chế tạo chế phẩm xanh chống mọt gạo từ hạt bơ persea americana mil

Thực hiện đánh giá sơ bộ một số hợp chất dựa trên phương pháp định tính bằng phản ứng hóa học kết hợp với định tính nhóm chức bằng quang phổ hồng ngoại biên đổi Fourier.. Đồng thời thực

TỔNG QUAN

Tổng quan về hạt bơ

Cây bơ (Persea Americana) là một loại cây cận nhiệt đới có nguyên gốc từ Mexico và Trung Mỹ Trái của cây bơ thường thấy ở dạng hình bầu dài Vỏ mỏng, màu xanh lục đậm Thịt bơ màu lục nhạt, khi chín thì thịt mềm vị thơm béo Hạt bơ có hình oval, màu nâu cam Persea americana được một nhà thực vật học người Anh Philip Miller xác định và định danh Cây bơ được phân loại sinh học trình bày theo Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại sinh học của cây bơ

Bảng phân loại sinh học cho thấy cây bơ có tên khoa học là Persea americana thuộc vực các sinh vật có nhân Eukarya và giới thực vật Plantae Cây bơ thuộc phân ngành thực vật hạt kín Anthophyta, là các cá thể có giao tử được sản xuất trong hoa và noãn được bao bọc trong một lá noãn Thực vật hạt kín là dạng thực vật chiếm ưu thế của ngày nay Chúng cho thấy tổ chức cấu trúc tiên tiến nhất trong các loài thực vật, cho phép chúng sống trong một phạm vi môi trường sống rất đa dạng Phân lớp Magnoliopsida, là một nhóm thực vật hai lá mầm được và bộ Laurales chứa 2900 loài,

7 phân họ, 91 chi Các cá thể thuộc bộ Laurales thường là các cá thể được tìm thấy ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt, có khí hậu ấm Cây bơ thuộc họ Lauraceae hay còn gọi là họ Nguyệt quế và chi Persea, các cá thể thuộc chi Persea thường là các cá thể cao khoảng 50-100 feet,cho quả thịt mọng nước có hình oval bao quanh một hạt

Hình 1.1 Quả bơ và hạt bơ 1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Tại Việt Nam, bơ là một loại cây cho giá trị kinh tế cao và hiện nay các sản phẩm liên quan đến bơ ngày xuất hiện càng nhiều Ở nước ta chủ yếu có 3 chủng bơ là chủng West Indian (Antilles), chủng Mexico và chủng Guatemala

Các nước có sản lượng bơ lớn nhất là Mexico (60%), Peru (13%), Chile (7%), California (5%), Nam Phi (4%), Colombia (3%), Israel (3%), Úc (2%) và Tây Ban Nha (1%) Ngoài ra, các nước sản xuất mới đang nổi lên, như Guatemala, Morocco, Philippines, Trung Quốc và Ấn Độ [1] Ở Việt Nam, bơ được trồng nhiều ở các tỉnh Đắk Lắk, Lâm Đồng, Đồng Nai và các tỉnh miền Tây Nam Bộ, trong đó vùng Tây Nguyên là vùng cung cấp sản lượng bơ lớn nhất của Việt Nam Ba nhóm bơ chính ở Việt Nam là bơ sáp, bơ mỡ, bơ nước và một số giống bơ mới như bơ Hass, bơ Booth, bơ 034,… trong đó sản lượng bơ và giá thành kinh tế cao nhất mang lại là bơ sáp (chiếm khoảng 60% diện tích trồng bơ) Đối với quả bơ, phần thịt bơ được sử dụng để ăn và chiết xuất dầu bơ Vỏ bơ, hạt bơ được xem như là phụ phẩm Ước tính khối lượng phụ phẩm khoảng 6.000 tấn/vụ (bằng 13-18% sản lượng quả bơ) [2] Phụ phẩm hạt bơ được thải bỏ và một phần rất nhỏ được thu gom làm hạt giống.

Thành phần hóa trong hạt bơ

1.2.1 Thành phần dinh dưỡng bơ

Quả bơ (Persea americana) là một loại trái cây nhiệt đới, quả bơ được cho là một loại quả chứa nhiều dưỡng chất Quả bơ không chỉ được đánh giá cao vì hương vị, kết cấu thịt và hàm lượng dinh dưỡng cao mà còn vì nhiều lợi ích lành mạnh

Ngoài ra, không chỉ thịt bơ mà hạt bơ cũng mang nhiều hàm lượng dinh dưỡng và còn mang nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học như acid phenolic, tannin, flavanoid, [3] mang nhiều lợi ích chống oxi hóa, chống nấm, chống virus, chống ung thư, Các hàm lượng dinh dưỡng đa lượng, vi lượng được trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Các nghiên cứu khác nhau về hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và dinh dưỡng vi lượng của thịt bơ

Thành phần Hạt bơ [4-6] Thịt bơ [7]

Dưỡng chất đa lượng (%) Độ ẩm 8,60-13,09 64,4-83,8

Dưỡng chất vi lượng (mg/100g)

Dựa vào bảng 1.2 ta nhận thấy được hạt bơ là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng không kém so với với thịt bơ Thậm chí hạt bơ còn vượt trội hơn ở hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và chứa một lượng lớn vitamin A, C so với hạt bơ

1.2.2 Các hợp chất mang hoạt tính sinh học trong hạt bơ

Nhiều bài báo hiện nay nghiên cứu và đánh giá về việc sử dụng các sản phẩm phụ của thực vật bằng việc khảo sát có hợp chất hoạt tính sinh học và tác động tích cực đến sức khỏe có trong nó, việc này nhằm để thúc đẩy tái chế các sản phẩm phụ bị lãng phí như

4 hạt, vỏ [8, 9] Điều này sẽ cải thiện lợi nhuận tổng thể của nông dân và giảm chi phí xử lý các sản phẩm phụ

Ngoài ra, hạt bơ là một sản phẩm phụ thường bị tiêu hủy Tuy nhiên, hạt bơ là một nguồn chứa nhiều acid phenolic so với các nguồn chống oxy hóa phổ biến như quả việt quất [10] Một số chất phenolic cụ thể trong hạt bơ đã được xác định bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ để xác định cấu trúc như catechin, gallate, acid 3-O-caffeoylquinic , procyanidin trimer A (II), acid 3-p-coumaroylquinic, procyanidin trimer A (I) [11]

Trong nghiên cứu khác, sử dụng phương pháp phân tích sắc ký nhóm tác giả đã xác định được các hợp chất là acid trans-5-O-caffeoyl-d-quinic , procyanidin B1, catechin

Các hợp chất dễ bay hơi của chiết xuất hạt đã được nghiên cứu và cho thấy este của axit béo và các dẫn xuất và dẫn xuất isoprenoid của chúng [12] Trong loại hợp chất terpenoid và phenylpropanoid, bảy hợp chất đã được xác định: estragole, isoestragole, cubebene, α-cubebene, α-germacrene α-farnesene, and caryophyllene Một thành phần quan trọng khác của phần lipid của hạt bơ là các dẫn xuất rượu béo polyhydroxylated (PFA)

Acetogenin (dẫn xuất của PFA) có nguồn gốc từ rượu béo với chuỗi aliphatic không bão hòa, thường là acylate Hàm lượng acetogenin trong khoảng từ 1090 đến 8330 μg/g DW trong hạt bơ giữa 22 giống bơ Acetogenin persenone A &; B, AcO-avocadene đóng góp chiếm rất nhiều trong hàm lượng acetogenin của hạt bơ, tiếp đó là persenone C, AcO- avocadenyne, persin và persediene [13]

Ngoài ra, có các alkaloid, phytosterol và tocopherol chiếm lượng nhỏ trong hạt bơ

1.2.3 Các hợp chất mang hoạt tính chống côn trùng trong hạt bơ

1.2.3.1 Acid béo và các dẫn xuất

Các loại dầu từ thực vật được cho là lành tính đối với con người và các loại thú Nhưng ở một số châu Á và châu Phi, có một phương pháp phối trộn dầu thực vật vào các loại ngũ cốc để bảo quản, chống lại sự xâm hại của côn trùng Cụ thể, một nghiên cứu cho thấy các loại dầu hướng dương, thầu dầu, mù tạt, nghệ tây, cọ, lạc, vừng, neem, karanj và ngô, mỗi loại được tẩm vào hạt đậu với tỷ lệ 5, 7,5 và 10 mL/kg hạt để chống bọ cánh cứng (Callosobruchus chinensis L.) đã cho thấy độ hiệu quả và không có tác dụng phụ của các loại dầu khác nhau đối với sự nảy mầm của hạt [14, 15] Các loại dầu này thường

5 là các hỗn hợp của mono-, di- hoặc triglyceride của acid oleic, steric, tuy nhiên sản phẩm thủy phân của nó là glycerol không có hiệu quả tương tự [16]

Tương tự, trong hạt bơ chứa rất nhiều acid béo và các dẫn xuất của nó như acetogenin, avocadofuran Một thành phần acid béo chiếm chủ yếu trong hạt bơ như acid myristic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, acid arachidic, acid erucic, acid behenic, acid nervonic, acid tetracosanoic [17] Một số chất như acid oleic, acid linoleic đã được công bố là có hoạt tính chống mọt gạo (S Oryzae) [18]

Acetogenin là các hợp chất béo chủ yếu được tìm thấy trong các loại trái cây nhiệt đới Acetogenin có khả năng ức chế các enzym hô hấp trong tế bào sống góp phần nên chúng có đặc tính chống ung thư và chống côn trùng Theo Blair Sampson et al., đã thử nghiệm tính hiệu quả của chiết xuất cây paw paw có chứa acetogenin để tiêu diệt hai loài gây hại chính trong nông nghiệp là rệp đào xanh và muỗi vằn quả việt quất Các chiết xuất acetogenin có hiệu quả như thuốc trừ sâu dựa spinosad và cũng được so sánh thuận lợi hơn so với malathion Chiết xuất paw paw độc hơn nhiều đối với rệp và muỗi mật so với thuốc trừ sâu phổ rộng và gây độc thần kinh là phosmet [19] Một số hợp chất acetogenin trong hạt bơ là persenone A, persenone B, AcO-avocadene, persenone C, AcO-avocadenyne, persin và persediene [13]

Các avocadofuran là các hợp chất tự nhiên được phân lập từ quả bơ (P Americana), với cấu trúc bao gồm 2-alkylfuran với các liên kết π và vị trí không bão hòa khác nhau (liên kết đôi và ba) trong chuỗi alkyl Avocadofuran đã chứng minh rằng các hợp chất có cấu trúc 2-alkylfuran với chiều dài chuỗi từ 14–18 nguyên tử cacbon, có hoạt tính ức chế sự phát triển của côn trùng ve, rận như panonychus citri, oligonychus yothersi và tetranychus cinnabarinus [20]

Ngoài ra, nhờ vào tiềm năng trở thành thuốc trừ sâu sinh học thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp Đã có nghiên cứu về tổng hợp 2-hexadecylfuran từ furfuraldehyde và anhydrit palmitic thông qua hai bước phản ứng và hiệu suất tổng thể là 25% Phương pháp này có thể được coi là một lộ trình thực tế và thân thiện với môi trường để điều chế một loại thuốc trừ sâu tiềm năng [21]

Hình 1.2 Công thức chung của avocadofuran 1.2.3.3 Các hợp chất phenolic

Polyphenol ảnh hưởng đến sự phát triển của côn trùng bằng nhiều phương thức hoạt động khác nhau Các hợp chất phenolic được sinh tổng hợp trông cây ức chế sự tăng trưởng,sinh tồn , phát triển và sinh sản của động vật ăn cỏ, côn trùng Theo cơ chế chung, một khi động vật ăn cỏ bắt đầu ăn mô thực vật, các polypeptide axit amin như systemin có thể tăng cường sản xuất enzyme lipase trong màng tế bào thụ thể dẫn đến giải phóng axit linolenic Axit linolenic sau đó đóng vai trò là tiền chất của con đường truyền tín hiệu axit jasmonic, cuối cùng tạo ra peroxidase (PO) PPO và chất ức chế proteinase , chúng oxy hóa phenol để tạo thành các loại oxy phản ứng và quinone [22] Quinone đóng vai trò là protein kháng dinh dưỡng cản trở khả năng tiêu hóa và hấp thu chất dinh dưỡng của côn trùng [23], làm giảm đáng kể thể lực của động vật ăn cỏ Những chất ức chế proteinase này cũng gây ra tình trạng đói ở côn trùng khi chúng liên kết với các enzym tiêu hóa bên trong ruột côn trùng, làm giảm khả năng tiêu hóa và giải phóng các chất dinh dưỡng và khoáng chất cần thiết để thực hiện các chức năng trao đổi chất thiết yếu cho sự sống còn [24]

Saponin là các glycoside Chúng bao gồm các chuỗi saccharide ưa nước gắn với các cấu trúc triterpenic hoặc steroid kỵ nước (aglycone) Saponin được phân thành ba loại chính theo khung carbon của aglycone: saponin triterpenoidal, steroidal và steroidal- glycoalkaloid Saponin có hệ thống vòng đa vòng trong cấu trúc aglycone hoặc sapogenin với 27 carbon steroid hoặc 30

Saponin có nhiều ứng dụng thương mại do đặc tính làm ướt, nhũ hóa và tạo bọt của chúng Các hợp chất này có hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa, diệt côn trùng, diệt tuyến trùng và diệt nhuyễn thể Chúng đã được sử dụng trong các loại ngũ cốc được bảo quản để giảm thiểu thiệt hại và thất thoát hạt lương thực do côn trùng gây hại Nhiều nhà nghiên cứu đã thử nghiệm các hoạt động diệt côn trùng của các hợp chất này đối với các loài côn trùng gây hại quan trọng [25]

Tổng quan về mọt

Mọt là một loài côn trùng cánh cứng thuộc liên họ Curculionoidea Chúng thường nhỏ, là loài ăn thực vật Có xấp xỉ 62 000 loài mọt được nhận dạng trên thế giới [26] Chúng thuộc nhiều họ khác nhau được xác định dựa vào so sánh DNA 18S ribosome và dữ liệu hình thái học Do thức ăn chủ yếu của mọt là thực vật nên mọt là loài côn trùng gây hại cho các loại hạt ngũ cốc như lúa mì gạo ngô và một số loài có khả năng ăn gỗ làm suy yếu thân cây tấn công thân vỏ quả phá hoại nông sản

Phân loại khoa học của mọt được trình bày theo Bảng 1.4

Bảng 1.3 Bảng phân loại sinh học của loài mọt

Anthribidae Attelabidae Belidae Brentidae Caridae Curculionidae Mesophyletidae Nemonychidae Obrieniidae

Hiện nay, tại Việt Nam đã có những nghiên cứu về mọt và còn đang phát triển Những loài mọt phổ biến phá hoại phổ biến trong các kho lương thực tại Việt Nam gồm

Tribolium castaneum, Aphitobius diaperinus, Aphitobius laevigatus, Latheticus oryzae, Cryptolestes minutus và Sitophilus oryzae xuất hiện phổ biến.[27, 28] Mặt khác, sự xuất hiện của mọt nuôi nấm forni (Euwallacea fornicates) đã khiến nhiều tổn thật, bệnh hại cho lâm nghiệp, dịch hại cây lâm nghiệp thường xuyên xảy ra với xu hướng gia tăng, gây ảnh hưởng lớn đến lâm nghiệp Ngoài ra còn có mọt gai (Dryocoetes villosus), mọt nuôi nấm crass gây hại cho cây rừng [29]

Xét theo diện cuộc sống hằng ngày, mọt gạo (Sitophilus oryzae) chính là loài phổ biến nhất, xuất hiện trong các bao, thùng gạo, kho trữ lương thực với chu kì sinh sản ngắn và số lượng trứng mà mọt gạo sản sinh ra, mọt có thể dễ dàng phát triển

Phân loại khoa học của mọt gạo được trình bày ở Bảng 1.5

Bảng 1.4 Bảng phân loài sinh học của mọt gạo

Tên khoa học Sitophilus oryzae

1.3.2 Đặc tính sinh học của mọt gạo

Mọt trưởng thành có chiều dài từ 3 mm-4 mm, thân xám đen, đầu có vòi, râu Trên mảnh Cánh của mọt gạo cứng, màu nâu có những đường dọc và điểm tròn Ở dưới cánh cứng còn có màng Con đực có vòi ngắn và to hơn so với mọt gạo cái, trên mặt lưng cũng có chấm dài hơn và trên đầu con cái không có chấm lõm ở đoạn cuối [30]

Hình 1.3 Mọt gạo trưởng thành

Sâu non có màu trắng đục với thân mập và thường cong lại thành hình bán nguyệt dài khoảng 2,5 mm Nhộng có màu trắng sữa với thân dài khoảng từ 3,5 mm đến 4,0 mm

Mọt gạo hoạt động rất nhiều, thích bò lên các vị trí cao bên trong các bao nông sản có tính giả chết và còn có khả năng bay khá tốt Mọt có khả năng sinh nôi nảy nở cả trong kho nông sản lẫn ngoài đồng Khi đẻ, mọt dùng vòi để khoét lỗ vào thức ăn (thường là

9 gạo) sau đó đẻ trứng vào và dùng ống đẻ tiết ra một chất nhầy có khả năng bảo vệ trứng và bịt kín lỗ Mọt có khả năng cho từ 2-3 quả trứng mỗi lần đẻ Thời gian để đẻ còn tùy thuộc vào độ cứng của nông sản làm ảnh hưởng đến khả năng khoét lỗ của mọt, thường mất khoảng 30 phút đến 2 giờ Mỗi cá thể mọt gạo cái có thể đẻ 3 cho đến 10 trứng trong ngày và trung bình 380 trứng một năm, có thể lên đến 576 trứng

Sâu non nở ra từ bên trong lòng hạt, bắt đầu gây hạt ngay từ bên trong, việc này làm hạt chỉ còn lớp vỏ bên ngoài khiến hạt gạo không còn giá trị sử dụng Ở vùng nhiệt đới mỗi năm mọt gạo có thể sinh 4 đến 7 lứa với thời kỳ trứng nở từ 3 đến 16 ngày, trứng nở thành sâu non từ 13 đến 28 ngày, sâu non vào thời kỳ tiền nhộng trong 1 đến 2 ngày và phát triển thành nhộng 4 đến 12 ngày và trưởng thành trong 54 đến 311 ngày Thời gian hoàn thàn một thế hệ mọt gạo còn tùy thuộ vào nhiệt độ, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng từ thực ăn [31]

Mọt gạo có thể nhịn ăn từ 6 đến 12 ngày tùy vào nhiệt độ và độ ẩm của môi trường Khi nhiệt độ càng tăng thì khả năng nhịn ăn của mọt gạo càng giảm Mọt gạo trung bình sống khoảng 200 ngày, thời gian sống của mọt cũng chủ yếu phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm môi trường [32]

1.3.3 Các phương pháp diệt mọt hiện nay

Các phương pháp diệt mọt phổ biến hiện nay: Chống mọt theo phương pháp dân gian, sử dụng hóa chất và chống mọt bằng tinh dầu thiên nhiên Ưu và nhược điểm của các phương pháp diệt mọt được trình bày trong bảng 1.6

Bảng 1.5 Các phương pháp xử lý mọt hiện nay

Phương pháp Cách thức hoạt động Ưu điểm Nhược điểm

Diệt mọt bằng thuốc trừ sâu tổng hợp

Các loại thuốc trừ mọt trên thị trường hiện nay như Quickphos 56%, Celphos 56%,

Aluminium Phosphine 56%, Metyl Bromide 98% chủ yếu gây độc đến hệ thần kinh của mọt

Diệt mọt nhanh, hiệu quả Ảnh hưởng đến sức khỏe con người Hóa chất dư sẽ làm ô nhiễm môi trường

Chống mọt bằng tinh dầu Đi vào cơ thể mọt gạo qua đường hô hấp

Phương pháp lành tính đối với sức khỏe người

Sử dụng tinh dầu có mùi thơm dễ chịu

Tinh dầu có giá thành cao hơn so với các phương pháp khác

Dễ bay hơi nên theo thời gian nên sẽ rất tốn kém

Chống mọt bằng các chiết xuất từ cây

Các thuốc trừ sâu sinh học được chiết xuất từ thực vật mang các thành phần như azadirachtin, nicotine,… có khả năng thâm nhập vào cơ thể và đóng vai trò chất ức chế đối với một số thụ thể trong hệ thần kinh côn trùng

Thân thiện với môi trường

Dễ dàng phân hủy sinh học

Canh tác hữu cơ Giảm tỉ lệ mất mùa

Các phương pháp chiết xuất để làm thuốc chống côn trùng từ thực vật chưa được tiêu chuẩn hóa

Hiệu quả chậm hơn so với thuốc trừ sâu tổng hợp

Hiện nay, thuốc trừ sâu tổng hợp là phương thức tiêu diệt mọt nhanh và hiệu quả nhất so với các phương pháp còn lại Tuy nhiên, hậu quả mà thuốc trừ sâu tổng hợp mang lại rất lớn So với thuốc trừ sâu được chế tạo bằng các chiết xuất từ thực vật

Về phương thức hoạt động, thuốc trừ sâu tổng hợp thường sử dụng chất độc tấn công hệ thần kinh côn trùng, trực tiếp giết chết Mặt khác, các chiết xuất từ cây chứa nhiều hoạt chất nên có nhiều phương thức hoạt động chống côn trùng ngoài giết chết còn ức chế phát triển, sinh sản, xua đuổi, gây rối loạn nội tiết Tuy không hiệu quả bằng, nhưng với nhiều phương thức hoạt động khác nhau côn trùng sẽ khó phát triển kháng thuốc

Khi phân hủy, thuốc trừ sâu tổng hợp thông thường mất nhiều năm để có thể phân hủy, ngược lại các chiết xuất từ thực vật dễ phân hủy hơn với chu kỳ phân hủy tính bằng ngày nên khả năng gây nguy hại cho môi trương, con người và các sinh vật khác thấp [33]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Mọt gạo được thu thập trong khu vực thành phố Thủ Đức và thực hiện nuôi dưỡng tại phòng thí nghiệm đại học Sư Phạm Kỹ Thuật thành phố Hồ Chí Minh Mọt được nuôi trong môi trường với gạo là nguồn thức ăn cũng là ổ để phát triển và sinh sản Nhiệt độ và độ ẩm trung bình của môi trường nuôi dưỡng là 22-32 o C và 70%

Hạt bơ được thu thập trong khu vực thành phố Thủ Đức Hạt được thu thập vào tháng

12 năm 2022, hạt bơ Booth Xử lý số hạt bơ bằng cách bỏ vỏ bọc bên ngoài hạt để hạt hạn chế ẩm mốc, sau đó đem rửa sạch hạt để loại bỏ bụi bẩn và để ráo nước Khi hạt đã khô ráo thì cắt lát ra thành từng miếng mỏng và đem đi sấy khô ở nhiệt độ 60°C 24h Sau khi những lát hạt khô hoàn toàn, ta đem xay nhuyễn thành bột mịn.

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Các hóa chất sử dụng trọng nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất CAS Nguồn gốc

15 Lead(II) Acetat (Pb(CH3COO)2) 301-04-2

24 Sodium hydrogen phosphate(Na2HPO4) 7558-79-4

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Bể điều nhiệt Memmert, Đức

2 Cân phân tích 4 số Precisa, Thụy Sỹ

3 Cân kỹ thuật 2 số Precisa, Thụy Sỹ

4 Cuvette thủy tinh Chrom Tech, USA

5 Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis Hitachi, Nhật Bản

6 Bể siêu âm Hettich, Đức

9 Máy ly tâm Hermle, Đức

10 Hệ thống cô quay chân không Yamato, Nhật Bản

11 Máy đo phổ FT-IR Jasco, Nhật Bản

12 Máy đo HPLC-MS Agilent, USA

13 Máy đo pH Seven easypH, Trung Quốc

Nội dung nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

Giai đoạn 1- Điều chế cao trích và chọn mẫu tối ưu

Ta thực hiện điều chế 3 mẫu cao trích hạt bơ từ 3 loại dung môi là ethanol 70 o (v/v), n- hexane, ethyl acetate với sự hỗ trợ của sóng siêu âm Sau đó thực hiện thí nghiệm khảo sát độ chống mọt gạo của 3 mẫu cao và chọn mẫu có khả năng chống mọt cao nhất Giai đoạn 2- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và hoạt tính chống mọt

Từ mẫu cao tối ưu, ta thực hiện định tính, định lượng thành phần hóa học của mẫu cao trích và thực hiện khảo sát hoạt tính chống mọt như độc tính và độ xua đuổi mọt của cao hạt bơ

Giai đoạn 3- Điều chế sản phẩm Điều chế sản phẩm dựa trên nồng độ đã khảo sát và tiến hành xác định các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm

Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ điều chế cao trích bã hạt bơ được trình bày ở Hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao trích Thuyết minh sơ đồ

Mẫu hạt bơ điều được thu thập tại thành phố Thủ Đức, nguyên liệu loại bỏ bụi bẩn, thái mỏng, sấy khô và nghiền nhỏ nhằm mục đích tăng diện tích tiếp xúc các cấu tử tan với dung môi giúp tăng hiệu suất trích ly Trích ly hạt bơ bằng dung môi n-hexane, ethyl acetate và ethanol với tỷ lệ dung môi : bột hạt bơ là 3:1 (v/w) Tiến hành trích ly mẫu với dung môi trong bình tối màu trong sự hỗ trợ bởi sóng siêu âm, sau 30 phút thay dung môi một lần Mẫu được ngâm 3 lần và lọc Dịch lọc sau đó được cô quay ở điều kiện 50℃, tốc độ 90 vòng/phút

Mẫu cao sau khi cô quay được đựng trong lọ thủy tinh tối màu, tránh ánh nắng trực tiếp và tiếp tục sấy khô loại bỏ dung môi Sau đó, tiến hành bảo quản mẫu trong ngăn mát

16 tủ lạnh Sau quá trình sấy mẫu cao được cân chính xác bằng cân phân tích để tính hiệu suất của quá trình trích ly Các mẫu cao được mã hóa như Bảng 2.3

Bảng 2.3 Bảng kí hiệu mã hóa cao trích

STT Tên mẫu Kí hiệu

3 Cao ethyl acetate AE-HB

Xác định hiệu suất trích ly

Hiệu suất trích ly được tính theo công thức:

H%: hiệu suất thu hồi của mẫu cao trích mcao: khối lượng cao sau khi làm khô mmẫu: khối lượng nguyên liệu được sử dụng để điều chế cao

Xác định độ ẩm của mẫu Độ ẩm của mẫu được xác dựa trên tiêu chuẩn TCVN 8900 – 2:2012 với thông số đánh giá dựa trên phần trăm hàm lượng ẩm theo khối lượng Cân chính xác 1,000g mẫu và chuyển mẫu vào đĩa petri, chú ý dàn đều để bề dày lớp mẫu khoảng 5mm và không quá 10mm Đặt đĩa có chứa mẫu vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi ở 105 0 C Khi lấy mẫu ra, chuyển vào bình hút ẩm ngay để làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng Sau đó đem đi cân mẫu Độ ẩm của mẫu thử biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo công thức sau: Độ ẩ𝑚% =𝑤 1 − 𝑤 2

W1 là khối lượng của phần mẫu thử trước khi sấy, tính bằng gam (g) W2 là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g)

2.4.2 Xác định sơ bộ thành phần hóa học

2.4.2.1 Phân tích định tính các nhóm hợp chất dựa trên phản ứng đặc trưng

Mục tiêu thực hiện : Xác định các nhóm chức có trong mẫu cao thông qua các phản ứng hóa học đặc trưng của từng nhóm chức Phương pháp định tính nhóm chức cần xác định sơ bộ được trình bày ở bảng 2.4

Bảng 2.4 Các phương pháp định tính nhóm chức dựa trên phản ứng hóa học

STT Nhóm chức Phương pháp Quy trình Hiện tượng

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%

Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5%

Phản ứng Cyanidin: cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đặc Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút

3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2 ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút, để yên và quan sát

Phản ứng mở và đóng vòng lacton

Hút 2mL dịch chiết cho vào 2 ống nghiệm

- Ống 1: thêm 4mL mước cất

- Ống 2: thêm 0,5mL dung dịch NaOH 10% và đun cách thủy trong 2-3 phút Sau đó, thêm nước cất sao cho thể tích hỗn hợp trong ống 2 bằng ống

Sau khi so sánh độ đục của hai ống, thêm HCl đậm đặc vào ống 2

Ban đầu, ống 1 đục hơn ống

2 Sau khi acid hóa thì hai ống có độ dục bằng nhau

Thuốc thử: 1 ml anhydrid acetic, 1 ml chloroform để lạnh ở 0 o C, thêm vài giọt acid sulfuric đặc

Cách thử: lấy 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào vài giọt thuốc thử đã pha ở trên

Xuất hiện màu xanh lục, hồng, cam , đỏ và màu bền là phản ứng dương tính

Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

Nhỏ vài giọt thuốc thử Bouchardat vào ống nghiệm có sẵn 3mL dịch chiết và lắc đều

Thuốc thử Bouchardat: hòa tan 2g I2 và 4g KI trong 10 ml nước, lắc và để yên cho tan rồi thêm nước cho đến 100 ml)

Thuốc thử cho kết tủa màu nâu đỏ

Cô 5 ml dịch chiết tới cắn

Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc

Phản ứng với tinh thể

Cho 1ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm vài tinh thể

Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

*Chỉ tiêu đánh giá: Quan sát hiện tượng màu sắc trước và sau phản ứng để ghi nhận có hoặc không có các hợp chất tự nhiên trong cao chiết Địa điểm thực hiện : Thực nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm – Đại học Sư

Phạm Kỹ Thuật Tp Hồ Chí Minh

2.4.2.2 Định tính bằng phương pháp đo phổ FT-IR

Mục tiêu thực hiện : Xác định sự hiện diện của các nhóm hợp chất dựa trên các vân phổ đặc trưng tại các số sóng hấp thu bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Phương pháp xác định nhóm chức trong cao trích được phân tích dựa trên thông số là số sóng (cm -1 )

Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) là một kỹ thuật được sử dụng để xác định các nhóm chức trong vật liệu, đặc biệt là các loài dược liệu, bằng cách sử dụng chùm bức xạ hồng ngoại Máy quang phổ đo sự hấp thụ của bức xạ hồng ngoại được tạo ra bởi mỗi liên kết trong phân tử và bước sóng hiển thị trên phổ đồ sẽ giúp nhận diện

19 được các liên kết cũng như các hợp chất có trong mẫu Mẫu được nghiền với KBr trước khi đo, vùng quét sóng nằm trong khoảng từ 4000 cm -1 – 400 cm -1 [34] [35] Kết quả tín hiệu quang phổ hồng ngoại gồm 3 phần đó là số sóng, cường độ và hình dạng của mũi tín hiệu Địa điểm thực hiện : Thực nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm – Đại học Sư

Phạm Kỹ Thuật Tp Hồ Chí Minh

2.4.2.3 Định tính bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (LC-MS)

Mục tiêu thực hiện: Xác định thành phần hóa học của cao điều bằng phương pháp LC-

MS Phương pháp xác định thành phần hóa học trong cao trích được phân tích dựa trên các thông số là m/z, RT, %area, %mass kết hợp với đối chiếu thành phần đã được công bố Địa điểm thực hiện: Thực nghiệm phân tích LC-MS được thực hiện tại phòng thí nghiệm– Viện Kỹ Thuật Nhiệt Đới và Bảo Vệ Môi Trường Tp Hồ Chí Minh

2.4.3 Phương pháp xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao

Thành phần hóa học của cao trích được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng phép khối phổ (LC-MS) Những mẫu cao sẽ được sàng lọc thông qua hệ thống sắc ký, dựa vào khối lượng phân tử trên phổ đồ (mũi phân tử) và thời gian lưu (trên sắc kí đồ) kết hợp với đối chiếu các bài báo đã công bố về thành phần để định danh các hợp chất Các thiết bị được sử dụng trong phân tích LC-MS gồm: Hệ thống khối phổ MS/MS phân giải cao 6500 series Q-TOF (Agilent); hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1900 (USA) bao gồm: bơm đôi cao áp (trộn dòng áp suất cao), bộ tiêm mẫu tự động, lò cột Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý trên phần mềm Masshunter quanlitative analysis B.07.00 của Agilent

2.4.4 Định lượng các hợp chất

2.4.4.1 Phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol

Xác định hàm lượng polyphenol bằng phương pháp so màu thuốc thử Folin-Ciocalteu [36] theo TCVN 9745-1:2013, mẫu được chiết bằng dung môi ethanol methanol Dịch chiết thu được sẽ phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu trong môi trường kiềm Khi

20 đó, thuốc thử oxy hóa các hợp chất phenolic tạo ra các acid heterophy Aicd Heterophy có mà xanh da trời và hấp thu cực đại tại bước sóng 765nm [37]

Quy trình định lượng tổng hàm lượng polyphenol (TPC) được trình bày trong hình 2.3

Hình 2.3 Quy trình thực hiện định lượng TPC

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nghiên cứu khả năng chống mọt của các mẫu cao trích hạt bơ

3.1.1 Kết quả điều chế cao trích

Kết quả hiệu suất trích ly và độ ẩm của các mẫu cao được trình bày trong bảng 3.1 Độ ẩm các mẫu khác nhau, có sự chênh lệch về độ ẩm giữa các mẫu Về kết quả hiệu suất trích ly của 3 mẫu khác nhau Đối mẫu ET-HB, hiệu suất trích ly cao thu được cao nhất 24,49% Ở mẫu HE-HB hiệu suất trích ly cao là 8,03% và có mẫu AE-HB có hiệu suất thấp nhất là 3,70% Nhìn chung, mẫu ET-HB có hiệu suất cao là do trong cấu trúc của ethanol có gốc phân cực (-OH) và gốc không phân cực (-C2H5), điều này giúp ethanol có khả năng hòa tan phân tử phân cực và không phân cực trong hạt bơ mà dung môi ethyl acetate và hexane không làm được

Bảng 3.1 Độ ẩm và hiệu suất trích ly của cao trích

STT Mẫu Độ ẩm (%) Hiệu suất (%)

3.1.2 Kết quả so sánh khả năng chống mọt gạo

Kết quả của phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống mọt bằng thức ăn được trình bày trong hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả thử nghiệm đo độ mọt tiêu thụ gạo tẩm mẫu

Kết quả độ tiêu hao thức ăn của thử nghiệm đô độ tiêu thụ gạo của mọt cho thấy khác biệt thống kê đáng kể ở mẫu AE và HE, mẫu ET có ý nghĩa thống kê đáng tin cậy

Dựa vào kết quả lượng gạo tiêu hao cho thấy các thí nghiệm có cao hạt bơ đều có lượng hao hụt ít hơn so với mẫu blank Mức độ lượng gạo tiêu hao tỉ lệ nghịch với nồng độ dung dịch, nồng độ dung dịch thử càng cao tương đương với lượng gạo tiêu hao càng thấp Mẫu chứa cao ET-HB cho thấy khả năng giảm độ tiêu thụ thức ăn cao nhất (- 46,02%) so với mẫu control, tiếp theo là mẫu HE-HB (-25,95%) và thấp nhất là AE-HE (19,13%) ở nồng độ 10 mg/mL Độ tiêu thụ thức ăn giảm dần khi tằng dần nồng độ từ 0; 10; 20; 40; 80 mg/mL Tại nồng độ cao nhất (80 mg/mL), độ tiêu thụ thức ăn giảm mạnh, mẫu ET-HB (-89,96%) và không có sự chênh lệch nhiều giữa HE-HB và AE-HB (82,39% và 80,49%)

Theo kết quả khảo sát, nồng độ càng cao thì mức độ chống mọt càng tốt, với dãy nồng độ 0; 10; 20; 40; 80 (mg/mL) Dựa vào hiệu suất trích ly và độ hiệu quả để chống mọt thì cao ET-HB để có thể tối ưu trong việc chế tạo chế phẩm Vì vậy, việc thực hiện định tính, định lượng, sàng lọc một số thành phần hóa học quan trọng và khảo sát hoạt tính chống mọt gạo của cao ET-HB

Định tính và định lượng thành phần hóa học

3.2.1.1 Định tính nhóm chức bằng các phản ứng đặc trưng

Kết quả định tính các hợp chất bằng phản ứng hóa học được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính hợp chất bằng phản ứng hóa học đặc trưng

STT Hợp chất Kết quả STT Hợp chất Kết quả

Dấu (-) biểu thị cho kết quả âm tính với thuốc thử với chất tương ứng cần định tính có mặt trong cao; (±) Nghi ngờ kết quả, (+): kết quả thể hiện ít, nhẹ, (++): kết quả rõ ràng đủ nhận biết, (+++) biểu thị cho kết quả thử có màu sắc rõ và phản ứng ngay lập tức

Thông qua kết quả định tính bằng phản ứng hóa học, các hợp chất polyphenol, tannin, alkaloid, coumarin, saponin cho hiện tượng rõ ràng nhất Tuy nhiên, các hợp chất flavonoid, glycoside tim, acid hữu cơ cho kết quả chưa rõ ràng, hiện tượng khó nhận thấy được

Với thí nghiệm phản ứng với FeCl3 để xác định polyphenol, ta có thể thấy rõ hiện tượng với Fe 3+ đóng vai trò acid lewis nhận cặp electron tự do của các gốc OH của hợp chất phenolic acid và tannin để tạo phức màu xanh đen (rêu) Dựa vào phần màu của thí nghiệm, màu xanh đen nhưng cũng hơi ánh xanh rêu có thể xác định được cao ET-HB chứa hai loại tannin là tannin thủy phân được (tạo thành từ các hợp chất phenolic acid với phân tử đường ở trung tâm) và tannin không thủy phân được (tạo thành từ các hợp chất flavonoid)

Mặt khác, phản ứng cyanidin để định tính flavonoid không có sự chuyển màu rõ rệt Trong môi trường Mg/HCl, điều kiện tương tự phản ứng khử clemmensen (Zn(Hg)/HCl) tuy nhiên trong trường hợp này chỉ khử gốc carbonyl một bậc, do việc tạo thành một hệ liên hợp (cấu trúc khung anthocyanidin) nên thuận lợi về mặt năng lượng sẽ tách loại gốc alcohol Với sự chuyển đổi của các nhóm flavonoid tạo thành anthocyanidin sẽ tạo nên nhiều hệ liên hợp, chuyển dịch bước sóng vào vùng cam-đỏ Tuy nhiên, mẫu dịch

33 chiết ban đầu đã có màu cam, có thể sự chuyển màu có màu tương đồng nên không thể nhận biết được bằng mắt thường

Ngoài ra, các phản ứng định tính của alkaloid, coumarin cho thấy hiện tượng rõ ràng và glycoside tim không có sự chuyển đổi rõ rệt, mặc dù cao chiết hạt bơ chứa nhiều liên kết glycoside Với thí nghiệm định tính acid hữu cơ, hoàn toàn không thấy hiện tưởng, điều này có thể do hạt bơ chứa nhiều acid yếu hơn H2CO3 nên việc phản ứng tạo bọt khí khó xảy ra

Các thí nghiệm không xảy ra còn có thể do chất lượng hóa chất, thao tác thí nghiệm Mẫu cao chiết sẽ tiếp tục được phân tích bằng FT-IR để định danh một số các nhóm chức liên quan đến thành phần hợp chất này

3.2.1.2 Định tính nhóm chức bằng phổ FT-IR

Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) là một công cụ dùng để xác định các nhóm chức, cơ sở nhận danh của phương pháp này là dựa trên số sóng của các nhóm chức, từ đó giúp dự đoán các nhóm hợp chất có trong cao trích Nhìn chung, kết quả phân tích phổ FT-IR cho tín hiệu rõ ràng được trình bày ở hình 3.2 và kết quả phân tích phổ được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại

STT Liên kết Số sóng (cm -1 )

5 CH3 dao động co dãn

COO- dao động đối xứng 1400

COO- dao động bất đối xứng 1614

Thông qua phân tích phổ FT-IR, nhận thấy số sóng từ 3600cm -1 đến tín hiệu 3200 cm - 1 với dạng mũi rộng, cường độ mạnh dự đoán đây có thể là tín hiệu của nhóm O-H trong các nhóm hợp chất polyphenol, acid béo Ngoài ra, tín hiệu của N-H của alkaloid trong khoảng 3300-3500 cm -1 và độ phân cực của N-H (trong amine và amide) yếu hơn O-H

34 do đó cường độ tín hiệu không mạnh bằng và hoàn toàn có thể bị che phủ bởi tín hiệu có cường độ mạnh và giãn của liên kết O-H

Ngoài ra, tín hiệu có cường độ mạnh tại số sóng 1614 cm -1 có thể là liên kết C=C của vòng thơm hoặc COO- dao động bất đối xứng [42] Theo quan sát, tín hiệu 1614 cm -1 có thể đã che phủ tín hiệu của C=O và C=C của alkene tại 1664 cm -1 [43] Mặt khác, các tín hiệu tử 1000-1450 cm -1 có thể mang tín hiệu dao động đối xứng của các nhóm như C-C-O của este (1185-1280 cm -1 ), tín hiệu biến dạng C-C-O và co dãn của C-O của acid phenolic (1180-1260 cm -1 )

Vùng tín hiệu dưới 1000 cm -1 , ngoài các tín hiệu của C-X (halogen) còn có các tín hiệu dao động bất đối xưng tại 854 cm -1 và tín hiệu dao động đối xứng tại 684 cm -1 C-O-C của liên kết glycoside [42]

Hình 3.2 Sơ đồ tín hiệu của phổ FT-IR

Kết quả FT-IR cho thấy một số tín hiệu đặc trưng của các thành phần chủ yếu trong hạt bơ như polyphenol, acid béo, vòng thơm, saponin Ngoài ra, các dẫn xuất của acid béo trong hạt bơ như avocadofuran, acetogenin có một số tín hiệu có thể có như tín hiệu C-

O, C=C, COO-, Csp2 –H Nhưng một số tín hiệu đã bị che phủ như Csp2 –H, C=C vì vậy

35 cần tiến hành thực hiện sàng lọc thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định danh các thành phần hóa hiện diện trong cao

3.2.2 Phân tích thành phần hóa học

Trong kết quả phân tích thành phần hóa học bằng phương pháp LC-MS: Việc dự đoán các hợp chất hóa học có trong cao chiết thông qua việc đối chiếu kết quả phân tích LC-

MS với các hợp chất đã được công bố trong chi Persea và kết quả phân tích LC-MS được thể hiện ở phụ lục

Bảng 3.4 Kết quả phân tích LC-MS

Bảng 3.5 Bảng kết quả phân tích LC-MS

Theo kết quả phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ, hàm lượng các hóa chất thuộc hợp chất avocadofuran hiện diện trong cao chiết ET-HB là 2-Heptadecylfuran (0,174%), 2- Tetradecylfuran (0,720%), 2-Pentadecylfuran (0,074%), 2–Hexadecylfuran (0,101%), 2-(8Z,11E-Heptadecadienyl)furan (0,133%), 2-(1Z-Heptadecenyl)furan (0,179%) Với hàm lượng cao nhất là 2-Tetradecylfuran (0,720%) và thấp nhất là 2-Pentadecylfuran (0,074%) Theo Robinson Vargas Mesina, kết quả định lượng avocadofuran bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ cho thấy kết quả chiếm hàm lượng cao nhất là 2-(8Z,11E-Heptadecadienyl)furan (33,53%) và thấp nhất là 2-(1Z-Heptadecenyl)furan (2,85%) [20] Sự chênh lượng hàm lượng có thể do khác nhau về nguồn hạt bơ, phương pháp chiết xuất (UAE so với SE), phương pháp phân tích (LC-MS so với GC-MS) Khó để so sánh hàm lượng với các phương pháp khi nhau khi LC-MS là một phương pháp bán định lượng và tùy vào độ tan của hợp chất trong dung môi sắc ký, nên lC-MS chỉ phù hợp để sàng lọc thành phần hóa học

Kết quả phân tích còn cho thấy được sự đa dạng về thành phần hóa học thuộc hợp chất polyphenol trong cao ET-HB Với các hợp chất phenolic acid là 3-O-p-coumaroylquinic acid (1.310%), caffeic acid (0.278%), 5-O-caffeoyl-quinic acid (0,251%), 4-Hydroxy- 3,5-dimethoxybenzoic acid hay còn gọi là gallic acid (0.095%), 3,4-Dihydroxybenzoic acid (0.476%), Dihydrocaffeic acid (0.299%), 3-feruloylquinic acid (0.439%) Mặt khác, một số thành phần flavonoid như là (epi)gallocatechin (0.174%), procyanidin dimer B-isomer 4 (0.289%), quercetin-3-O-rutinoside (rutin) (0.193%), quercetin 3-O- rhamnoside (0.205%), apigenin (4.156%), kaempferol (0.130%) Như vậy, tổng hàm lượng các hợp chất acid phenolic và flavonoid đã phân tích được là 3,149% và 5,146% Cho thấy hàm lượng flavonoid chiếm nhiều hơn acid phenolic trong cao chiết ET-HB

Kết quả đo các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm

Kết quả của việc khảo sát các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm được trình bày ở Bảng 3.8

Bảng 3.8 Chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm dựa trên TCVN 9745- 1:2013

STT Chỉ tiêu Kết quả

Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3)

Chế phẩm được pha bằng cao ET-HB với cồn 70 o (v/v) với nồng độ 12,5 mg/mL là nồng độ cho khả năng chống mọt tốt nhất trong các thí nghiệm đã thực hiện trong đề tài, với các chỉ tiêu hóa lý xác định được như độ pH 5.63 ± 0.03 do trong hạt bơ có nhiều axit hữu cơ nên chế phẩm có độ pH trung bình thấp, tỉ trọng 0.8621± 0.0005 Sản phẩm có màu nâu ánh đỏ nhạt do sự ảnh hưởng của tannin [58], mùi thơm nhẹ và dịch chiết từ hạt bơ được cho rằng có ngưỡng độc hại rất thấp thông qua các bài báo đã công bố [59].

Bàn luận về cơ chế

Phương thức thâm nhập của chất trừ côn trùng thường được phân loại thành ba phương thức là gây độc qua tiếp xúc trực tiếp, đường tiêu hóa và đường hô hấp

Về tiếp xúc trực tiếp

Khi thực hiện thí nghiệm xác định nồng độ tử vong, phản ứng của mọt khi được tiếp xúc trực tiếp với mẫu dịch chiết 100 mg/mL so với mẫu đối chứng EtOH 30 o (v/v), hiện tượng được trình bày trong bảng 3.9

Bảng 3.9 Phản ứng của mọt gạo khi tiếp xúc với dịch chiết

Hiện tượng Dịch chiết Đối chứng (EtOH 30 o )

Ban đầu Mọt gạo khỏe mạnh, di chuyển nhiều

Mọt di chuyển chậm dần, sau một thời gian cho tín hiệu cử động yếu

Mọt di chuyển chậm dần, sau một thời gian hoạt động như ban đầu

Sau 24h Không còn dấu hiệu của sự sống

Hoạt động bình thường, không có dấu hiệu yếu đi

Từ thực nghiệm quan sát được, mọt khi tiếp xúc với dịch chiết sau một thời gian có tín hiệu cử động yếu đi Điều này cho thấy tác động của các hợp chất trong dịch chiết hạt bơ tác động lên mọt khá nhanh, mọt cử động yếu dần cho thấy khả năng gây độc đến hệ thần kinh hoặc có khả năng cản trở quá trình sản sinh năng lượng trong cơ thể mọt

Một số thành phần có tính diệt côn trùng trong hạt bơ như avocadofuran, acetogenin, saponin đã được nghiên cứu và công bố Theo Cesar et al., độc tính của avocadofuran phụ thuộc vào liên kết đôi trong vòng furan và độ dài của nhánh khi khả năng ức chế phát triển giảm theo độ dài nhánh alkyl [60] Khi thử nghiệm tỉ lệ tử vong của ấu trùng

Spodoptera exigua, nhóm avocadofuran cho kết quả cao hơn đáng kể so với các hợp chất alkyl tetrahydrofuran do nối đôi trong furan bị epoxy hóa thông qua cytochrom P450 (CYP450) là xúc tác Epoxy furan là một chất ái điện tử, có khả năng phản ứng với các nhóm ái nhân của tế bào như protein, DNA [61]

Khác với avocadofuran, acetogenin có khả năng ngăn chặn quá trình sản xuất adenosine triphosphate (ATP) trong cơ thể thông qua khả năng ức chế enzyme NADH-ubiquinone reductase (Complex I) [16]

Gây độc qua đường tiêu hóa

Polyphenol có thể hình thành một số loại liên kết khác nhau với các phân tử khác bao gồm: liên kết kỵ nước, liên kết hydrogen, liên kết ion và cộng hóa trị [62] Tần số của mỗi loại liên kết phụ thuộc vào số lượng, cấu trúc và trạng thái oxi hóa của cả phenolic

45 và phân tử mà nó có thể tương tác Sự oxy hóa ngược lại, trạng thái phụ thuộc vào độ pH và điều kiện oxi hóa khử của môi trường (ruột côn trùng) được xác định bởi cả đặc điểm sinh học của côn trùng [63] Dẫn đến khả năng giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng, giảm khả năng phát triển của côn trùng

Ngoài ra, polyphenol có thể tạo ra các loại gốc tự do (ROS) có thể làm hỏng các phân tử sinh học như DNA, protein và lipid Polyphenol ức chế các enzym chống oxy hóa như superoxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase Gây ra sự mất cân bằng của các gốc tự do và chất chống oxy hóa trong cơ thể [63]

Theo thực nghiệm, do ethanol là dung môi phân cực có khả năng tạo liên kết hydro với các phân tử polyphenol nên TPC sẽ cao hơn so với dùng dung môi hexane và ethyl acetate Điều này cũng cho kết quả tiêu hao thực phẩm chứa mẫu ET-HB thấp hơn so với mẫu HE-HB và AE-HB

Gây độc qua đường hô hấp

Vẫn chưa có thực nghiệm thật sự khẳng định cao chiết hạt bơ có khả năng gây độc qua đường hô hấp Tuy nhiên, theo thí nghiệm xua đuổi và độc tính trong môi trường chứa cao chiết cũng cho khả năng chống mọt khi có sự tồn tại của mẫu cao trong môi trường

Trong thành phần hóa học của cao chiết hạt bơ cũng tồn tại một số hợp chất dễ bay hơi như α-cubebene, α-pinene, caryophyllene, α-farnesene [45, 64] Các thành phần này đều thuộc nhóm terpenoid, các thành phần thuộc nhóm này khi thâm nhập vào cơ thể côn trùng sẽ can thiệp vào bộ điều dẫn thần kinh octopamine và một số có thể can thiệp vào kênh GABA-gated chloride (GABA) [16] Điều này có thể gây kích thích hệ thần kinh, dẫn đến tê liệt và tử vong trong mọt gạo

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận Đề tài này đã đánh giá tác dụng chống và xua đuổi của dịch chiết hạt bơ ethanol 70 o (v/v) đối với mọt gạo (S oryzae) để áp dụng vào bảo vệ hạt lúa, lưu trữ lương thực Trong ba loại cao chiết cùng với năm nồng độ là 0, 1, 2, 4 và 8%, cao chiết ethanol đã chứng minh là có hiệu quả nhất đối với mọt gạo xét về khả năng giảm độ tiêu thụ gạo của mọt so với cao chiết hạt bơ từ dung môi hexane và ethyl acetate Ngoài ra, hiệu suất trích ly từ dung môi ethanol 70 o (v/v) (24,49%) cao hơn so với dung môi hexane (8,03%) và ethyl acetate (3,70%) Vì vậy, cao ET-HB được chọn để thực hiện đánh giá nồng độ độc tính và khả năng xua đuổi mọt gạo

Kết quả thực nghiệm cho kết quả khả quan về độc tính và khả năng xua đuổi mọt gạo của cao ET-HB Kết quả cho tỉ lệ tử vong cao nhất là nồng độ 12,5 mg/mL cho tỉ lệ tử vong cao nhất trong ba ngày (76,67%) và tỉ lệ xua đuổi cao nhất trong ba giờ khảo sát (95,55%) So với mẫu đối chứng với tỉ lệ tử vong là (0%), khi tiếp xúc trực tiếp với dung dịch, tỉ lệ tử vong của mọt gạo tăng mạnh trong 24 giờ với giá trị LC50 là 7,70 mg/mL và tỉ lệ xua đuổi của vùng đối chứng thấp đáng kể vì vùng chứa mẫu cao đều cho tỉ lệ xua đuổi hơn 80% khi so với vùng đối chứng Đề tài này hứa hẹn mang lại thêm tiềm năng của các chiết xuất từ thực vật như là chất thay thế thuốc trừ sâu tổng hợp sẽ mang lại lợi ích cho ngành nông nghiệp của chúng ta, vì hạt bơ không chỉ có chi phí thấp mà còn ít tác động đến môi trường hơn so với nguy cơ do thuốc trừ sâu Do đó, có thể kết luận rằng đề này đã chứng minh rằng chiết xuất từ hạt bơ có khả năng dùng làm thuốc trừ mọt gạo sinh học, có thể được khai thác như vì tiềm năng thân thiện với môi trường, khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, tác dụng bảo vệ gạo khỏi sự phá hoại nghiêm trọng của mọt gạo trong bảo quản

Cần thực hiện các thí nghiệm và khả năng ức chế sinh sản, ức chế phát triển và nồng độ gây tử vong đối với ấu trùng

Ngoài ra, cần thực hiện các thí nghiệm để xác định thêm về cơ chế hoạt động như một thuốc trừ sâu của dịch chiết hạt bơ và khả năng phát triển miễn dịch của côn trùng đối với dịch chiết hạt bơ

Về chế tạo sản phẩm