BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐẾN ĐỘ BỀN MÀU VÀ
TỔNG QUAN
Tổng quan về hoa đậu biếc
Hoa đậu biếc (Clitoria ternatea L.) có nguồn gốc từ các vùng cận nhiệt đới và phân bố rộng rãi ở Châu Phi, Châu Á, Úc, Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Tây Bắc, Trung Nam và Tây Nam Thái Bình Dương (Chen et al., 2018) Cây đậu biếc thuộc loại thân thảo, dây leo, thường mọc hoang dại ở nhiều tỉnh miền Nam, Việt Nam (Trần, 2023) Hoa đậu biếc mọc ở nách lá, hoa cánh đơn (Clitoria ternatea var ternatea) hoặc cánh kép (Clitoria ternatea var pleniflora) có kích thước lớn hơn 5 cm; hoa màu tím hoặc màu hồng, phổ biến nhất là màu tím biếc; tràng hoa hình bướm và hướng xuống dưới; hoa mang mùi hương dịu nhẹ đặc trưng (Lâm et al., 2022)
Hình 2.1 Hoa đậu biếc cánh đơn (a) và cánh kép (b) (Hasanah et al., 2023)
2.1.2 Thành phần dinh dưỡng và công dụng
Hoa đậu biếc chứa khoảng 0.9 mg tro, 8.94 mg khoáng chất hòa tan, 41.27 mg protein thô và 29.18 mg carbohydrate hòa tan trên 100 g trọng lượng khô (Chen et al., 2018) Theo Lâm và cộng sự (2022), hoa cây đậu biếc có chứa các hợp chất như: anthocyanin, flavonoid, carotenoid, tinh dầu, triterpenoid tự do, tanin, saponin, acid hữu cơ, chất khử và hợp chất polyuronid, đặc biệt có khá nhiều anthocyanidin, một nhóm chất có tác dụng kháng oxy hóa Tantituvanont et al (2008) chỉ ra rằng anthocyanin trong hoa đậu biếc chủ yếu là delphinidin - glucoside Theo nghiên cứu của Saptarini et al (2015), anthocyanin trong hoa đậu biếc có màu xanh lam ở pH
4, màu xanh lá cây ở pH 9 và màu vàng ở pH 12
Loài hoa này được sử dụng như một phương thuốc chữa bệnh lợi tiểu, tẩy giun sán, thấp khớp, viêm phế quản, rối loạn nội tiết, giảm cân và chống ung thư (Sapiee, 2013) Thành phần
6 flavonoid có trong hoa đậu biếc có thể làm giảm nhiễm trùng ở đường hô hấp, chống viêm trong các thử nghiệm trên động vật và có khả năng chống oxy hóa (Chen et al., 2018) Theo Kamkaen
& Wilkinson (2009), nụ hoa đậu biếc chứa hàm lượng anthocyanin và các flavonoid khác có tác dụng kháng oxy hóa rất cao.
Tổng quan về anthocyanin
Anthocyanin là sắc tố màu quan trọng trong tự nhiên có khả năng hòa tan trong nước, có nguồn gốc từ sự kết hợp của hai từ Hy Lạp là Anthos và Kyanos, (Anthos nghĩa là hoa và Kyanos có nghĩa là xanh lam) (Pervaiz et al., 2017) Anthocyanin là chất chuyển hóa thực vật thứ cấp trong nhóm polyphenol, thuộc về một phần của hợp chất flavonoid (Galaffu et al., 2015) Những sắc tố này phổ biến trong tự nhiên và chịu trách nhiệm tạo ra màu sắc ở các cơ quan khác nhau của thực vật như thân, lá, hoa, quả, rễ và củ (cam, đỏ, tím và xanh) (Pervaiz et al., 2017) Hàng trăm anthocyanin khác nhau dựa trên cấu trúc anthocyanidin cơ bản và vị trí các glycoside (Pervaiz et al., 2017) Nhiễm sắc thể cơ bản của anthocyanin là ion - hydroxyflavylium, thường có nhóm thế hydroxyl ở vị trí 3 (liên tục được glycosyl hóa) và vị trí 5 (đôi khi được glycosyl hóa), và vòng 2 – phenyl - hoặc B có hydroxy ormethoxy đơn lẻ hoặc bổ sung nhóm thế (Pervaiz et al., 2017)
Bảng 2.1 Cấu trúc của Anthocyanidin (Pervaiz et al., 2017)
7 Bảng 2.1 cho thấy chỉ có sáu loại anthocyanidin phổ biến là cyanidin, delphinidin, petunidin, peonidin, pelargonidin và malvidin được phổ biến rộng rãi và có tầm quan trọng lớn trong chế độ ăn uống và sức khỏe con người Sự sắp xếp cấu trúc của anthocyanin là do số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl và methoxy trên khung anthocyanidin cơ bản (Jadhav et al., 2020) Nếu nhóm hydroxyl chiếm ưu thế thì màu chuyển sang hơi xanh hơn; nếu nhiều nhóm methoxyl chiếm ưu thế thì màu đỏ sẽ tăng lên Theo Pervaiz et al (2017), anthocyanin có thể được phân loại thành hai nhóm chính dựa trên thành phần hóa học của chúng, flavonoid (liên quan đến isoflavone/flavone, C 15 H 10 O 2 ) và phenolics (phenol, C 6 H 5 OH)
2.2.2 Cấu trúc hóa học của anthocyanin
Anthocyanin là anthocyanidin được liên kết với một hoặc nhiều loại đường, các loại đường phổ biến nhất là glucose, galactose và andarabinose (Zhang et al., 2004) Acylglycoside và aglycones flavyliums (2-phenylbenzopyrilium) khác nhau về sự thay thế đa dạng nhóm hydroxyl hoặc methoxyl ở vị trí trung tâm Trung tâm của anthocyanidin, flavylium, có cấu trúc flavonoid C6-C3-C6 đặc biệt, được bao quanh bởi một vòng thơm hợp nhất (vòng A), một vòng benzopyran dị vòng (vòng C) và một thành phần phenyl (vòng B) được trình bày ở Bảng 2.1 (Pervaiz et al., 2017)
Con đường sinh tổng hợp anthocyanin là sự mở rộng của con đường flavonoid nói chung mà trong đó con đường trao đổi chất cho thấy có sự tham gia của các enzyme như chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone 3-hydroxylase (F3H), flavonoid 3′- hydroxylase (F3′H), flavonoid 3′,5′- hydroxylase (F3′5′H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), anthocyanidin synthase (ANS), glycosyltransferase (GT) và acyltransferase (AT) (Vidana Gamage et al., 2021)
Hình 2.2 Sơ đồ sinh tổng hợp anthocyanin ở hoa đậu biếc Chú thích: CHS: enzyme chalcone synthase, CHI: enzyme chalcone isomerase, F3H: enzyme flavanone 3-hydroxylase, F3’5’H: enzyme flavonoid 3′,5′-hydroxylase, DFR: enzyme dihydroflavonol 4-reductase, ANS: enzyme anthocyanidin synthase, 3GT: enzyme anthocyanin 3-O-glucosyltransferase, A6’’MaT: enzyme anthocyanidin 3-O-glucoside 6″-O-malonyltransferase,UA3’5’GT: enzyme anthocyanin 3′,5′- O-glucosyltransferase, ATs and GTs: enzyme acyltransferases và glucosyltransferases (Vidana Gamage et al., 2021)
9 Hình 2.2 cho thấy trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin (hay còn gọi là tertanin) Đầu tiên delphinidin-3-O-β-glucoside được hình thành và sau đó nó được biến đổi bằng quá trình glucosyl hóa và acyl hóa tiếp theo (Vidana Gamage et al., 2021) Để tổng hợp delphinidin -3- O-β-glucoside thì 4-coumaroyl-CoA và malonyl-CoA đóng vai trò là tiền chất (Vidana Gamage et al., 2021) Sự tổng hợp naringenin chalcone từ hai tiền chất được thực hiện thông qua CHS, trong đó CHS là enzyme chủ chốt ban đầu của quá trình sinh tổng hợp flavonoid (Vidana Gamage et al., 2021) Sau đó, naringenin chalcone được CHI đồng phân hóa thành naringenin và chuyển ngay thành dihydrokaempferol khi có mặt F3H (Vidana Gamage et al., 2021) Dihydrokaempferol tiếp theo được chuyển đổi thành dihydromyricetin bởi F3′5′H mà trong đó cả F3′H và F3′5′H đều là các enzyme chịu trách nhiệm đa dạng hóa anthocyanin bằng cách xác định kiểu hydroxyl hóa vòng B của chúng và từ đó xác định màu sắc của anthocyanin (Liu et al., 2018) Vậy nên, F3′5′H góp phần trực tiếp tạo ra anthocyanin có màu xanh lam trong hoa đậu biếc bằng quá trình hydroxyl hóa vòng B tăng làm chuyển màu anthocyanin sang màu xanh lam Tiếp theo, dihydromyricetin được chuyển thành leucodelphinidin không màu qua trung gian DFR và sau đó thành delphinidin bởi ANS (Vidana Gamage et al., 2021) Theo Kogawa et al (2007), một nhóm glucosyl được thêm vào delphinidin bởi anthocyanin 3-O- glucosyltransferase (3GT) để tạo thành delphinidin 3- O -β-glucoside Họ cho rằng các nhóm glucosyl khác được thêm vào vòng B của delphinidin 3- O -β-glucoside, chỉ sau khi malonyl hóa delphinidin 3-O-β-glucoside Theo đó, delphinidin 3-O-β-glucoside bị malonyl hóa khi có mặt anthocyanidin 3-O-glucoside 6’’-O-malonyltransferase (A6’’MaT) (Vidana Gamage et al., 2021) Ngay sau đó, hai phân tử glucose được thêm vào delphinidin 3-O-(6’’-O-malonyl)-β- glucoside, đầu tiên là vị trí 3’ sau đó là vị trí 5’ Quá trình glycosyl hóa này được thực hiện qua trung gian anthocyanin 3′,5′-O-glucosyltransferase (UA3′5′GT) trong hai bước tiếp theo Bây giờ, phân tử này được gọi là delphinidin 3-O-(6′′-O-malonyl)-β-glucoside-3′,5′-di- O-β- glucoside và có thể được gọi là ternatin C5 Ternatin C5 là ternatin đơn giản nhất Mười bốn ternatin khác được tổng hợp bằng cách thêm các nhóm acyl và glucosyl vào ternatin C5 với sự có mặt của acyltransferase (AT) và glucosyltransferase (GT) Acyltransferase (AT) cũng đóng vai trò chính tạo ra màu xanh lam và tính ổn định của anthocyanin, bởi vì quá trình polyacyl hóa ternatin với các nhóm p-coumaroyl dẫn đến sự chuyển màu của anthocyanin sang vùng hơi xanh do sự đồng sắc tố nội phân tử giữa các gốc acyl và giữa các gốc acyl và nhiễm sắc thể
10 anthocyanin Hơn nữa, quá trình polyacyl hóa ở vị trí 3′ của anthocyanin tạo ra màu xanh ổn định (Li et al., 2021) và đây là lý do chính cho tính ổn định cao của ternatin vì hầu hết ternatin đều được polyacyl hóa ở vị trí 3′ Chính vì vậy, khi nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp ternatin, quá trình hydroxyl hóa, glycosyl hóa và acyl hóa có thể được xem là những bước quan trọng nhất giúp tổng hợp anthocyanin có màu xanh ổn định trong cánh hoa đậu biếc (Vidana Gamage et al., 2021)
Anthocyanin tạo ra màu sắc đặc trưng cho trái cây và rau quả nên chúng tác động đến một thông số chất lượng quan trọng bằng cách ảnh hưởng đến sự chấp nhận cảm quan của người tiêu dùng (Patras et al., 2010) Chức năng chính của anthocyanin là hoạt động chống oxy hóa và tăng cường chống lại sự tổn thương DNA, những hợp chất này có khả năng ngăn chặn các gốc tự do nguy hiểm như oxy nhúm đơn (ạO 2 ), gốc superoxide (O 2 •̵− ), gốc hydroxyl (HO•) và hydro peroxide (H 2 O 2 ) vì các gốc tự do này trực tiếp peroxy hóa lipid của màng tế bào (Pervaiz et al., 2017) Một trong những đặc tính quan trọng của anthocyanin là hoạt động chống oxy hóa, do đó anthocyanin có tác dụng nổi trội trong việc ngăn ngừa các bệnh về thần kinh, tim mạch, ung thư và tiểu đường, cùng những bệnh khác Để mang lại những lợi ích về sức khỏe cho người tiêu dùng, anthocyanin luôn được khuyến khích sử dụng làm chất tạo màu thực phẩm và các thực phẩm chức năng (Vidana Gamage et al., 2021)
2.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và sự ổn định của anthocyanin Độ ổn định màu của anthocyanin không chỉ bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm cấu trúc mà anthocyanin và các hợp chất phenolic khác rất dễ bị oxy hóa trong các bước chế biến và lưu trữ (Jadhav et al., 2020) Nhìn chung, một số yếu tố được cho là ảnh hưởng đến sự ổn định của anthocyanin trong trái cây, rau quả và sản phẩm từ chúng trong quá trình chuẩn bị, chế biến và bảo quản bao gồm nhiệt độ, pH, ánh sáng, oxy, ion kim loại, enzyme và đường (Patras et al., 2010) a Nhiệt độ
Nhiệt là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến màu sắc và độ ổn định của sắc tố tự nhiên (Jadhav et al., 2020) Nhiều loại thực phẩm có chứa anthocyanin được xử lý nhiệt trước khi tiêu thụ và quá trình này có thể ảnh hưởng lớn đến hàm lượng anthocyanin trong sản phẩm cuối cùng (Patras et al., 2010) Chế biến nhiệt trong thực phẩm bao gồm việc đun nóng đến nhiệt độ từ
50 ℃ đến 150 ℃, tùy thuộc vào độ pH của sản phẩm và thời hạn sử dụng mong muốn (Patras et al., 2010) Sự ổn định của anthocyanin được nhận thấy là giảm trong thực phẩm khi tăng nhiệt độ trong quá trình chế biến và bảo quản (Sui et al., 2014) Đầu tiên quá trình phân hủy nhiệt liên quan đến sự hình thành cấu trúc giả bazơ carbinol không màu và sau đó mở vòng pyrylium để tạo thành chalcone, trước khi chuyển thành sản phẩm phân hủy màu nâu (Jadhav et al., 2020)
Do đó, nếu anthocyanin được sử dụng làm chất tạo màu thực phẩm thì những anthocyanin đó phải có độ ổn định nhiệt
Hình 2.3 Cơ chế phân hủy nhiệt của anthocyanin không acyl hóa phổ biến (Oancea, 2021)
Hình 2.3 cho thấy các loại anthocyanidin phổ biến nhất trong trái cây và rau quả (cyanidin, pelargonidin, delphinidin, malvidin và petunidin) Phloroglucinaldehyde là kết quả của sự phân cắt C3–C4, trong khi các axit phenolic như 4-hydroxybenzoic, protocatechuic, gallic và syringic được tạo ra thông qua quá trình phân tách của liên kết C2-C3 Rõ ràng, sự phân hủy nhiệt của anthocyanin xảy ra ở các mức độ khác nhau, tùy thuộc vào nguyên liệu thô ban đầu, độ pH và các chất đồng màu (Oancea, 2021)
12 Theo nghiên cứu của Patras et al (2010), nhiệt độ bảo quản đóng vai trò quan trọng đối với sự thất thoát anthocyanin trong quá trình bảo quản, cụ thể sự phân hủy diễn ra chậm hơn nhiều khi bảo quản ở nhiệt độ 20 ℃ so với 37 ℃ Hơn nữa, cường độ và thời gian gia nhiệt trong quá trình chế biến có sức ảnh hưởng mạnh mẽ đến độ ổn định của anthocyanin (Patras et al., 2010) b pH
Trong dung dịch, các phân tử anthocyanin tồn tại ở trạng thái cân bằng giữa dạng cation có màu và dạng giả bazơ không màu, trong đó sự cân bằng này bị ảnh hưởng trực tiếp bởi độ pH (Wahyuningsih et al., 2017) Chính vì vậy, độ pH rất quan trọng đối với màu sắc của anthocyanin Sự thay đổi màu sắc này có thể được giải thích là do sự thay đổi cấu trúc xảy ra trong các phân tử anthocyanin cùng với sự thay đổi nồng độ H⁺ và OH⁻ trong môi trường (Vidana Gamage et al., 2021) Trong môi trường có tính acid cao, cation flavylium đỏ là dạng cân bằng chiếm ưu thế nhất (Jadhav et al., 2020) Những muối flavylium nhường proton ở độ pH cao hơn và biến đổi thành bazơ quinoid có màu xanh lam, bazơ này không ổn định sắc tố và ngay lập tức liên kết với nước và tạo thành hợp chất không màu (Laleh et al., 2006) Sự mất proton nhanh chóng của cation flavylium diễn ra khi độ pH tăng lên và dạng quinonoidal có màu tăng lên (Jadhav et al., 2020) Dựa trên phân tích cho thấy anthocyanin có màu đỏ ở pH thấp (môi trường axit), giá trị pH của anthocyanin càng cao sẽ tạo ra các hợp chất không màu đến vàng tím và xanh lam (Wahyuningsih et al., 2017) Việc tăng độ pH dẫn đến giảm cường độ màu và nồng độ cation flavylium, vì nó bị hydrate hóa bởi sự tấn công của nước, cation flavylium chuyển thành dạng bazơ giả carbinol không màu Dạng carbinol đã mất liên kết đôi liên hợp giữa vòng A và vòng B, do đó không hấp thụ ánh sáng khả kiến Ngoài ra, khi độ pH tăng, dạng carbinol sẽ tạo ra chalcone không màu thông qua việc mở vòng (Jadhav et al., 2020)
Hình 2.4 Sự biến đổi cấu trúc và màu sắc của anthocyanin ở các môi trường pH khác nhau
(Pervaiz et al., 2017) Ở hoa đậu biếc, các anthocyanin có sự hiện diện của các nhóm acyl ngăn cản quá trình thủy phân ion flavylium thành dạng giả bazơ carbinol kém ổn định hơn và thay vào đó tạo thành quinoidal màu xanh lam ít nhạy cảm hơn với sự thay đổi pH trong môi trường axit nhẹ hoặc trung tính (Vidana Gamage et al., 2021) Cụ thể, ở pH < 3.2, anthocyanin hoa đậu biếc có màu đỏ, pH 3.2 - 5.2 màu chuyển từ tím sang xanh, pH 5.2 - 8.2 có màu xanh nhạt và pH 8.2 - 10.2 màu chuyển từ xanh nhạt sang xanh đậm (Vidana Gamage et al., 2021) Do đó, anthocyanin của hoa đậu biếc có thể được sử dụng làm chất tạo màu xanh lam trong hệ thống thực phẩm có tính axit và trung tính (Vidana Gamage et al., 2021) Hình 2.4 thể hiện sự thay đổi cấu trúc của delphinidin-3-glucoside khi tăng pH và hình thành màu xanh lam trong anthocyanin hoa đậu biếc, trong đó đường dẫn (AB) cho thấy sự biến đổi của ion flavylium thành carbinol hoặc dạng giả bazơ Đường dẫn (AC) cho thấy sự biến đổi của ion flavylium thành bazơ quinoidal Đường dẫn (AC) cho thấy sự thay đổi cấu trúc gây ra sự hình thành màu xanh lam trong anthocyanin của hoa đậu biếc
Hình 2.5 Sự thay đổi cấu trúc của delphinidin-3-glucoside khi pH tăng
Tổng quan về chất giữ ẩm
Chất giữ ẩm trong thực phẩm là phụ gia giúp tăng khả năng giữ nước cũng như kiểm soát hoạt độ nước Việc bổ sung chất giữ ẩm vào các sản phẩm thực phẩm có thể làm tăng tính ổn định của sản phẩm, giảm hoạt động của vi sinh vật và bảo vệ kết cấu thực phẩm (Azelee et al., 2019) Glycerol là một trong những polyol giữ ẩm hiệu quả nhất, tác dụng giữ ẩm của glycerol trong thực phẩm là do các nhóm hydroxyl của nó có thể liên kết với nước (Azelee et al., 2019) Trong thực phẩm, glycerol là một thành phần lý tưởng do một số đặc tính như không độc hại, an toàn với môi trường, cung cấp hương vị tốt và mùi dễ chịu (Fluhr et al., 2005; Wernke, 2014) Đặc biệt, glycerol duy trì sự ổn định của anthocyanin theo thời gian và nhiệt độ bằng cách lưu giữ phân tử nước và ngăn chặn một số yếu tố có thể gây ra sự thoái hóa anthocyanin Hơn nữa, glycerol có điểm sôi cao giúp ổn định pha lỏng ngay cả trong điều kiện nhiệt độ tăng, làm giảm ứng suất nhiệt lên các phân tử anthocyanin (Kurek et al., 2024) Ngoài ra, sorbitol cũng là một trong những chất giữ ẩm phổ biến nhất trong thực phẩm (Deis & Kearsley, 2012) Sorbitol là một loại carbohydrate được gọi là rượu đường hoặc polyol, là một hợp chất hòa tan trong nước, tồn tại trong hầu hết các loại trái cây và rau quả Sorbitol được sản xuất thương mại từ glucose để ứng dụng trong thực phẩm và đồ uống nhằm mang lại vị ngọt, tạo kết cấu và giữ ẩm (Sravan
& Spandana, 2021) Bên cạnh đó, sorbitol còn được ứng dụng trong thực phẩm dành cho người ăn kiêng và bệnh tiểu đường vì có chỉ số đường huyết thấp (Sravan & Spandana, 2021) Hơn nữa, sorbitol có khả năng tăng hoặc giảm độ ẩm khi độ ẩm tương đối của môi trường thay đổi; do dó, thực phẩm có chứa polyol này sẽ ổn định hơn khi bảo quản (Deis & Kearsley, 2012) Từ
17 những thông tin trên, glycerol và sorbitol được bổ sung vào dịch trích anthocyanin từ hoa đậu biếc với mong muốn tăng khả năng ổn định của anthocyanin trong quá trình bảo quản.
Tổng quan về chất bảo quản
Theo nhiều nghiên cứu, nhằm ngăn chặn vi sinh vật phát triển trong quá trình bảo quản thì việc lựa chọn bổ sung các chất phụ gia như kali sorbate hay natri benzoate là điều cần thiết Theo Lee et al (2011), anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc ổn định ở nhiệt độ 5 °C và 45 °C trong 15 ngày và ở 100 °C trong 80 phút với sự có mặt của axit benzoic Do đó, khi sử dụng anthocyanin từ hoa đậu biếc làm chất tạo màu thực phẩm, axit benzoic có thể được sử dụng làm chất bảo quản (Vidana Gamage et al., 2022) Mặt khác, bằng cách so sánh các giá trị thời gian bán hủy, người ta có thể kết luận sự hiện diện của chất bảo quản thực phẩm cho thấy tác dụng làm mất ổn định đôi chút đối với anthocyanin từ các chất chiết xuất được nghiên cứu, tuy nhiên sự khác biệt giữa hai chất bảo quản thực phẩm (kali sorbate hay natri benzoate) là không đáng kể (Moldovan & David, 2014) Vì vậy, trong nghiên cứu này kali sorbate được bổ sung vào dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc để tăng thời gian bảo quản dung dịch màu.
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Ngày nay, chất màu nhân tạo đang dần được thay thế bởi các chất màu có nguồn gốc tự nhiên Với xu hướng đó, sắc tố anthocyanin ngày càng được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm, đánh giá trong nhiều loại thực vật khác nhau Hầu hết nghiên cứu đều hướng đến mục đích tối ưu hóa khả năng bảo quản và ứng dụng chất màu tiềm năng này
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2020, Hoàng Thị Hồng đã công bố nghiên cứu quá trình chiết và đánh giá độ ổn định của anthocyanin trong hoa đậu biếc (Clitoria ternatea L.) Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình chiết xuất để tối ưu hóa năng suất khai thác và cho thấy hoa đậu biếc có tiềm năng chống oxy hóa Cùng thời điểm đó, Phạm Trí Nhựt và cộng sự (2020) đã nghiên cứu về sự ổn định của anthocyanin trong chiết xuất thu được từ hoa đậu biếc (Clitoria ternatea L.) Trong nghiên cứu này, dung môi ethanol 50 % kết hợp với HCl 1.5 N (67.47 %) được cho là điều kiện tốt nhất có khả năng lưu giữ anthocyanin cao so với tất cả các phương pháp xử lý khác có thể sử dụng để chiết xuất sắc tố anthocyanin từ Clitoria tenatea ở quy mô lớn (Pham et al., 2020) Theo nghiên cứu của Nguyễn Minh Thủy và cộng sự (2021), các dẫn xuất cyanidin đã được phát hiện trong chiết xuất hoa đậu biếc; dựa trên nồng độ, nghiên cứu xác định rằng cyanidin-3-(p-coumaroyl-
18 glucoside) là anthocyanin dồi dào nhất Đến năm 2023, Trần Ngọc Hùng với đề tài nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc tươi đã nâng cao hiệu quả thu nhận anthocyanin bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (response surface methodology, RSM)
2.5.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Marpaung et al (2017) đã nghiên cứu sự phân hủy màu sắc của dịch chiết giàu anthocyanin từ cánh hoa đậu biếc trong các dung môi khác nhau ở pH 7 Từ kết quả nghiên cứu, nhóm tác giả cho rằng sự thoái hóa màu của anthocyanin từ cánh hoa đậu biếc ở điều kiện trung tính bắt đầu với hai cơ chế khác nhau, đó là sự mở ra của tương tác kỵ nước và khử acyl hóa anthocyanin, sự phân hủy này phụ thuộc vào hệ thống dung môi Nghiên cứu của Jaafar et al (2020) về điều kiện chiết xuất tối ưu của hoa Clitoria ternatea đã chỉ ra rằng C ternatea là một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên tốt dựa trên hoạt tính chống oxy hóa, tổng hàm lượng phenolic và tổng anthocyanin Fu et al (2021) đã nghiên cứu những đặc tính quang phổ, độ ổn định khi bảo quản và đặc tính chống oxy hóa của dịch chiết anthocyanin hoa đậu biếc cũng được Nhóm tác giả đã khám phá màu sắc, quang phổ, độ ổn định và đặc tính chống oxy hóa ở các pH khác nhau Các kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở lý thuyết cho việc ứng dụng hoa đậu biếc và ngụ ý triển vọng của loại hoa này trong ngành công nghiệp thực phẩm (Fu et al., 2021) Cùng năm đó, Vidana Gamage et al (2021) cho rằng anthocyanin hoa đậu biếc có thể được sử dụng như phụ gia tạo màu xanh trong thực phẩm có tính axit và trung tính Sự kết hợp của anthocyanin hoa đậu biếc trong thực phẩm làm tăng các đặc tính chức năng của thực phẩm như đặc tính chống oxy hóa và kháng khuẩn (Vidana Gamage et al., 2021)
Cho đến hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về việc bảo quản sắc tố anthocyanin trích ly các loài thực vật nói chung và sắc tố anthocyanin trong hoa đậu biếc (Clitoria ternatea L.) nói riêng Kopjar et al (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung đường và axit chlorogen đến hàm lượng anthocyanin trong nước ép dâu đen trong quá trình bảo quản Nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung trehalose và glucose đến hàm lượng anthocyanin, trong khi các mẫu chứa saccharose và fructose có hàm lượng anthocyanin thấp hơn mẫu đối chứng Trong quá trình bảo quản hàm lượng anthocyanin giảm nhưng xu hướng không thay đổi, đồng thời việc bổ sung axit chlorogen làm tăng hàm lượng anthocyanin (Kopjar et al., 2012) Nghiên cứu
19 của Moldovan & David (2014) chỉ ra rằng sự phân hủy anthocyanin từ quả anh đào Cornelian (Cornus mas L.) khi lưu trữ ở nhiệt độ 2°C, 25°C và 75°C (pH 3.02, với sự có mặt của chất bảo quản thực phẩm) tuân theo động học phản ứng bậc nhất Trong dung môi là nước, chất bảo quản thực phẩm (natri benzoate và kali sorbate) được sử dụng có ảnh hưởng nhẹ đến độ ổn định của anthocyanin từ quả anh đào Cornelian (Moldovan & David, 2014) Đối với hoa đậu biếc, Sriariyanun et al (2020) đã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của đồng sắc tố (copigment) catechin đến tính ổn định của anthocyanin Nhóm tác giả nhận thấy rằng tốc độ phân hủy anthocyanin tăng khi nhiệt độ tăng và ở độ pH thấp hơn, anthocyanin trở nên ổn định hơn Đồng thời sự gia tăng tỷ lệ đồng sắc tố làm chậm đáng kể quá trình phân hủy anthocyanin ở 90 o C Ngoài ra, việc bổ sung đồng sắc tố cũng làm tăng màu sắc của chiết xuất hoa đậu biếc (Sriariyanun et al., 2020) Một nghiên cứu khác của Escher et al (2020) đã báo cáo về tính ổn định của anthocyanin hoa đậu biếc được acyl hóa bằng axit phenolic (axit p-coumaric, caffeic, ferulic, synapic, gallic) và axit hữu cơ (axit malonic, acetic, malic, succinic hoặc oxalic) Kết quả nghiên cứu cho thấy acyl hóa trên phân tử anthocyanin làm tăng tính ổn định thông qua quá trình đồng sắc tố nội phân tử hoặc liên phân tử và các phản ứng tự liên kết, do đó tăng cường tính ổn định của anthocyanin trong các ứng dụng thực phẩm (Escher et al., 2020) Marpaung & Pramesthi (2020) cũng đã thực hiện nghiên cứu nhằm tăng tính ổn định của anthocyanin trích ly từ ba nguồn (hoa đậu biếc, hoa bìm bìm, lá bắp cải) với nhiệt độ bằng cách thêm các loại đường như sucrose, glucose, maltose trong quá trình bảo quản ở pH 5 và pH 6 Việc tăng lượng đường bổ sung sẽ làm tăng tính ổn định của tất cả các chất chiết xuất; tuy nhiên, loại đường không có ảnh hưởng đáng kể đến anthocyanin của dịch chiết (Marpaung & Pramesthi, 2020) Marpaung & Pustikarini (2023) tiếp tục nghiên cứu độ ổn định của anthocyanin từ chiết xuất hoa đậu biếc khi bổ sung muối (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, FeCl3 và AlCl3) Nghiên cứu này nhấn mạnh tiềm năng của việc bổ sung các cation để cải thiện độ ổn định màu của chiết xuất hoa đậu biếc, làm cho sắc tố anthocyanin trở thành một chất tạo màu thực phẩm hấp dẫn hơn (Marpaung & Pustikarini, 2023) Trong một nghiên cứu khác của Marpaung & Suwandy (2023), tác giả đề cập đến tác dụng ổn định của dimethylsulfoxide (DMSO) đối với màu sắc của chiết xuất hoa đậu biếc ở pH 6, 7 và 8 Kết quả chứng minh rằng việc bổ sung DMSO không làm thay đổi đáng kể quang phổ của chiết xuất, nghiên cứu cũng cho thấy không có sự hình thành phức tạp giữa DMSO và anthocyanin hoặc flavonoid (Marpaung & Suwandy, 2023) Kết quả từ
20 nghiên cứu này cung cấp những thông tin có giá trị cho sự phát triển của chất tạo màu tự nhiên, nhấn mạnh vai trò của dung môi hữu cơ trong việc tăng cường độ ổn định màu
Từ những thông tin đã tổng hợp ở trên, nhìn chung các nghiên cứu xoay quanh vấn đề ổn định anthocyanin bằng cách bổ sung đường, muối, acid, đồng sắc tố (copigment), điều chỉnh pH hay nhiệt độ bảo quản Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào khai thác về tiềm năng của chất giữ ẩm trong việc bảo quản anthocyanin Chính vì vậy, nhóm chúng tôi thực hiện đề tài khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện bảo quản đến chất lượng và động học phân hủy của dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc (Clitoria ternatea) Trong nghiên cứu này, dịch trích anthocyanin sẽ được bổ sung một trong hai loại chất giữ ẩm (glycerol, sorbitol) với mẫu đối chứng là dung dịch anthocyanin - nước Tất cả các mẫu đều được bổ sung chất bảo quản thực phẩm (kali sorbate) và chỉnh về pH bảo quản (pH = 3) bằng acid hydrochloric Sau đó, tiến hành bảo quản ở điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 12 ngày đối với nhiệt độ 33 ℃ và 30 ngày đối với nhiệt độ 10 ℃ và 25 ℃ Dữ liệu của quá trình bảo quản được thu thập, phân tích để đánh giá độ bền màu, sự thay đổi hàm lượng của sắc tố anthocyanin và khả năng kháng oxy hóa của các mẫu Đồng thời từ số liệu thu nhận tiến hành phân tích động học phân hủy của dịch trích anthocyanin từ hoa đậu biếc theo mô hình Arrhenius để dự đoán sự thay đổi chất lượng sắc tố anthocyanin diễn ra trong quá trình bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là hoa đậu biếc (Clitoria ternatea L.) Hoa đậu biếc sấy lạnh được mua tại công ty TNHH thảo dược Duy Hưng (363/16 Đinh Bộ Lĩnh, phường 26, quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh) Bột hoa đậu biếc được sản xuất theo quy trình ở Hình 3.1
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất bột hoa đậu biếc
Hoa đậu biếc khô được loại bỏ đài hoa, cánh hoa được nghiền nhỏ và rây bột qua rây có kích thước lỗ 0.2 mm Sau đó, bột hoa đậu biếc được đựng trong các túi zip tối màu và bảo quản trong tủ đông -18℃ để chuẩn bị cho quá trình nghiên cứu
Toàn bộ hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được mua tại Công ty cổ phần thiết bị - hóa chất Bách Khoa, địa chỉ: 270A Lý Thường Kiệt, Phường 14 , Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh
Nghiền Hoa đậu biếc khô
Quy trình trích ly anthocyanin
3.2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ
Quy trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc trong nghiên cứu được tham khảo từ phương pháp của Jeyaraj et al (2021) với một số sự thay đổi để phù hợp với điều kiện tại nơi thực hiện thí nghiệm
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc
3.2.2 Thuyết minh quy trình: Định lượng 10 g bột hoa đậu biếc cho vào erlen 250 mL, sau đó thêm 230 mL ethanol 70 o vào erlen (tỉ lệ dung môi : chất rắn là 23:1) Quá trình trích ly diễn ra trong tủ lắc ổn nhiệt với nhiệt độ 60 o C, tốc độ lắc 250 rpm và thời gian trích ly 20 phút Tiếp theo, dịch trích anthocyanin được ly tâm với tốc độ 4000 rpm trong 15 phút sử dụng thiết bị ly tâm Hettich Z366 (Hermle, Đức) Thu phần dịch lỏng trong ống ly tâm, tiến hành cô đặc chân không (thiết bị cô quay chân không Yamato RE 301A, Nhật Bản) ở nhiệt độ 50 o C cho đến khi không còn dung môi thoát ra
23 Dung dịch anthocyanin sau cô đặc được bổ sung 0.06 % kali sorbate để chống lại sự phát triển của vi sinh vật khi bảo quản Tiến hành phối trộn chất giữ ẩm (sorbitol hoặc glycerol) hoặc nước vào dung dịch anthocyanin theo tỉ lệ 1 : 1 (v/v) (Bảng 3.1) Sử dụng acid hydrochloric đậm đặc để điều chỉnh pH dung dịch anthocyanin về pH 3 vì đây là pH giúp màu xanh lam của hoa đậu biếc ít nhạy cảm trong môi trường axit nhẹ hoặc trung tính (Vidana Gamage et al., 2021) Ngay sau đó, phân phối mẫu vào các hũ thủy tinh tối màu đã được làm sạch và tiến hành bảo quản mẫu ở ba nhiệt độ khác nhau: 10 o C (ngăn mát tủ lạnh), 25 o C (tủ vi khí hậu Memmert ICH750, Đức), 33 o C (nhiệt độ phòng) Cụ thể có 9 mẫu được khảo sát như sau:
Bảng 3.1 Các mẫu khảo sát trong nghiên cứu
Mẫu Dịch chiết anthocyanin Nước cất Sorbitol Glycerol Nhiệt độ bảo quản
- C10, C25, C33 lần lượt là mẫu đối chứng (mẫu bổ sung nước) ở các nhiệt độ bảo quản 10 o C,
- S10, S25, S33 lần lượt là mẫu bổ sung sorbitol ở các nhiệt độ bảo quản 10 o C, 25 o C, 33 o C;
- G10, G25, G33 lần lượt là mẫu bổ sung glycerol ở các nhiệt độ bảo quản 10 o C, 25 o C, 33 o C
Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định hàm lượng một số thành phần hóa học có trong bột hoa đậu biếc
Mục đích: Xác định hàm lượng ẩm, hàm lượng tro và màu sắc của bột hoa đậu biếc để so sánh với các chỉ tiêu nguyên liệu trong thực tế và trong các nghiên cứu khác Từ đó, đánh giá tiềm năng của việc trích ly anthocyanin từ nguyên liệu hoa đậu biếc ban đầu
Cách thực hiện: Độ ẩm được xác định theo phương pháp: AOAC 934.01 được mô tả tại mục 3.4.1; Hàm lượng tro được xác định theo phương pháp: AOAC 923.03 được mô tả tại mục 3.4.2
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến hàm lượng anthocyanin và sự bền màu của dung dịch anthocyanin theo thời gian
Mục đích: Thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến hàm lượng anthocyanin và sự bền màu của dung dịch anthocyanin theo thời gian
Cách thực hiện: Tiến hành bảo quản các mẫu theo Bảng 3.1 Mẫu được lấy định kỳ (mỗi ngày hoặc mỗi ba ngày) để đo hàm lượng anthocyanin và màu sắc
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến khả năng chống oxy hóa (bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH và phương pháp khử sắt FRAP) của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản
(10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin
Cách thực hiện: Các mẫu dung dịch anthocyanin sẽ được đánh giá khả năng chống oxy hóa vào ngày cuối cùng của quá trình bảo quản và so sánh với ngày đầu tiên Khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (mục 3.4.5) Khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử sắt FRAP (mục 3.4.6)
3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học phân hủy của dung dịch chất màu anthocyanin theo thời gian
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản
(10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến thời gian bán hủy (t1/2) và năng lượng hoạt hóa (Ea) của các mẫu dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc
Cách thực hiện: Các nghiên cứu của Cemeroglu et al (1994); Dyrby et al (2001); Wang
& Xu (2007) đã chỉ ra rằng sự phân hủy nhiệt của anthocyanin tuân theo phương trình bậc nhất Sự phân hủy anthocyanin ở mỗi nhiệt độ bảo quản được phân tích hồi quy riêng biệt bằng cỏch sử dụng mụ hỡnh phõn hủy bậc nhất của ệzkan et al (2004) ln [ C t
C 0 là tỉ lệ anthocyanin được giữ lại sau thời gian t; k là hằng số tốc độ (ngày⁻ạ); t là thời gian bảo quản (ngày); t1/2 là chu kì bán rã (ngày) Để tìm được hằng số tốc độ (k) ở mỗi nhiệt độ, dựng đồ thị của −ln [ C t
C 0] theo thời gian Đây là một đường thẳng đi qua gốc tọa độ với độ dốc là k (hằng số tốc độ) Mô hình Arrhenius được sử dụng để mô tả sự phụ thuộc của k vào nhiệt độ (với k là hằng số tốc độ phân hủy) (ệzkan et al., 2004; Wang & Xu, 2007) Phương trỡnh Arrhenius được biểu diễn như sau: k = k 0 e (− RT Ea ) (3.3) Trong đó: k0 là hệ số (pre-exponential);
Ea là năng lượng hoạt hóa (kJ/mol);
R là hằng số khí (8.314 J/(mol.K));
T là nhiệt độ tuyệt đối (K)
26 Bằng cách lấy logarit của cả hai vế của phương trình (3.3) ta sẽ có phương trình tuyến tính như sau: ln(k) = ln(k 0 ) − E a
Như vậy, đồ thị của ln(k) theo 1/T sẽ cho một đường thẳng với k0 là giao điểm với trục tung và − E a
R là hệ số góc Từ đó tính được năng lượng hoạt hóa Ea
Hằng số tốc độ phân hủy (k) và thời gian bán hủy (t1/2) của các mẫu bảo quản
Năng lượng hoạt hóa (Ea).
Phương pháp phân tích
3.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu
Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ cao để tách nước tự do ra khỏi nguyên liệu Cân khối nguyên liệu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước trong nguyên liệu
Sấy đĩa petri ở nhiệt độ 105 ℃ đến khối lượng không đổi trong vòng 1 giờ, sau đó bỏ vào bình hút ẩm để làm nguội rồi đem cân ở cân phân tích bốn số với độ chính xác 0.1 mg
Cân chính xác 5 g mẫu với cân phân tích bốn số rồi bỏ vào đĩa petri Sau đó đem sấy đối lưu đến khối lượng không đổi bằng tủ sấy ở 105 ℃ trong vòng 4 giờ Sau khi sấy được 1 giờ thì cứ sau 1 giờ tiến hành cân thử 1 lần Cứ lặp lại cho đến khi kết quả của 2 lần cân thử sai khác nhau không quá 0.5 mg Lấy giá trị trung bình của 3 lần lặp
Kết quả: Độ ẩm (%) được tính theo công thức: x = m 1 −m 2 m 1 −m × 100 (3.5)
Trong đó: x là độ ẩm nguyên liệu (%); m1 là khối lượng đĩa petri và mẫu trước khi sấy (g); m2 là khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g); m là khối lượng đĩa petri sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)
3.4.2 Phương pháp xác định tro của nguyên liệu
Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ cao (550 – 600 ℃) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, phần còn lại đem cân và tính được phần trăm tro trong nguyên liệu
Sấy chén sứ ở nhiệt độ 100 ℃ cho đến khối lượng không đổi, sau đó bỏ vào bình hút ẩm để làm nguội rồi đem cân ở cân phân tích với độ chính xác 0.1 mg
Cân chính xác 5 g nguyên liệu cho vào chén sứ rồi cân lại cả chén và mẫu nguyên liệu Sau đó, nung ở nhiệt độ 600 ℃ trong 6 giờ rồi bỏ vào bình hút ẩm để làm nguội Nung cho đến khi tro trắng nghĩa là đã loại bỏ hết các chất hữu cơ trong 6 giờ
Trường hợp tro còn đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc 10 mL HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến khi tro trắng Để nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác như trên Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến khi trọng lượng không đổi Kết quả giữa 2 lần nung và cân tiếp theo không được cách nhau quá 0.5 mg
Hàm lượng tro (%) được tính theo công thức:
Trong đó: X là hàm lượng tro (%); G1 là khối lượng chén sứ và mẫu sau khi nung (g); G2 là khối lượng chén sứ và mẫu trước khi nung (g); G là khối lượng chén sứ sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)
3.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin
Tổng anthocyanin đơn phân được xác định bằng cách sử dụng phương pháp vi sai pH theo AOAC 2005.02 Dịch chiết anthocyanin được pha loãng với dung dịch đệm kali clorua và dung dịch đệm natri axetat tương ứng trong hai ống nghiệm khác nhau Để ống nghiệm trong tối 30 phút Độ hấp thụ của mẫu pha loãng với pH 1.0 và pH 4.5 được xác định ở bước sóng 520 nm và 700 nm với mẫu trắng là nước cất Giá trị hấp thụ được xác định bằng công thức sau:
A = [(A520nm – A700nm) pH 1.0 – (A520nm – A700nm) pH 4.5] (3.7)
28 Tổng hàm lượng anthocyanin được biểu thị bằng cyanidin-3-glucoside tương đương và được tính bằng công thức sau:
Tổng hàm lượng anthocyanin (mg/g mẫu khô ) =A×DF×MW×1000 ε×L×m (3.8) Trong đó:
L là bề dày của mẫu khi ánh sáng đi qua, L = 1 cm;
DF là hệ số pha loãng;
MW là trọng lượng phân tử (449.2 g/mol đối với cyanidin-3-glucoside); ε là độ hấp thụ mol trung bình của cyanidin-3-glucoside (26900 L.mol -1 cm -1 ) m là khối lượng bột mẫu (g)
Phần trăm anthocyanin còn lại (%) = AC 0
Trong đó: AC0 là hàm lượng anthocyanin ban đầu (mg/gmẫu khô); ACt là hàm lượng anthocyanin sau t ngày bảo quản (mg/gmẫu khô)
3.4.4 Phương pháp xác định màu của dung dịch anthocyanin
Sự thay đổi màu sắc anthocyanin theo các ngày bảo quản được đo bằng máy đo màu CR-
400 (Konica minolta, Nhật Bản) tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh với ba giá trị L*, a*, b* Trong đó:
L* là độ sáng hay tối của màu, L* = 0 (đen), L* = 100 (trắng); a* là trị số của tông màu đỏ, (-a* = xanh lục), (+a* = đỏ); b* là trị số của tông màu vàng, (-b* = xanh dương), (+b* = vàng)
3.4.5 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử gốc tự do (DPPH)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng của các chất chống oxy hóa có trong mẫu thử với gốc DPPH + Khi chất chống oxy hóa khử các gốc tự do bằng cách cho hydro, màu tím của DPPH sẽ trở nên nhạt hơn hoặc vàng nhạt, do đó làm giảm giá trị hấp thụ (Rahman và cộng sự, 2015)
Chuẩn bị dung dịch DPPH - methanol 0.1 mM: 0.0039g DPPH được hòa tan và định mức bằng methanol trong bình định mức 100 mL
Dung dịch acid ascorbic chuẩn (1 mg/mL): Cân 0.1 g acid ascorbic hòa tan và định mức lên bằng 100 mL nước cất
Phân tích mẫu: Cho vào mỗi ống nghiệm 0.1 mL mẫu và 3.9 mL dung dịch DPPH - methanol lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng (30 o C), điều kiện bóng tối trong 30 phút Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm với mẫu đối chứng là dung dịch DPPH – methanol Lấy giá trị trung bình của 3 lần lặp
Dựng đường chuẩn: Cho 0.1 mL dung dịch acid ascorbic ở các nồng độ khác nhau (0, 20,
40, 60, 80 àg/mL) và 3.9 mL dung dịch DPPH - methanol vào mỗi ống nghiệm, tiến hành lắc đều và ủ điều kiện bóng tối trong 30 phút Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm, giá trị độ hấp thụ và khả năng quét gốc tự do (%) tương ứng với các nồng độ acid ascorbic Đường chuẩn acid ascorbic với trục hoành là nồng độ acid ascorbic (àg/mL) và trục tung là phần trăm khả năng quét gốc tự do (%DPPH) như Hình 3.3
Hình 3.3 Đường chuẩn xác định nồng độ acid ascorbic để đo hoạt tính chống oxy hóa DPPH
Phần trăm ức chế DPPH được xác định theo công thức:
Ac: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng
Am: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Hoạt độ chống oxy húa của mẫu được biểu thị bằng số àg đương lượng acid ascorbic (AAE) trên 1 mL mẫu, được tính theo công thức sau:
Khả năng khỏng oxy húa DPPH (àg AAE/mL mẫu) = a ì DF (3.11) Trong đó: a (àg /mL): Nồng độ acid ascorbic;
DF: Hệ số pha loãng Phần trăm kháng oxy hóa còn lại được tính toán theo công thức sau:
Phần trăm kháng oxy hóa còn lại (%) = A t ×100
Trong đú: At là khả năng khỏng oxy húa sau t ngày bảo quản (àg AAE/mL mẫu); Ao là khả năng khỏng oxy húa ban đầu (àg AAE/mL mẫu)
3.4.6 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt (FRAP)
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự khử hóa học phức hợp ferricyanide (Fe 3+ ) thành dạng sắt (Fe 2+ ) Các hợp chất có khả năng chống oxy hóa phản ứng với kali ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) để tạo thành kali ferrocyanide (K4[Fe(CN)6]) K4[Fe(CN)6] phản ứng với triclorua sắt, tạo ra feroxyanua sắt, một phức chất màu xanh lam, với độ hấp thụ cực đại ở 700 nm (Gupta và cộng sự, 2016)
Pha hóa chất: Đệm phosphate (0.2 M, pH = 6.6): 8 g NaCl + 0.2 g KCl + 3.58 g Na2HPO4.12H2O + 0.24 g KH2PO4 định mức lên 1 L bằng nước cất Sau khi định mức, chỉnh về pH = 6.6 bằng HCl và bảo quản ở nhiệt độ phòng
K3Fe(CN)6 (1 %): Cân 1 g K3Fe(CN)6 hòa tan và định mức lên 100 mL bằng nước cất
Cl3CCOOH (10 %): Cân 10 g Cl3CCOOH hòa tan và định mức lên 100 mL bằng nước cất
FeCl3 (0.1 %): Cân 0.17 g FeCl3.6H2O hòa tan và định mức lên 100 mL bằng nước cất
Dung dịch acid ascorbic chuẩn (1 mg/mL): Cân 0.1 g acid ascorbic hòa tan và định mức lên 100 mL bằng nước cất
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát một số chỉ tiêu của bột hoa đậu biếc
Để hiểu rõ về thành phần hóa học của nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định một số chỉ tiêu của bột hoa đậu biếc Bảng 4.1 trình bày một số chỉ tiêu như độ ẩm, hàm lượng tro và màu sắc của bột hoa đậu biếc
Bảng 4.1 Một số chỉ tiêu của bột hoa đậu biếc Độ ẩm (%) Hàm lượng tro (%)
Dựa trên kết quả phân tích cho thấy bột hoa đậu biếc có độ ẩm 12.50 % Với mong muốn duy trì chất lượng dịch màu anthocyanin chiết xuất từ hoa đậu biếc tốt nhất thì kết quả này đạt yêu cầu về độ ẩm của mẫu dược liệu (không vượt quá 13 % theo phụ lục 9.6 của Dược điển Việt Nam) Tuy nhiên, kết quả độ ẩm tương đối cao so với nghiên cứu của Turnos (2021) (8.15 %) Theo Hariadi et al (2018), chế phẩm anthocyanin ở dạng bột có tính hút ẩm cao nên trong quá trình xử lý và bảo quản rất dễ tái ẩm, có thể gây ra hiện tượng vón cục, nấm mốc và hư hỏng
Trong nghiên cứu này, bột hoa đậu biếc có hàm lượng tro 5.4 % Theo Nurapni et al (2023), hàm lượng tro tổng của hoa đậu biếc vào khoảng 3.8 - 10.93 % Mặt khác, theo nghiên cứu của Turnos (2021), trung bình các loại hoa đậu biếc có hàm lượng tro cao hơn (7.85 %) Có thể thấy, kết quả hàm lượng tro trong nghiên cứu này có phần thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây nguyên nhân một phần có thể xuất phát từ việc chỉ sử dụng cánh hoa đậu biếc Theo Kadam & Patil (2013), thành phần và hàm lượng tro còn lại sau khi đốt nguyên liệu thực vật phụ thuộc vào bộ phận, tuổi của cây và các phương pháp xử lý khác Theo Nurapni et al (2023), hàm lượng tro cho biết độ tinh khiết của nguyên liệu thô đồng thời ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm khi sử dụng hoa đậu biếc làm nguyên liệu; hàm lượng tro càng thấp thì chất lượng hoa đậu biếc càng cao
Hình 4.1 Màu bột hoa đậu biếc Để đảm bảo tính khách quan trong việc đánh giá màu sắc bột hoa đậu biếc, song song với việc đánh giá bằng mắt, nghiên cứu này thể hiện màu sắc của bột hoa đậu biếc qua các giá trị L*, a*, b* (Bảng 4.1) Độ sáng của bột hoa đậu biếc được đánh giá thông qua giá trị L* = 18.68 Theo Netravati et al (2022), giá trị L* dao động từ 18.09 đến 49.24, giá trị L*càng thấp biểu thị bột càng tối màu Bên cạnh đó, nghiên cứu của Cheok & Ragunathan (2022) cho rằng hàm lượng anthocyanin càng cao, dung dịch màu thu được càng đậm thì bột càng tối màu
Chỉ số a* (xanh lá - đỏ) của bột hoa đậu biếc bằng 6.01, giá trị này tương đối thấp vì màu đỏ ở hoa đậu biếc không thể hiện rõ Bột hoa đậu biếc có sắc tố anthocyanin đóng vai trò là chất tạo màu quan trọng nên cường độ sắc tố màu trong bột hoa đậu biếc có thể ảnh hưởng đến giá trị b* tương ứng Theo Netravati et al (2022), sắc tố xanh lam đặc trưng của hoa đậu biếc được thể hiện ở thông số b* (xanh lam - vàng) Trong nghiên cứu này, sắc tố màu xanh lam đậm biểu thị qua giá trị b* = -5.56 Giá trị b* càng lớn thì sắc tố màu xanh lam càng nhạt dần và ngược lại Kết quả L*, a*, b* trong nghiên cứu này cũng tương tự với kết quả của nghiên cứu Hawa et al (2021) với sự chênh lệch không đáng kể (L* = 16.47, a* = 3.33 và b* = - 8.81)
4.2 Ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃,
33 ℃) đến hàm lượng anthocyanin và sự bền màu của dung dịch anthocyanin theo thời gian
Anthocyanin là các hợp chất polyphenol tạo ra nhiều màu sắc khác nhau như hồng, đỏ, tím và xanh trong hoa, rau và trái cây (Alappat & Alappat, 2020) Như đã đề cập ở Chương 2, độ ổn định màu của anthocyanin không chỉ bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm cấu trúc mà còn bị
35 ảnh hưởng bởi mức độ oxy hóa trong các quá trình chế biến và bảo quản Do đó, để đánh giá độ ổn định màu của anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc theo thời gian, chiết xuất anthocyanin trước tiên được bổ sung chất giữ ẩm (glycerol, sorbitol) Sau đó, tất cả các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 33 ℃, 25 ℃ và 10 ℃ Từ kết quả thu được, nghiên cứu này tìm ra điều kiện tốt nhất cho độ ổn định sắc tố anthocyanin khi bảo quản
4.2.1 Ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃,
25 ℃, 33 ℃) đến hàm lượng anthocyanin theo thời gian
Bảng 4.2 Phần trăm anthocyanin còn lại (%) của các mẫu ở nhiệt độ (a) 33 ℃, (b) 25 ℃, (c)
Chú thích: Các giá trị trong bảng được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Những chữ cái in hoa (A, B, C,…) hoặc chữ thường (a, b, c,…) khác nhau trong cùng một hàng hoặc cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) a Ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) đến hàm lượng anthocyanin trong thời gian bảo quản
Bảng 4.2 biểu diễn sự thay đổi hàm lượng anthocyanin theo thời gian bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) Kết quả cho thấy, ở 25 ℃ và 33 ℃ hàm lượng anthocyanin còn lại của mẫu C, S, G ở cùng một thời gian bảo quản là không có sự khác biệt có ý nghĩa (p
> 0.05) Cụ thể sau 12 ngày bảo quản C33, S33, G33 có hàm lượng anthocyanin còn lại lần lượt là 81.53 %, 78.02 %, 79.28 % (Bảng 4.2a) Cùng thời gian bảo quản đó (ngày 12), hàm lượng anthocyanin còn lại của mẫu C25, S25, G25 là 82.48 – 88.73 % (Bảng 4.2b) Tuy nhiên, ở nhiệt
38 độ bảo quản thấp nhất (10 ℃), G10 cho thấy khả năng bảo quản anthocyanin tốt hơn so với S10 và C10 Theo số liệu từ Bảng 4.2c, sau 30 ngày bảo quản hàm lượng anthocyanin còn lại của mẫu G10 là 87.64 %, cao hơn đáng kể so với mẫu S10 (80.87 %) và C10 (81.28 %)
Số liệu thu được đã cho thấy glycerol có khả năng làm tăng độ ổn định của anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc Việc bổ sung chất giữ ẩm vào các sản phẩm thực phẩm có thể làm tăng tính ổn định của sản phẩm, giảm hoạt động của vi sinh vật và bảo vệ kết cấu thực phẩm (Azelee et al., 2019) Glycerol và sorbitol là các polyol, còn gọi là rượu đường hay rượu đa chức, là một nhóm chất tạo ngọt có khả năng khử nước mạnh (Wiktor et al., 2022) Chất tạo ngọt làm giảm hoạt độ nước bằng cách giảm các phân tử nước nucleophilic sẵn có có thể tấn công lõi anthocyanin và do đó làm giảm sự thoái hóa anthocyanin (Vidana Gamage et al., 2022) Theo Marpaung & Pramesthi (2020), lượng đường được bổ sung vào dịch trích cũng làm tăng đáng kể độ ổn định anthocyanin của hoa đậu biếc, hoa bìm bìm (Ipomoea tricolor) và lá bắp cải (Brassica oleracea) Một nghiên cứu khác của Kopjar et al (2012) cũng cho thấy độ ổn định anthocyanin tăng lên đáng kể trong quá trình bảo quản khi bổ sung các loại đường (glucose, trehalose) với nồng độ 10 % vào chiết xuất quả mâm xôi b Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến hàm lượng anthocyanin theo thời gian
Bảng 4.2 cho thấy thời gian bảo quản càng tăng hàm lượng anthocyanin có xu hướng càng giảm ở cả ba nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) Cụ thể, sau 12 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng (33 ℃), phần trăm anthocyanin còn lại của các mẫu chuẩn (bổ sung nước), sorbitol, glycerol lần lượt là 81.53 %, 78.02 % và 79.28 % (Bảng 4.2a) Tương tự ở 25 ℃, phần trăm anthocyanin còn lại sau 30 ngày bảo quản là 75.63 % (C25), 74.44 % (S25) và 80 % (G25) (Bảng 4.2b) Sau 30 ngày bảo quản ở 10 ℃, phần trăm anthocyanin còn lại là 81.28 % (C10), 80.87 % (S10), 87.64 % (G10) (Bảng 4.2c) Khi so sánh cụ thể từng ngày bảo quản, hầu hết các mẫu đều cho thấy sự suy giảm hàm lượng anthocyanin rõ ràng sau 3 ngày Điển hình như mẫu G25, hàm lượng anthocyanin suy giảm trong 3 ngày đầu tiên theo thứ tự 100 % (ngày 0) > 96.77
% (ngày 1) > 96.42 % (ngày 2) > 92.68 % (ngày 3) Mẫu S10 cũng cho xu hướng tương tự, trong 3 ngày bảo quản đầu tiên phần trăm anthocyanin còn lại được sắp xếp theo thứ tự sau: 100
% (ngày 0) > 90.76 % (ngày 1) > 88.33 % (ngày 2) > 87.98 % (ngày 3) Nguyên nhân của xu
39 hướng này là thời gian bảo quản càng lâu thì sự có mặt của oxy có thể đẩy nhanh quá trình phân hủy anthocyanin (Patras et al., 2010) Nghiên cứu của Sinela et al (2017) cũng cho kết quả tương tự khi bảo quản chiết xuất anthocyanin từ hoa bụt giấm trong 60 ngày
Kết quả thí nghiệm cho thấy nhiệt độ bảo quản càng thấp hàm lượng anthocyanin được giữ lại càng cao Mẫu bổ sung sorbitol có phần trăm anthocyanin còn lại sau 12 ngày bảo quản ở 33 ℃ là 78.02 %, thấp hơn đáng kể (p < 0.05) so với nhiệt độ 25 ℃ (83.43 %) và 10 ℃ (84.71
%) Tương tự, cùng thời gian bảo quản (ngày 12), phần trăm anthocyanin còn lại của các mẫu bổ sung glycerol được sắp xếp theo thứ tự 79.28 % (33 ℃) < 88.73 % (25 ℃) < 92.89 % (10
℃) Shu et al (2022) cũng thu được xu hướng tương tự khi bảo quản dịch chiết hoa đậu biếc ở
Ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản
℃) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản
Như đã đề cập ở Chương 2, hoa đậu biếc không chỉ được biết đến với hàm lượng anthocyanin dồi dào mà còn được quan tâm bởi hoạt tính chống oxy hóa cao Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất hoa đậu biếc được xác định bằng xét nghiệm nhặt gốc tự do (DPPH) và chống oxy hóa khử sắt (FRAP) theo thời gian bảo quản
Bảng 4.6 Phần trăm chống oxy hóa còn lại xác định bằng phương pháp DPPH của dung dịch anthocyanin theo thời gian bảo quản
Phần trăm chống oxy hóa còn lại (%)
Chú thích: Các giá trị trong bảng được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Những chữ cái (a, b, c,…) khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05)
Bảng 4.7 Phần trăm chống oxy hóa còn lại xác định bằng phương pháp FRAP của dung dịch anthocyanin theo thời gian bảo quản
Mẫu Phần trăm chống oxy hóa còn lại (%)
Chú thích: Các giá trị trong bảng được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Những chữ cái (a, b, c,…) khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05)
4.3.1 Ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản bằng phương pháp DPPH và FRAP
Kết quả Bảng 4.6 và Bảng 4.7 cho thấy mức độ ảnh hưởng của chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản Ở tất cả nhiệt độ bảo quản, mẫu G có tác dụng chống oxy hóa tích cực hơn mẫu S Bảng 4.6 cho thấy ở nhiệt độ 10 ℃, sau 30 ngày bảo quản giá trị DPPH còn lại của mẫu G10 (94.1 %) cao hơn 4
% so với mẫu S10 (90.1 %) Ở nhiệt độ 33 ℃, phần trăm kháng gốc tự do DPPH còn lại sau 12 ngày bảo quản của mẫu G33 (83.2 %) cao hơn 0.4 % so với mẫu S33 (82.8 %) Xu hướng tương tự cũng thu được ở phương pháp chống oxy hóa khử sắt (FRAP), kết quả Bảng 4.7 cho thấy ở
48 nhiệt độ 10 ℃, sau 30 ngày bảo quản phần trăm FRAP còn lại của mẫu G10 (96.0 %) cao hơn 1.9 % so với mẫu S10 (94.1 %) Sau 12 ngày bảo quản ở nhiệt độ 33 ℃, phần trăm khử sắt còn lại của mẫu G33 (94.8 %) cao hơn 2 % so với mẫu S33 (92.8 %) Bên cạnh đó, việc bổ sung chất giữ ẩm vào dung dịch anthocyanin có ảnh hưởng tích cực đến khả năng chống oxy hóa sau quá trình bảo quản Điển hình, phần trăm DPPH còn lại của mẫu control luôn thấp hơn các mẫu bổ sung chất giữ ẩm (Bảng 4.6) Sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 10 ℃, phần trăm DPPH còn lại của mẫu S10 cao hơn 3.2 % so với mẫu C10 trong khi mẫu G10 cao hơn 7.3 % Tương tự, ở nhiệt độ 25 ℃ mẫu S25 cao hơn 1.2 % so với mẫu C25 trong khi mẫu G25 cao hơn 8.2 % sau
30 ngày bảo quản Ở nhiệt độ 33 ℃, phần trăm DPPH còn lại sau 12 ngày bảo quản của mẫu S33 cao hơn 11.3 %, mẫu G33 cao hơn 11.7 % so với mẫu C33 Song song đó, phần trăm chống oxy hóa khử sắt còn lại (Bảng 4.7) cũng cho kết quả tương tự khi so sánh với mẫu chuẩn (C)
Cụ thể sau 30 ngày bảo quản, ở nhiệt độ 10 ℃ phần trăm FRAP còn lại của mẫu S10 cao hơn 0.4 %, mẫu G10 cao hơn 2.3 % so với mẫu C10 Tương tự ở nhiệt độ 25 ℃ (ngày 30), mẫu S25 cao hơn 5.9 %, mẫu G25 cao hơn 7.2 % so với mẫu C25 Ở nhiệt độ 33 ℃, hoạt tính chống oxy hóa khử sắt còn lại sau 12 ngày bảo quản của mẫu S33 cao hơn 5.4 % so với mẫu C33 trong khi mẫu G33 cao hơn 7.4 % Nhìn chung, kết quả thu được ở tất cả nhiệt độ bảo quản chỉ ra tiềm năng chống oxy hóa đáng kể khi bổ sung chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) Độ ổn định anthocyanin khác nhau trong quá trình bảo quản có thể là do sự tương tác của anthocyanin với các thành phần môi trường của dung dịch (Maqsoudlou et al., 2022) Chính vì sự khác biệt giữa các thành phần chất giữ ẩm bổ sung vào dung dịch anthocyanin nên sau quá trình bảo quản, nồng độ anthocyanin trong mỗi dung dịch giảm khác nhau dẫn đến khả năng chống oxy hóa cũng khác nhau Vậy nên, nghiên cứu này càng nhận định rõ sức ảnh hưởng của việc bổ sung chất giữ ẩm trong quá trình bảo quản dung dịch anthocyanin từ hoa đậu biếc đến khả năng chống oxy hóa Thứ tự đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên khả năng chống oxy hóa theo thời gian như sau: Control < Sorbitol < Glycerol Xu hướng tương tự cũng thu được ở nghiên cứu của Kurek et al (2024) khi sử dụng glycerol là dung môi trích ly
4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33 ℃) đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản bằng phương pháp DPPH và FRAP
Nhìn chung, số liệu thu được từ Bảng 4.6 và Bảng 4.7 cho thấy phần trăm chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin ở nhiệt độ 33 ℃ thấp hơn so với nhiệt độ 10 ℃ và 25 ℃ sau thời gian bảo quản Kết quả này hoàn toàn cùng xu hướng với sự suy giảm hàm lượng anthocyanin theo nhiệt độ Ví dụ, phần trăm chống gốc tự do DPPH còn lại sau 12 ngày bảo quản ở nhiệt độ
33 ℃ của các mẫu C, S, G lần lượt là 71.5 %, 82.8 %, 83.2 % (Bảng 4.6) Trong khi bảo quản ở nhiệt độ thấp (10 ℃ và 25 ℃), khả năng chống oxy hóa còn lại cao hơn đáng kể (p < 0.05), nổi bật ở nhiệt độ 10 ℃ với giá trị DPPH còn lại sau 30 ngày bảo quản đều cao hơn 85 % theo thứ tự lần lượt C10 (86.8 %), S10 (90.1 %), G10 (94.1 %) (Bảng 4.6) Tuy nhiên, kết quả Bảng 4.6 cho thấy ở ngày cuối bảo quản, mẫu sorbitol có phần trăm chống gốc tự do DPPH còn lại ở nhiệt độ 33 ℃ (82.8 %, ngày 12) cao hơn ở nhiệt độ 25 ℃ (78.1 %, ngày 30) do không đồng nhất về thời gian bảo quản Theo Luu et al (2021), việc tăng nhiệt độ bảo quản sẽ làm giảm khả năng chống oxy hóa của dung dịch rõ ràng nhất khi bảo quản trong cùng một mốc thời gian Nhìn chung, sự hao hụt khả năng oxy hóa đều diễn ra ở ba nhiệt độ bảo quản, tuy nhiên dễ dàng quan sát thấy khi bảo quản ở nhiệt độ thấp, khả năng chống oxy hóa được giữ lại cao nhất và ngược lại Song song đó, xu hướng tương tự cũng thu được ở phương pháp khử sắt (FRAP) Cụ thể, phần trăm FRAP còn lại sau 12 ngày bảo quản ở nhiệt độ 33 ℃ của các mẫu C, S, G lần lượt là 87.4 %, 92.8 %, 94.8 % (Bảng 4.7) Trong khi bảo quản ở nhiệt độ thấp (10 ℃), khả năng chống oxy hóa khử sắt mạnh mẽ hơn đáng kể với giá trị FRAP còn lại sau 30 ngày bảo quản đều cao hơn 90 % theo thứ tự lần lượt C10 (93.7 %), S10 (94.1 %), G10 (96.0 %) (Bảng 4.7) Đối với phương pháp chống oxy hóa khử sắt, phần trăm FRAP còn lại ở nhiệt độ 33 ℃ sau 12 ngày bảo quản của tất cả các mẫu đều cao hơn phần trăm FRAP còn lại sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 25 ℃ Ví dụ, mẫu G33 (94.8 %, ngày12) có phần trăm chống oxy hóa khử sắt cao hơn 1 % so với mẫu G25 (93.8 %, ngày 30) Tốc độ phản ứng ở mỗi nhiệt độ bảo quản là khác nhau nên thời gian thực hiện bảo quản mẫu cũng khác nhau trong nghiên cứu này Mặc dù có sự khác biệt về thời gian bảo quản nhưng xu hướng suy giảm khả năng chống oxy hóa theo nhiệt độ bảo quản trong nghiên cứu này cũng tương tự với xu hướng của nghiên cứu Luu et al (2021) Nghiên cứu của Luu et al (2021) cho rằng việc tăng nhiệt độ bảo quản làm giảm khả
50 năng chống oxy hóa trong dịch chiết bởi vì nhiệt độ tăng dẫn đến tốc độ phản ứng tăng, thúc đẩy quá trình giải phóng các chất chống oxy hóa thiết yếu tạo thành các hợp chất mới, phân tán khả năng chống oxy hóa
4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin sau quá trình bảo quản bằng phương pháp DPPH và FRAP
Kết quả cho thấy sự thay đổi khả năng chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin bị ảnh hưởng bởi thời gian theo hai phương pháp (DPPH, FRAP) được biểu diễn lần lượt ở Bảng 4.6 và Bảng 4.7 Với việc tăng thời gian bảo quản ở các nhiệt độ, kết quả từ Bảng 4.6 và Bảng 4.7 đều cho thấy sự suy giảm khả năng chống oxy hóa ở các mẫu Ở nhiệt độ 10 ℃, sau 15 ngày bảo quản phần trăm DPPH còn lại đều cao hơn 90 % theo thứ tự C, S, G lần lượt là 93.2 %, 95.9
%, 97.8 % (Bảng 4.6) trong khi đó sau 30 ngày bảo quản chỉ còn lại 86.8 % (C), 90.1 % (S), 94.1 % (G) (Bảng 4.6) Xu hướng tương tự ở nhiệt độ 25 ℃ sau 30 ngày, khả năng kháng gốc tự do còn lại ở các mẫu là 76.9 % (C), 78.1 % (S), 85.1 % (G) (Bảng 4.6) Mặc dù chỉ thực hiện bảo quản trong thời gian ngắn ở nhiệt độ 33 ℃ nhưng kết quả thu được ở Bảng 4.6 vẫn cho thấy sự suy giảm khả năng chống oxy hóa theo thời gian, phần trăm DPPH chỉ còn lại 71.5 % (C), 82.8 % (S), 83.2 % (G) sau 12 ngày bảo quản Khi thời gian bảo quản tăng lên, tổng hàm lượng anthocyanin của dịch chiết hoa đậu biếc giảm dẫn đến khả năng chống oxy hóa giảm Xu hướng này hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của Maqsoudlou et al (2022) Đồng thời, phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa khử sắt (FRAP) cũng cho kết quả tương tự như DPPH Ở nhiệt độ 10 ℃ sau 15 ngày bảo quản, giá trị FRAP còn lại của mẫu C, S, G đều cao hơn 95
% theo thứ tự lần lượt là 95.7 % (C), 97.8 % (S), 98.5 % (G) (Bảng 4.7) trong khi đó sau 30 ngày bảo quản chỉ còn lại 90 % cụ thể là 93.7 % (C), 94.1 % (S), 96.0 % (G) (Bảng 4.7) Tương tự ở nhiệt độ 25 ℃, khả năng kháng oxy hóa khử sắt còn lại sau 30 ngày ở các mẫu C, S, G là 86.6 %, 92.5 %, 93.8 % (Bảng 4.7) Xu hướng khi tăng thời gian bảo quản làm giảm khả năng chống oxy hóa khử sắt cũng cho thấy ở nhiệt độ 33 ℃ (Bảng 4.7), phần trăm FRAP chỉ còn lại 87.4 % (C), 92.8 % (S), 94.8 % (G) sau 12 ngày So sánh kết quả với các nghiên cứu trước đây nhận thấy sự tương đồng về xu hướng, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết anthocyanin giảm dần khi thời gian bảo quản kéo dài Nguyên nhân của sự suy giảm hoạt tính oxy hoá có thể là do sự phân hủy của các hợp chất chống oxy hóa cao tạo thành các hợp chất mới, trùng hợp và
51 oxy hóa một phần (Chen et al., 2020) Sự suy giảm khả năng chống oxy hóa trong quá trình bảo quản phù hợp với mức độ tổn thất anthocyanin
Kết quả thu được từ phương pháp DPPH hoàn toàn cùng xu hướng với phương pháp FRAP như đã bàn luận ở phần trên Thứ tự hoạt tính chống oxy hóa của dung dịch anthocyanin chiết xuất từ hoa đậu biếc đã được bàn luận như sau: glycerol > sorbitol > control Mối tương quan đáng kể được quan sát thấy giữa khả năng chống oxy hóa khử sắt và loại bỏ gốc tự do Tuy nhiên khả năng lưu giữ hoạt tính chống oxy hóa khi xác định bằng phương pháp FRAP cao hơn DPPH mặc dù cùng điều kiện và thời gian bảo quản, minh chứng ở phần trăm còn lại của FRAP (Bảng 4.7) nhiều hơn phần trăm còn lại của DPPH (Bảng 4.6) Kết quả này tương đồng với kết quả trong nghiên cứu về hoa đậu biếc của Lakshan et al (2020) Theo Nwachukwu et al., (2021), nguyên nhân của sự khác biệt có thể xuất phát từ chất oxy hóa trong thuốc thử FRAP không chỉ là Fe 3+ mà còn cả các loại sắt khác, nên việc đánh giá khả năng chống oxy hóa của thực phẩm sử dụng xét nghiệm này có thể gặp khó khăn Nhiều thành phần kim loại trong chiết xuất thực phẩm có thể liên kết với Fe 3+ , tạo thành phức hợp có khả năng phản ứng với chất chống oxy hóa (Nwachukwu et al., 2021) Theo nhiều nghiên cứu trước đây, trong chiết xuất hoa đậu biếc không chỉ có duy nhất anthocyanin mà còn tồn tại các hợp chất khác có khả năng chống oxy hóa như phenolic, flavonoid (Pham et al., 2020) Theo Benzie & Devaki (2018), mỗi phân tử của một chất chống oxy hóa hoạt động oxy hóa khử riêng lẻ có thể cho một, hai hoặc nhiều electron tùy thuộc vào bản chất của chúng và do đó có thể khử một, hai hoặc nhiều phân tử Fe 3+ thành dạng sắt màu xanh lam của chúng nên dẫn đến sự khác biệt Trong xét nghiệm FRAP, nhiều nghiên cứu đã lưu ý rằng sản phẩm cuối cùng có phổ màu xanh thường kết tủa tạo thành huyền phù, góp phần làm nhuộm màu cuvet thử nghiệm và làm tăng khả năng xảy ra lỗi trong xét nghiệm (Nwachukwu et al., 2021).
Động học phân hủy của dung dịch chất màu anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc
Động học phân hủy được sử dụng để theo dõi các thay đổi về chất lượng của dung dịch màu anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc trong quá trình bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau qua các thông số động học Nghiên cứu này được thực hiện nhằm quan sát sự thay đổi chất lượng anthocyanin diễn ra trong quá trình bảo quản ở các mức nhiệt độ khác nhau đồng thời đánh giá sự ảnh hưởng của các chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) và nhiệt độ bảo quản (10 ℃, 25 ℃, 33
℃) đến thời gian bán hủy (t1/2) và năng lượng hoạt hóa (E a ) của các mẫu dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc Hình 4.3 dưới đây biểu diễn sự phân hủy anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau 33 ℃ (a), 25 ℃ (b), 10 ℃ (c)
Hình 4.3 Sự phân hủy anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ (a) 33 ℃, (b) 25 ℃, (c) 10 ℃ (C: mẫu bổ sung nước hay mẫu đối chứng; S: mẫu bổ sung sorbitol; G: mẫu bổ sung glycerol)
Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng xảy ra trong thực phẩm Phương trình hồi quy tuyến tính của tổng hàm lượng anthocyanin chiết xuất từ hoa đậu biếc trong quá trình bảo quản đã được xác nhận rằng quá trình phân hủy của các sắc tố này tuân theo động học phản ứng bậc nhất (Cheok & Ragunathan, 2022; Moldovan & David, 2014) Bởi vì không thể đo được tốc độ phản ứng trong thí nghiệm động học nên hàm lượng của hợp chất mục tiêu được đo dưới dạng hàm của thời gian Bằng cách nghiên cứu sự thay đổi theo thời gian của quá trình phân hủy anthocyanin, các thông số động học như hằng số tốc độ (k), thời gian bán hủy (t1/2) đã được tính toán và trình bày ở Bảng 4.8
Bảng 4.8 Các thông số động học của anthocyanin từ hoa đậu biếc
Mẫu Nhiệt độ k ì 10⁻³ (ngày⁻ạ) R² t 1/2 (ngày)
Bảng 4.8 trình bày những thông số động học như hằng số phân hủy (k), chu kì bán rã (t1/2) khi bảo quản dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc được bổ sung chất giữ ẩm (sorbitol, glycerol) ở ba mức nhiệt độ khác nhau (33 ℃, 25 ℃, 10 ℃) Độ ổn định nhiệt của dịch chiết anthocyanin đã được đánh giá thông qua việc tăng nhiệt độ bảo quản Theo Oancea (2021), nhiệt độ tăng dẫn đến tăng tốc độ phân hủy (k) và làm giảm thời gian bán hủy (t1/2) và ngược lại Tốc độ phân hủy (k) nhỏ thì thời gian bán hủy (t1/2) lớn đồng nghĩa với việc cần nhiều thời gian hơn để phân hủy một nửa nồng độ anthocyanin ban đầu, nghĩa là mẫu được bảo quản lâu hơn Hay nói cách khác, giá trị k càng cao thì tốc độ phân hủy anthocyanin càng lớn, trong khi giá trị t1/2 càng cao phản ánh độ ổn định của anthocyanin càng tốt (Fu et al., 2021)
Nhìn chung, việc tăng nhiệt độ bảo quản từ 10 ℃ lên 25 ℃ dẫn đến tăng tốc độ phân hủy từ 5.7ì10⁻³ ngày⁻ạ (C10) lờn 7.9ì10⁻³ ngày⁻ạ (C25), phõn hủy nhanh hơn 1.4 lần trong khi ở 33 ℃ tốc độ phõn hủy cao hơn 3.2 lần (tăng từ 5.7ì10⁻³ ngày⁻ạ (C10) lờn 18.4ì10⁻³ ngày⁻ạ (C33)) Tương tự như vậy, việc tăng nhiệt độ bảo quản từ 10 °C lên 25 °C dẫn đến tốc độ phân hủy nhanh hơn 1.7 lần ở cả hai mẫu sorbitol (tăng từ 3.7ì10⁻³ ngày⁻ạ (S10) lờn 6.6ì10⁻³ ngày⁻ạ (S25)) và glycerol (tăng từ 3.5ì10⁻³ ngày⁻ạ (G10) lờn 6.1ì10⁻³ ngày⁻ạ (G25)) Trong khi tăng nhiệt độ lờn 33 °C, tốc độ phõn hủy ở mẫu sorbitol cao hơn 4.7 lần (tăng từ 3.7ì10⁻³ ngày⁻ạ
55 (S10) lờn 17.4ì10⁻³ ngày⁻ạ (S33)) và ở mẫu glycerol cao hơn 4.2 lần (tăng từ 3.5ì10⁻³ ngày⁻ạ (G10) lờn 14.9ì10⁻³ ngày⁻ạ (G33)) Bằng cỏch so sỏnh cỏc giỏ trị thời gian bỏn hủy cú thể kết luận rằng, sự hiện diện của chất giữ ẩm cho thấy tác dụng ổn định đối với anthocyanin chiết xuất từ hoa đậu biếc được nghiên cứu Ví dụ, khi tăng nhiệt độ từ 10 ℃ lên 33 ℃, chu kỳ bán hủy t1/2 của dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc có xu hướng giảm theo thứ tự như sau: mẫu control giảm 3.21 lần (giảm từ 122 ngày còn 38 ngày), mẫu sorbitol giảm 4.68 lần (giảm từ 187 ngày còn 40 ngày) và cuối cùng mẫu glycerol giảm 4.21 lần (giảm từ 198 ngày còn 47 ngày)
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây Kurek et al (2024) cho rằng khi bảo quản ở nhiệt độ thấp, quá trình phân hủy anthocyanin chậm lại do các hoạt động trao đổi chất và enzyme bị ức chế làm tăng thời gian bán hủy, do đó duy trì được sự ổn định theo thời gian Xu hướng tương tự cũng thu được ở nghiên cứu của Costa et al (2018), hàm lượng anthocyanin trong chiết xuất của quả sơ ri, nho, việt quất giảm theo thời gian và tốc độ phân hủy nhanh hơn khi tăng nhiệt độ Marpaung et al (2017) cũng báo cáo thời gian bán hủy của anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc giảm từ 51.7 ngày xuống 2.3 ngày khi tăng nhiệt độ bảo quản từ 45 °C lên 90 °C Mặt khác, Moldovan & David (2014) tiến hành bảo quản anthocyanin chiết xuất từ quả anh đào ở 2°C và 22°C cũng cho thấy thời gian bán hủy giảm từ 60.2 ngày còn 33.2 ngày Việc thay đổi nguồn nguyên liệu trích ly anthocyanin và thời gian bảo quản dẫn đến sự khác biệt về tốc độ phân hủy (k), thời gian bán hủy (t1/2)
Chất giữ ẩm bổ sung vào dịch chiết hoa đậu biếc có ảnh hưởng tích cực đến việc bảo quản anthocyanin Kết quả Bảng 4.8 cho thấy sự phân hủy nhanh nhất ở mẫu control và chậm nhất ở mẫu glycerol khi được bảo quản ở cùng nhiệt độ Cụ thể ở 33 °C, tốc độ phân hủy (k) thay đổi theo thứ tự từ C, S, G tương ứng với cỏc giỏ trị 18.4ì10⁻³ ngày⁻ạ, 17.4ì10⁻³ ngày⁻ạ, 14.9ì10⁻³ ngày⁻ạ cựng thời gian bỏn hủy lần lượt là 38 ngày, 40 ngày, 47 ngày Tương tự bảo quản ở nhiệt độ 25 ℃, tốc độ phõn hủy (k) là 7.9ì10⁻³ ngày⁻ạ (C25), 6.6ì10⁻³ ngày⁻ạ (S25), 6.1ì10⁻³ ngày⁻ạ (G25) cựng thời gian bỏn hủy lần lượt là 88 ngày (C25), 105 ngày (S25), 114 ngày (G25) Cuối cùng ở nhiệt độ bảo quản 10 ℃, tốc độ phân hủy của mẫu C, S, G theo thứ tự là 5.7ì10⁻³ ngày⁻ạ, 3.7ì10⁻³ ngày⁻ạ, 3.5ì10⁻³ ngày⁻ạ với thời gian bỏn hủy là 122 ngày, 187 ngày, 198 ngày Với tốc độ phân hủy thấp hơn và thời gian bán hủy dài hơn, glycerol được sử
56 dụng hiệu quả để bảo quản athocyanin trong các điều kiện khác nhau Xu hướng này cũng được báo cáo trong nghiên cứu của Kurek et al (2024) khi sử dụng glycerol làm dung môi trích ly anthocyanin Theo số liệu trình bày ở Bảng 4.8, mẫu bổ sung glycerol có tác dụng bảo vệ anthocyanin tốt hơn mẫu bổ sung sorbitol Việc bảo quản dịch chiết với sự có mặt của glycerol dẫn đến tốc độ phân hủy anthocyanin chậm hơn sorbitol lần lượt 1.16 lần ở 33 ℃ (từ 14.9×10⁻³ ngày⁻ạ (G33) lờn 17.4ì10⁻³ ngày⁻ạ (S33)), 1.08 lần ở 25 ℃ (từ 6.1ì10⁻³ ngày⁻ạ (G25) lờn 6.6ì10⁻³ ngày⁻ạ (S25)), 1.06 lần ở 10 ℃ (từ 3.5ì10⁻³ ngày⁻ạ (G10) lờn 3.7ì10⁻³ ngày⁻ạ (S10)) Thời gian bán hủy của sorbitol thấp hơn glycerol lần lượt là 1.16 lần (ở 33 ℃ tăng từ 40 ngày lên 47 ngày), 1.08 lần (ở 25 ℃ tăng từ 105 ngày lên 114 ngày), 1.06 lần (ở 10 ℃ tăng từ 187 ngày lên 198 ngày) Kết quả này chứng minh, mẫu bổ sung glycerol giúp duy trì độ ổn định anthocyanin cao nhất Glycerol rất có lợi trong việc duy trì độ ổn định của anthocyanin, điều này có thể là do cấu trúc nhóm đa hydroxyl Bản chất glycerol có độ phân cực cao và anthocyanin cũng là một nhóm flavonoid phân cực, thông qua liên kết hydro glycerol giúp duy trì độ ổn định cao hơn (Kaur & Qadri, 2024) Kết luận này hoàn toàn cùng quan điểm với Kurek et al (2024) khi sử dụng glycerol làm dung môi trích ly anthocyanin, glycerol giúp duy trì sự ổn định của anthocyanin theo thời gian và nhiệt độ Nghiên cứu của Fu et al (2022) cũng cho thấy khả năng ổn định anthocyanin khi sử dụng glycerol làm dung môi để chiết xuất và bảo quản anthocyanin từ bã việt quất
Tóm lại, thời gian bán hủy (t1/2) của các mẫu được sắp theo thứ tự như sau: G10 > S10 > C10 > G25 > S25 > C25 > G33 > S33 > C33 Trong đó, mẫu được bổ sung glycerol bảo quản ở nhiệt độ 10 ℃ cho thời gian bán hủy dài nhất (198 ngày) trong khi mẫu chuẩn bảo quản ở nhiệt độ 33 ℃ cho thời gian bán hủy ngắn nhất (38 ngày) Kết quả các thông số động học này cho thấy cùng xu hướng với sự ổn định hàm lượng anthocyanin như đã bàn luận ở phần trên
Hình 4.4 Mô hình Arrhenius ảnh hưởng của nhiệt độ lên hằng số tốc độ phân hủy
Hình 4.4 biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến hằng số tốc độ phân huỷ anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc Bảng 4.6 dưới đây trình bày năng lượng hoạt hóa (Ea) của dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc trong các điều kiện bảo quản khác nhau Theo Oancea (2021), năng lượng hoạt hóa (Ea) càng thấp thì tốc độ phản ứng (phân hủy anthocyanin) càng cao và ngược lại Giá trị năng lượng hoạt hóa (Ea) dao động từ 32.18 kJ/mol đến 43.18 kJ/mol Theo sự tìm hiểu của chúng tôi đến thời điểm hiện tại, các nghiên cứu về động học phân hủy anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc có sự khác biệt lớn về giá trị năng lượng hoạt hóa (Ea) so với nghiên cứu hiện tại cụ thể ở phạm vi nhiệt độ, phạm vi pH và các chất bảo quản nghiên cứu Theo Cheok & Ragunathan (2022), năng lượng hoạt hóa (Ea) của quá trình phân hủy anthocyanin từ dịch trích hoa đậu biếc là 26.56kJ/mol trong phạm vi nhiệt độ bảo quản từ 50 -
80 ℃, kết quả này gần bằng với kết quả nghiên cứu của Marpaung et al (2017) với giá trị Ea tại pH 3 (28.66 kJ/mol) Đa số các nghiên cứu trước đều khảo sát động học phân hủy anthocyanin từ hoa đậu biếc ở nhiệt độ cao nên kết quả trong nghiên cứu hiện tại có phần cao hơn Mặt khác, năng lượng hoạt hóa của dịch chiết anthocyanin từ quả anh đào Cornelian kết hợp chất bảo quản với phạm vi nhiệt độ từ 2 - 75 ℃ cho kết quả dao động 54.09kJ/mol đến 58.55kJ/mol (Marpaung et al., 2017)
Bảng 4.9 Năng lượng hoạt hóa (Ea) của dịch chiết anthocyanin trích ly từ hoa đậu biếc được bảo quản ở nhiệt 33 ℃, 25 ℃, 10 ℃
Chất giữ ẩm R 2 E a /R E a (kJ/mol) Control 0.8567 3870.5 32.18 Sorbitol 0.9223 5194 43.18 Glycerol 0.9281 4867.8 40.47
Kết quả Bảng 4.9 cho thấy sự ảnh hưởng của chất giữ ẩm trong quá trình bảo quản dịch trích từ hoa đậu biếc Mẫu bổ sung thêm chất giữ ẩm ít bị phân hủy anthocyanin khi tăng nhiệt độ từ 10 ℃ lên 33 ℃ Cụ thể, mẫu được bổ sung sorbitol cho giá trị Ea bằng 43.18 kJ/mol cao hơn 11 kJ/mol so với mẫu đối chứng (32.18 kJ/mol) trong khi mẫu bổ sung glycerol có giá trị
Ea bằng 40.47 kJ/mol, cao hơn 8.29 kJ/mol Từ đó cho thấy sự khác biệt giữa việc bổ sung chất giữ ẩm trong quá trình bảo quản dịch chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc trong phạm vi nhiệt độ từ 10 ℃ lên 33 ℃ Năng lượng hoạt hóa Ea càng cao biểu thị hằng số tốc độ phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Theo Cheok & Ragunathan (2022), năng lượng hoạt hóa (Ea) cao hơn cho thấy năng lượng cần thiết để bắt đầu phản ứng phân hủy cũng cao hơn, do đó anthocyanin ổn định hơn Tuy nhiên điều thú vị ở đây không có sự khác biệt rõ ràng giữa hai chất giữ ẩm được bổ sung Đầu tiên, xét về năng lượng hoạt hóa thì mẫu sorbitol có giá trị Ea bằng 43.18 kJ/mol cao hơn 2.71 kJ/mol so với mẫu glycerol 40.47 kJ/mol Mặc dù có sự khác biệt về năng lượng hoạt hóa nhưng không đáng kể vì cả hai chất giữ ẩm đều có hiệu quả tích cực đến sự ổn định anthocyanin trong quá trình bảo quản Tiếp theo, xét về thời gian bán hủy (t 1/2 ) mẫu glycerol có phần cao hơn so với mẫu sorbitol ở cả ba nhiệt độ bảo quản Cụ thể sự chênh lệch giữa glycerol và sorbitol được thể hiện như sau: ở 10 ℃ (G10 cao hơn S10 11 ngày), ở 25 ℃ (G25 cao hơn S25 9 ngày) và cuối cùng ở 33 ℃ (G33 cao hơn S33 7 ngày) Nhiệt độ càng tăng, sự chênh lệch giữa hai mẫu bổ sung chất giữ ẩm càng giảm Với thời gian bán hủy cao hơn, mẫu bổ sung glycerol giúp kéo dài thời gian bảo quản hơn mẫu bổ sung sorbitol Ngược lại với việc bổ sung chất giữ ẩm, mẫu đối chứng cho kết quả thấp đều ở năng lượng hoạt hóa và thời gian bán hủy khi tăng nhiệt độ nên điều kiện này không phù hợp để bảo quản dịch chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc