng tế bào Th, tế bào mast, bạch cầu ưa acid và bạch cầu ưa bazơ để sản xuất cytokine loại 2 [12]

1.2.3 Các yếu tố tăng trưởng tế bào

Yếu tố tăng trưởng tế bào (Growth factor) là một chất tự nhiên có khả năng kích thích tăng sinh tế bào, chữa lành vết thương và đôi khi là sự biệt hóa tế bào Thông thường nó là một protein tiết ra hoặc một hormone steroid Các yếu tố tăng trưởng rất quan trọng để điều chỉnh một loạt các quá trình tế bào Các yếu tố tăng trưởng thường hoạt động như các phân tử truyền tín hiệu giữa các tế bào Ví dụ như các cytokine và hormone liên kết với các thụ thể cụ thể trên bề mặt tế bào đích của chúng Chúng thường thúc đẩy sự biệt hóa và trưởng thành của tế bào, sự khác nhau giữa các yếu tố tăng trưởng Ví dụ, yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) tăng cường biệt hóa tạo xương [17], trong khi yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu kích thích biệt hóa mạch máu (tạo mạch) [98]

Các yếu tố tăng trưởng thần kinh (Nerve growth factor) là các polypeptit hỗ trợ

sự tồn tại, tăng sinh, biệt hóa và hình thành tế bào trong hệ thần kinh của động vật có

vú [6] Ngoài ra, các yếu tố tăng trưởng thần kinh là các neutrophin tham gia vào quá trình tạo mạch và đóng vai trò quan trọng với hệ tuần hoàn và các tế bào nội mô Những tác dụng có lợi này chủ yếu xảy ra thông qua việc tăng cường tiềm năng dẫn truyền nội tại, điều hòa tương tác với các dòng tín hiệu phân tử và cơ học sau khi hấp thu ngược dòng qua trung gian thụ thể [28, 54] Các thành viên trong họ yếu tố tăng

trưởng, bao gồm yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF, gồm có từ FGF1 đến FGF23), được tiết ra nổi bật bởi các tế bào Schwann hoặc tế bào thần kinh trong các điều kiện sinh lý Trong hệ thống thần kinh ngoại vi, yếu tố tăng trưởng duy trì vi môi trường tái tạo để kéo dài trục và mọc mầm sau chấn thương dây thần kinh Trong hệ thần kinh ngoại vi, vai trò của yếu tố tăng trưởng đối với sự tồn tại của tế bào thần kinh và khả năng phát triển thần kinh của tế bào thần kinh đã được nghiên cứu rộng rãi [15] Các nghiên cứu sâu hơn cho thấy biểu hiện yếu tố tăng trưởng được điều chỉnh ở các gốc thần kinh xa bị thương Tuy nhiên, yếu tố tăng trưởng nội sinh không đáp ứng được nhu cầu về quá trình tạo myelin của sợi trục và sự phát triển thần kinh [35]

1.3 Biện pháp điều trị bệnh tổn thương thần kinh

➢ Liệu pháp điều trị trực tiếp

Trong nhiều trường hợp, tổn thương dây thần kinh không thể chữa khỏi hoàn toàn Nhưng có nhiều phương pháp điều trị khác nhau có thể làm giảm các triệu chứng của bệnh Mục tiêu đầu tiên của việc điều trị là giải quyết tình trạng cơ bản gây ra đau dây thần kinh hoặc tổn thương dây thần kinh Nếu vết thương của người bệnh có vẻ không lành hẳn, bác sĩ phẫu thuật có thể sử dụng xét nghiệm ghi điện cơ (electromyography - EMG) trong phòng mổ để đánh giá xem các dây thần kinh bị sẹo

có đang hồi phục hay không Thực hiện xét nghiệm EMG trực tiếp trên dây thần kinh

sẽ chính xác và đáng tin cậy hơn

Đôi khi dây thần kinh nằm bên trong một không gian chật hẹp (tương tự như đường hầm) hoặc bị chèn ép bởi sẹo Trong những trường hợp này, bác sĩ phẫu thuật

có thể mở rộng không gian hoặc giải phóng dây thần kinh khỏi sẹo so với xét nghiệm trên da Đôi khi một phần của dây thần kinh bị cắt hoàn toàn hoặc bị hư hỏng không thể sửa chữa được, bác sĩ phẫu thuật có thể cắt bỏ phần bị hư hỏng và kết nối lại các đầu dây thần kinh khỏe mạnh (sửa chữa dây thần kinh) hoặc cấy ghép một phần dây thần kinh từ phần khác của cơ thể người bệnh (ghép dây thần kinh) Các thủ tục này có thể giúp phục hồi dây thần kinh của người bệnh Nếu bệnh nhân bị chấn thương dây thần kinh đặc biệt nghiêm trọng, dẫn đến quá trình liệt cơ do tổn thương thần kinh gây

ra bác sĩ có thể đề nghị phẫu thuật để phục hồi chức năng cho các cơ quan trọng bằng

cách chuyển nối đoạn dây thần kinh ở vị trí khác vào vị trí dây thần kinh bị tổn thương

➢ Các liệu pháp rèn luyện kỹ năng xã hội

Đối với trẻ em bị ảnh hưởng từ tổn thương thần kinh khiến chậm phát triển trí tuệ gặp vấn đề về giao tiếp, ngôn ngữ và ứng xử cần, có thể sử dụng các liệu pháp xã hội để cải thiện tình trạng bệnh Có các chương trình can thiệp sớm cho trẻ trước 5 tuổi, bao gồm cả dạy trẻ và tư vấn cho gia đình

• Rèn luyện kỹ năng xã hội

Trẻ chậm phát triển trí tuệ do tổn thương thần kinh thường hạn chế tiếp xúc với môi trường xung quanh, nhận thức kém và chậm trước những ảnh hưởng tác động của

xã hội so với trẻ thông thường Vì vậy trẻ cần được dạy về nhận thức, tăng cường sự chú ý của bản thân với môi trường xung quanh và cần những hoạt động để tăng sự thích ứng Ví dụ trẻ sẽ được rèn luyện kỹ năng xã hội, dạy kỹ năng tự lập bằng hoạt động chơi trị liệu, tức là trị liệu thông qua những trò chơi, từ đó tăng tương tác của trẻ với người xung quanh và môi trường xung quanh, cũng như tránh được sự nhàm chán

mà việc học thông thường mang lại Các hoạt động chung cũng giúp trẻ thích nghi cuộc sống và hòa nhập cộng đồng Việc khuyến khích trẻ hoàn thành công việc cũng giúp cải thiện tình trạng bệnh của trẻ

• Trị liệu ngôn ngữ

Việc chậm phát triển trí tuệ ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình học ngôn ngữ của trẻ Phát triển ngôn ngữ nói và ngôn ngữ hình thể là quá trình lâu dài và kiên trì Gia đình cần dành nhiều thời gian hơn để trò chuyện, hướng dẫn trẻ tập nói, tập thể hiện cảm xúc hay ngôn ngữ hình thể để trẻ có những thói quen hình thành trong cuộc sống và hình thành nên phản xạ ngôn ngữ nói và cơ thể Gia đình lưu ý phải hiểu ý muốn của trẻ mà gợi ý cho trẻ tự bộc lộ ra bằng lời hoặc bằng cử chỉ, không để trẻ ỷ lại ngôn ngữ bộc phát cơ bản như khóc, la hét, … chỉ để đòi những thứ mình mong muốn Thay vào đó gia đình cần hướng dẫn trẻ việc thể hiện bằng lời nói và cử chỉ sẽ

dễ dàng hơn việc la hét hay khóc

• Trị liệu hành vi chuyên sâu

Một trong các kỹ năng nâng cao là kỹ năng không gian thị giác kết hợp với học tập và rèn luyện trí nhớ Trẻ có thể được tham gia các trò chơi tăng khả năng đáp ứng thị giác, không gian như quan sát hình nhớ tên vật hay ghép hình Việc lặp đi lặp lại

các bài học giúp trẻ tăng khả năng ghi nhớ của trẻ theo thời gian Những trò chơi tăng cường phản xạ cũng giúp trẻ điều hòa đa giác quan, tổ chức lại thông tin và xử lý thông tin hiệu quả hơn

Việc cải thiện sự phát triển vận động của trẻ bằng cách kết hợp cả phương pháp vận động thô và vận động tinh Vận động thô là những kỹ năng vận động do kết hợp vận động của các nhóm cơ lớn trên cơ thể như lật, bò, trườn, chạy, nhảy, đi bộ … Phát triển vận động thô giúp phát triển và cân bằng sức mạnh cơ bắp, tăng vận động ở trẻ lười vận động và hạn chế ở trẻ tăng động Vận động thô là nền tảng để rèn luyện phát triển vận động tinh Vận động tinh chủ yếu là vận động bàn tay và các ngón tay, tạo ra

sự linh hoạt, tinh tế và phức tạp của đôi tay Hình thành mạng lưới giữa các vận động tinh giúp trẻ xử lý được những công việc đòi hỏi sự tinh tế cao hơn, đơn giản như việc ghép hình hay vẽ, tô màu,

Việc quản lý hành vi của trẻ là vấn đề khó khăn vì trẻ tăng động, không thích học, chỉ luôn làm theo ý thích của mình, tuy nhiên sự kiên nhân của các gia đình sẽ giúp trẻ cải thiện được tình trạng bệnh theo thời gian

Bên cạnh các phương pháp điều trị truyền thống đối với bệnh lý tổn thương thần kinh, hiện nay các nhà khoa học đã chứng minh được rằng có thể ứng dụng ghép

tế bào gốc để điều trị này [51, 63]

➢ Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh tổn thương thần kinh

Các bệnh tổn thương thần kinh thường được tiến hành phẫu thuật để điều trị Tuy nhiên, di chứng để lại sau phẫu thuật có thể là những cơn đau dai dẳng và dữ dội, rối loạn chức năng vận động, thậm chí liệt kéo dài Ngoài ra thời gian hồi phục chức năng thần kinh sau phẫu thuật rất lâu do tốc độ phát triển chậm của sợi thần kinh Và hướng điều trị khả quan kết hợp với phẫu thuật đang được hướng đến là ghép tế bào gốc Ngoài các chức năng của chính tế bào, tế bào gốc còn tiết ra các yếu tố hòa tan giúp sửa chữa các mô bị tổn thương; từ đó người ta ứng dụng các liệu pháp dựa trên tế bào gốc làm trung gian để điều trị các bệnh tổn thương thần kinh do thoái hóa, tự miễn

và viêm [80, 87]

Đối với các bệnh tổn thương thần kinh, việc cấy ghép tế bào gốc như tế bào gốc trung mô hay tế bào gốc đơn nhân tủy xương (BMMNC) nhằm tái tạo các tế bào thần kinh mới [26, 31, 69] Trên thế giới, các tế bào BMMNC đã được đưa vào các thử

nghiệm lâm sàng điều trị như bệnh nhồi máu cơ tim [39], đột quỵ [85], hay các bệnh thần kinh khác… Ví dụ như Alok Sharma và đồng nghiệp đã tiến hành cấy ghép BMMNC tự thân cho các bệnh nhân tự kỷ kết hợp với trị liệu xã hội; kết quả là đã cải thiện được tình trạng bệnh của các bệnh nhân tự kỷ và tác giả cũng cung cấp thêm bằng chứng về tính an toàn của việc truyền BMMNC [77] Việc truyền BMMNC cũng

an toàn và khả thi trên bệnh nhân bại não, giúp cải thiện đáng kể khả năng vận động thô và vận động tinh ở trẻ bại não, đặc biệt là với những trẻ bị liệt cứng khớp [53] Hiện nay, tác giả Nguyen Thanh Liem và đồng nghiệp đã tiến hành các thử nghiệm lâm sàng truyền tế BMMNC tự thân trên trẻ mắc chứng bại não [64] và rối loạn cơ tròn do thoát vị màng não tủy [51] Kết quả mang lại những cải thiện bệnh lý hiệu quả đáng kể và chứng minh được tính an toàn của liệu pháp

1.4 Tình hình nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu

1.4.1 Tình hình nghiên cứu

Các nghiên cứu trước đây trên thế giới đưa ra các giả thuyết về những kích thích quá mức sự truyền tải tín hiệu và rối loạn điều hòa truyền tải thần kinh gây ra những biểu hiện bệnh lý của các cơn đau thần kinh [94, 101] Các phương pháp điều trị hiện nay sử dụng các thuốc chống trầm cảm, chống co giật để nhắm đến các thụ thể dẫn truyền xung thần kinh xác định và các kênh ion thần kinh nhằm giảm các triệu chứng của bệnh Tuy nhiên, vẫn xuất hiện nhiều bệnh nhân tiếp tục các cơn đau thần kinh khi trị liệu bằng phương pháp này Điều đó thúc đẩy việc nghiên cứu sâu hơn về

cơ chế bệnh sinh của các bệnh tổn thương thần kinh và đề ra các phương pháp tiếp cận

mới nhằm kiểm soát bệnh

Trong khoảng thời gian gần đây, có nhiều nghiên cứu hướng đến mối tương quan của hệ miễn dịch với bệnh tổn thương thần kinh Các tổn thương thần kinh do rối loạn miễn dịch dẫn đến viêm là các tổn thương thứ phát do tổn thương mô Nhiều bằng chứng đã chứng minh giả thiết về tình trạng viêm do rối loạn miễn dịch có vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn thương thần kinh [88] Các phân tử tín hiệu của hệ thống miễn dịch là cytokine và có thể chia thành 2 loại là cytokine viêm và cytokine chống viêm Các cytokine viêm tăng cao có liên quan đến sự hiện diện của cơn đau sau tổn thương dây thần kinh, trong khi các cytokine chống viêm có liên quan đến việc điều hòa hệ thống miễn dịch và giảm đau thần kinh [2, 88] Một số nghiên cứu với

cytokine huyết thanh ở đối tượng bệnh nhân mắc viêm tủy cắt ngang cho thấy IL-6 có thể đóng vai trò quan trọng trong bệnh tủy cắt ngang, vì nó liên quan đến sự tồn tại của các tế bào chất tạo ra kháng thể chống AQP4 trong tuần hoàn ngoại vi và tăng cường phản ứng viêm ở hệ thần kinh trung ương [90] IL-6 trong dịch não tủy (CSF) đã được chứng minh là tăng cao trong viêm tủy cắt ngang so với các bệnh thần kinh có nguyên nhân không phải viêm thần kinh [43, 95] Ngoài ra trên đối tượng bệnh rối loạn cơ tròn

do viêm màng tủy, Bedabrata Mukhopadhyay và cộng sự đã định lượng được nồng độ IL-6 và TNF- tăng cao trong huyết thanh của trẻ mắc viêm màng não tủy mới sinh so với trẻ mới sinh bình thường và đánh giá có thể sử dụng IL-6 và TNF- làm marker cho bệnh viêm màng não tủy [61] Việc đánh giá mối tương quan giữ các cytokine và các bệnh tổn thương thần kinh là cần thiết để hướng đến những phương pháp điều trị phù hợp

Ở Việt Nam, vẫn chưa có các nghiên cứu về mối tương quan giữa hệ miễn dịch

và các bệnh tổn thương thần kinh, các nghiên cứu chủ yếu tập trung về can thiệp, điều trị sớm cho bệnh nhân mắc bệnh tổn thương thần kinh cũng được tiến hành theo các khâu cơ bản như sàng lọc – chẩn đoán – đánh giá – can thiệp

Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec đã triển khai các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sử dụng BMMNC để điều trị bệnh lý thần kinh như tự kỷ và bại não [50, 51, 63] Cũng tại đây, các nhà nghiên cứu đã triển khai đánh giá sự thay đổi mức độ biểu hiện của bệnh nhân tự kỷ và bại não ở các thời điểm trước và sau khi ghép BMMNC để đánh giá hiệu quả của tế bào ghép vào thông qua biểu hiện của cytokine và yếu tố tăng trưởng

Do vậy, hiện nay chưa có nghiên cứu về sự biểu hiện của các cytokine và yếu tố tăng trưởng trong dịch não tuỷ của bệnh nhân mắc bệnh lý thần kinh, trong đó có rối loạn cơ tròn, viêm tuỷ cắt ngang và liệt Đặc biệt, cũng chưa có nghiên cứu nào báo cáo về sự thay đổi các cytokine và yếu tố tăng trưởng trong dịch não tuỷ từ bệnh nhân rối loạn cơ tròn sử dụng liệu pháp ghép BMMNC

1.4.2 Mục tiêu nghiên cứu

Dịch não tủy (cerebrospinal fluid – CSF) tiếp xúc trực tiếp với các tế bào thần kinh, bao gồm tế bào biểu mô, tế bào hình sao, microglia và oligodendrocyte … Hiện tượng viêm và rối loạn chức năng miễn dịch được xác định rất rõ ở trẻ em mắc RLCT,

liệt và VTCN [34, 65, 71] Tuy nhiên, người ta không biết liệu các cytokine gây viêm

và tự kháng thể điều khiển sinh lý bệnh có mặt trong CSF là nơi mà chúng kích thích

sự tiến triển của bệnh hay không Đáng chú ý, các mẫu CSF từ RLCT, liệt và VTCN hiện đang bị loại bỏ đi như chất thải y tế Do đó, nhu cầu cấp thiết là thu thập và xác định mức độ của các phân tử này trong CSF của bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN cho các nghiên cứu về cơ chế bệnh học Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đề xuất xây dựng hồ sơ các cytokine và yếu tố tăng trưởng trong CSF ở các bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN Và chúng có thể được sử dụng làm chỉ số để đánh giá mức

độ nghiêm trọng của bệnh, để đưa ra quyết định lâm sàng, xác định nhu cầu chưa được đáp ứng và cải thiện chăm sóc sức khỏe trong bệnh này

Căn cứ vào các tài liệu đã mô tả ở phần trên, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng: Nồng độ các cytokine và chất tăng trưởng trong dịch não tuỷ sẽ khác nhau giữa các bệnh tổn thương thần kinh có nguồn gốc bệnh sinh khác nhau, kể cả các loại bệnh lý gây ra do tổn thương tuỷ sống Các thành phần cytokine và chất tăng trưởng này sẽ thay đổi theo mức độ tiến triển của bệnh hoặc khi nhận được một phác đồ điều trị cụ thể

Do vậy, chúng tôi đặt ra các mục tiêu nghiên cứu để làm sáng tỏ một phần giả thuyết nghiên cứu trên như sau:

(i) Định lượng một số cytokine gây viêm, cytokine kháng viêm và các yếu tố tăng trưởng trong CSF của bệnh nhân mắc rối loạn cơ tròn (Spina Bifida - RLCT), liệt (Paralysis) và viêm tủy cắt ngang (Transverse myelitis - VTCN) Phân tích sự thay đổi giữa các cytokine gây viêm, kháng viêm và các yếu tố tăng trưởng trong CSF của các loại bệnh trên

(ii) Đánh giá sự thay đổi hàm lượng của các cytokine và chất tăng trưởng này trong CSF của một số trường hợp bệnh nhân mắc rối loạn cơ tròn trước và sau ghép tế bào gốc đơn nhân tuỷ xương

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Đề tài có tiến hành thu thập CSF của các bệnh nhân bị RLCT do thoát vị màng não tủy, liệt và VTCN tự nguyện và được chỉ định tham gia ghép BMMNC tự thân tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Times City Mẫu CSF chỉ được thu thập khi được

sự đồng ý hiến mẫu CSF cho nghiên cứu và bệnh nhân/người bảo lãnh đã ký vào giấy chấp thuận hiến mẫu Việc thu thập mẫu CSF sử dụng cho nghiên cứu đã được phê duyệt của Hội đồng Y đức Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec (Số 150117/2017/QĐ-VMEC)

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Các hóa chất và thiết bị nghiên cứu được sử dụng tại phòng nghiên cứu Tế bào gốc

và Công nghệ gen Vinmec

➢ Thiết bị

- Hệ thống phân tích quang học Luminex 200™ (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5420 (Đức)

- Kính hiển vi Primo Star (Đức)

➢ Hóa chất và dụng cụ

- Ống Barcoded Cryogenic Azeta 1 ml (Mỹ)

- Buồng đếm Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer (Mỹ)

- Bộ kit Human Custom Procartaplex Multiplex Panel 22-Plex (Thermo

Fisher Science, Massachusetts, US)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu dịch não tuỷ

Bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN được tiến hành rút dịch não tủy trước khi được truyền vào thể tích dịch chứa tế bào gốc tự thân có nguồn gốc tủy xương tương ứng để duy trì áp lực nội sọ Mẫu dịch não tủy trong các trường hợp này được coi là chất thải y tế và chỉ được thu thập sau khi bệnh nhân/người bảo lãnh đồng ý cho phép thu thập tại Bệnh viện Đa khoa quốc tế Vinmec Times City

Quy trình lấy mẫu (do bác sĩ thực hiện) được thực hiện theo các bước như sau:

- Bệnh nhân sẽ được tiến hành gây mê kéo dài trong khoảng 30 phút bởi bác

sỹ gây mê có kinh nghiệm

- Trước khi truyền tế bào gốc, bác sỹ cần rút ra một lượng dịch não tủy tương ứng với thể tích tế bào gốc truyền vào

- Bác sỹ tiến hành rút dịch não tủy tại không gian giữa đốt sống thắt lưng thứ

tư và thứ năm sử dụng kim tiêm 18G

- Các mẫu dịch sau khi hút ra khỏi tuỷ sống được chuyển sang ống falcon 15

ml và dán nhãn mã bệnh nhân

Bác sỹ trước khi tiến hành mẫu phuật sẽ mặc quần áo phẫu thuật, vệ sinh tay, đeo găng phẫu thuật và tất cả dụng cụ đều được khử trùng trước khi tiến hành phẫu thuật để đảm bảo an toàn

- Dán mã vạch thông tin mẫu

- Chuyển vào bảo quản ở -80 oC đến khi tiến hành thí nghiệm tiếp theo

- Cặn còn lại được đánh tan đều trong 100 µl dịch để đếm tế bào

- Hút 10 µl dịch nổi và nhỏ vào buồng đếm tế bào hemocytometer đã đặt sẵn lam kính Đếm số lượng tế bào ở 4 ô bất kỳ của buồng đếm Số lượng tế bào được tính theo công thức sau:

Số lượng tế bào = (tổng số tế bào ở 4 buồng đếm)/4 × 10000 × 0,1

2.2.3 Định lượng cytokine và yếu tố sinh trưởng trong CSF

Nồng độ cytokine và các yếu tố tăng trưởng trong CSF trước và sau ghép được phân tích bằng cách sử dụng Bộ kit Human Custom Procartaplex Multiplex Panel 22-Plex (Thermo Fisher Science, Massachusetts, US) trên thiết bị Luminex® 100/200TM

Bộ Kit được thiết kế để phân tích các cytokine gây viêm, chống viêm và yếu tố tăng trưởng, gồm có: GM-CSF, IFN-, TNF-, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-21, IL-31, IL-33R, BAFF, APRIL, NGF-, BMP-9, EGF, GDF-15, G-CSF và M-CSF Các hoá chất theo kit được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản

xuất Nguyên lý hoạt động của Kit dựa trên sự bắt cặp của protein đích trong mẫu cần phân tích với kháng thể đặc hiệu gắn trên hạt từ Sau khi ủ mẫu và hạt từ, sử dụng đĩa

từ để giữ lại hạt từ đã gắn kháng thể và tương tác với protein đích lại, rửa loại bỏ mẫu thừa và các protein không tương tác bám vào hạt từ Bổ sung dung dịch đệm đọc và đo hàm lượng protein trên hệ thống Luminex® 100/200TM

2.2.4 Phân tích kết quả định lượng các cytokine và yếu tố sinh trưởng

Nồng độ của cytokine và các yếu tố tăng trưởng trong CSF của bệnh nhân tổn thương thần kinh sẽ được đo bằng cách sử dụng ProcartaPlex (Thermo Fisher Science, Massachusetts, US) trên thiết bị tiên tiến như Luminex 200 cho phép đo đồng thời tới

80 cytokine và các yếu tố tăng trưởng chỉ với 50 µl mẫu Kết quả thu được ở file Batch

sẽ được đọc trên phần mềm xPONENT 3.1 Software Kết quả định lượng sẽ được kiểm định kết quả dựa vào đường chuẩn được dựng dựa trên chất chuẩn cugn cấp cùng

bộ kit

2.2.5 Phân tích mạng lưới tương tác giữa các protein bằng String DB

Cơ sở dữ liệu StringDB được sử dụng để xây dựng mạng lưới tương tác giữa các cytokine khác nhau [84] Dựa trên danh sách đầu vào là các cytokine có biểu hiện thay đổi tương đồng (cùng tăng hoặc cùng giảm ở CSF của hai bệnh nhân) ở hai bệnh nhân RLCT trước và sau ghép tế bào gốc (15 yếu tố - Danh sách (1)) và các yếu tố được xác định có liên quan (tối đa 40 tương tác) với 22 yếu tố thay đổi trong dịch não tuỷ của bệnh nhân RLCT được sử dụng để phân tích (với điểm tin cậy > 0,4 là mức độ

độ tin cậy từ trung bình đến cao) để xác định các mối tương tác và các quá trình liên quan Từ đây trích xuất ra 40 yếu tố có liên quan và được sử dụng để phân tích các tương tác cùng với 15 yếu tố đã được xác định có thay đổi ở bệnh nhân RLCT trước ghép và sau ghép tế bào đơn nhân tuỷ xương tự thân

Mạng lưới tương tác giữa các protein được xây dựng dựa trên danh sách (2) (điểm tin cậy > 0,7) sử dụng công cụ StringDB với các thông số “confidence score > 0.7”, không sử dụng các thông số “text mining”, “neighborhood”, và “gene fusion”

2.2.6 Phân tích “Pathway enrichment”

Pathway enrichment analysis (PEA) là một phương pháp phổ biến được sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gene và phát hiện ra các quá trình bệnh lý có

liên quan Hơn nữa, các quá trình khác nhau thường phát huy khả năng của chúng thông qua các tương tác với tín hiệu xung quanh chúng Do vậy, chúng tôi sử dụng PEA để phân tích chức năng của các protein có thay đổi mức độ biểu hiện ở bệnh nhân RLCT trước ghép tế bào gốc đơn nhân tuỷ xương và sau ghép tế bào gốc đơn nhân tuỷ xương Hai nhóm cytokine sẽ được phân tích, gồm có: nhóm (1) là nhóm cytokine biểu hiện thay đổi tương đồng ở hai bệnh nhân RLCT trước ghép và sau ghép tham gia nghiên cứu này (danh sách 1) và nhóm (2) gồm tất cả các cytokine phát hiện trong nghiên cứu này để xác định các Gene Ontology (GO) term biểu hiện quá mức (Danh sách 2) [89] Nhóm (2) gồm tất cả các cytokine phân tích trong nghiên cứu tiếp tục được phân tích PEA dựa theo bộ cơ sở dữ liệu Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [42] Các “Enriched pathways” có tỷ lệ phát hiện sai (false-discovery rate) ít hơn 0,05 sẽ được xem là có ý nghĩa thống kê Sơ đồ “KEGG pathway enrichment” và các GO term” biểu hiện quá mức được vẽ bằng phần mềm ShinyGO (version 0.76.3) [25]

2.2.7 Phân tích thống kê

Dữ liệu được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình ±SD Phân tích dữ liệu và thống kê sẽ được thực hiện bằng cách sử dụng GraphPad Prism version 9 (Phần mềm GraphPad, Hoa Kỳ) Phân tích thống kê các phép so sánh cặp sử dụng T-Test và so sánh nhóm sử dụng ANOVA OneWay Giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống

kê Các phân tích tin sinh sử dụng bộ cơ sở dữ liệu online và phân tích thống kê FDR

CSF lần 1 đối với bệnh nhân mắc bệnh RLCT, liệt và VTCN; và lần 2 đối với bệnh nhân mắc RLCT sau ghép BMMNC tự thân được thực hiện tại bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Times City Để ghép BMMNC thông qua tiêm nội mô, bác sĩ cần loại

bỏ một lượng CSF tương đương với lượng dịch chứa BMMNC truyền vào để duy trì

áp lực nội sọ Số mẫu thu thập được thể hiện ở Bảng 1 bên dưới

Bảng 1 Số lượng mẫu CSF thu thập từ các bệnh nhân mắc RLCT, liệt và VTCN

Loại mẫu RLCT lần 1 RLCT lần 2 Liệt VTCN

3.2 Đặc điểm dịch não tủy

Mẫu dịch não tủy sẽ được thu trước khi truyền BMMNC phụ thuộc vào thể tích của dịch tế bào truyền vào Mẫu thu được sẽ được xử lý để loại bỏ tế bào và bảo quản cho mục đích phân tích nồng độ protein (cytokine và chất tăng trưởng) Trước khi sử dụng CSF để phân tích cytokine, chúng tôi kiểm tra đặc điểm các mẫu CSF thu được sau ly tâm Theo quy trình xử lý mẫu, sau khi ly tâm, dịch nổi sẽ được thu và lưu trữ tại các ống polypropylen 1 ml, phần cặn còn lại sẽ được tiến hành kiểm tra xem có tế bào hay không và đếm tế bào bằng hemocytometer Mật độ tế bào trung bình giữa các

mẫu RLCT (trước và sau khi ghép BMMNC), liệt và VTCN thu được thể hiện ở Bảng

2 Dữ liệu cho thấy các mẫu CSF thu được đều có lẫn tế bào đơn nhân, có những mẫu

nhiễm tế bào máu đỏ do vậy không thể đếm được tế bào đơn nhân trong các mẫu nhiễm này Điều này cho thấy rằng, trong quá trình hút CSF từ bệnh nhân, một phần tế bào có lẫn vào CSF trước khi xử lý Việc xử lý loại bỏ tế bào lẫn vào nhằm đảm bảo cho chất lượng CSF đủ điều kiện để phân tích cytokine và yếu tố tăng trưởng bằng phương pháp Luminex sau này Với các mẫu bị nhiễm tế bào máu đỏ sẽ không được

sử dụng để phân tích hàm lượng cytokine và yếu tố tăng trưởng trong chúng

Bảng 2 Đặc điểm của mẫu CSF thu được từ ba nhóm bệnh RLCT, liệt và VTCN

Loại mẫu Tuổi Ngày lấy mẫu

Thể tích CSF

(mL)

Số lượng tế bào trong dịch CSF ( tế bào)

Lẫn tế bào máu

đỏ

(Có/Không)

Loại mẫu Tuổi Ngày lấy mẫu

Thể tích CSF

(mL)

Số lượng tế bào trong dịch CSF ( tế bào)

3.3 Kết quả định lượng các cytokine và yếu tố sinh trưởng

Mẫu CSF đã bảo quản đông lạnh (-80 oC) được rã đông và chuẩn bị gắn kháng thể, gắn hạt từ theo quy trình đã mô tả ở phần phương pháp Mẫu sau khi được gắn kháng thể và loại bỏ các dung dịch mẫu và kháng thể thừa không bám vào hạt từ thì được đưa đến đọc trên hệ thống Luminex 200TM và kết quả được phân tích trên phần

mềm ProCartaPlex Analyst 1.0 Software Kết quả báo cáo là nồng độ protein (pg/ml)

từ các mẫu CSF của bệnh nhân

Thành phần CSF của RLCT, liệt và VTCN được sử dụng để đánh giá hoạt động của hệ thống miễn dịch ảnh hướng đến bệnh lý phát sinh trong quá trình phát triển